egfr基因突变检测液相芯片制作方法_余刚专利（egfr,基因突变,液相）-早鸽网

一种egfr基因突变检测液相芯片制作方法

专利名称

一种egfr基因突变检测液相芯片制作方法
发明者

余刚, 李国强, 秦会娟, 许嘉森
公开日

2011年11月9日
申请日期

2010年4月23日
优先权日

2010年4月23日
申请人

广州益善生物技术有限公司
文档编号

C12Q1/68GK102234683SQ20101016075
关键字

egfr 基因突变液相芯片检测
权利要求

1.一种EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对EGFR基因的突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ IDN0. 1 SEQ ID NO. M中的序列；所述特异性引物是针对Exon 19突变型的特异性引物，该特异性引物分别来源于SEQ NO. 26 SEQ ID NO. 44中一种以上的碱基序列，或来源于SEQN0. 73 SEQ ID NO. 96中的一种以上的碱基序列，每种特异性引物的3，端来源于相应缺失区域3’端相邻的1 6个碱基，并能特异地识别相应的突变类型，和针对 Exon 19野生型的特异性引物，该特异性引物来源于SEQ NO. 25或其反向互补序列中的碱基序列，且其3’端含有每种需检测的突变型的缺失区域中特有的缺失碱基，并其与所有突变型的特异性引物互不相同；和/或针对Exon 20、来源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46或其反向互补序列中的碱基序列；和/或针对Exon 21、来源于SEQ NO. 47-SEQ NO. 48或其互补序列中的碱基序列；针对Exon 20和Εχοη21的特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点；上述所有特异性引物的Tm值在52 58°C之间；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO. 121 SEQ ID NO. 144中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对；(C)用于分别扩增出具有Exon19,Exon 20和/或Exon 21的相应突变位点的目标序列的扩增引物2.根据权利要求1所述的EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为针对Exon 19的SEQ NO. 145 146 ；针对Exon 20，当特异性引物来源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46时，扩增引物为SEQ NO. 147 148、当特异性引物来源于SEQ NO. 45 SEQ NO. 46的反向互补序列时，扩增引物为SEQ NO. 149 150 ；针对Exon 21，当特异性引物来源于SEQ NO. 47 SEQ NO. 48时，扩增引物为SEQ NO. 151 152、当特异性引物来源于SEQ NO. 47 SEQ NO. 48的反向互补序列时，扩增引物为SEQ NO. 153 543.根据权利要求1或2所述的EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，所述针对Exon 19突变型的特异性引物，每种特异性引物的3’端来源于相应缺失区域3’端相邻的1 3 个碱基4.根据权利要求1或2所述的EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，针对Exon19 的特异性引物为SEQ NO. 50 68中的一种以上和SEQ NO. 49、或SEQ NO. 98 116中的一种以上和SEQ NO. 975.根据权利要求1或2所述的EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，针对Exon20 的特异性引物为SEQ NO. 69 70、或SEQ NO. 117 1186.根据权利要求1或2所述的EGFR基因突变检测液相芯片，其特征是，针对Exon21 的特异性引物为SEQ NO. 71 72、或SEQ NO. 119 120
技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种EGFR基因突变检测液相芯片
背景技术

专利详情
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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：一种egfr基因突变检测液相芯片的制作方法表皮生长因子受体(印idermal growth factor rec印tor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是ErbB家族的四个成员之一，因此又名HERl或ErbBl。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，这为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。目前，针对EGFR所开发的分子靶向药物主要有两类1)小分子酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，如吉非替尼(Gefitinib)和厄罗替尼(Erlotinib)，抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性；2)单克隆抗体(MAb)，如西妥昔(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)，与EGFR胞外区结合，阻断依赖于配体的EGFR活化。上述药物通过不同途径阻断EGFR介导的细胞内信号通路，从而抑制肿瘤生长、转移和血管生成，并促进肿瘤细胞凋亡，提高放化疗敏感性。研究表明，吉非替尼等针对EGFR的分子靶向药物，其疗效与EGFR基因突变的情况显著相关。迄今为止发现的EGFR基因突变90%以上位于外显子19 21。这些突变可以分为3种类型1)外显子19碱基缺失外显子19突变主要是第746 752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丢失，这一缺失改变了受体ATP结合囊(ATP-binding pocket, ABP) 的角度，从而显著增强癌细胞对吉非替尼的敏感性。研究表明，外显子19基因突变的发生率最高，占EGFR基因突变总数的50%以上。据不完全统计，目前国内外已发现的外显子19 基因突变至少有22种不同的类型。外显子19突变主要有以下缺失类型，其具体序列如表所述，其中，相对于野生型，突变型缺失的序列用“_”号表示本发明公开了一种EGFR基因突变检测液相芯片，主要包括有针对EGFR基因的突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；用于分别扩增出具有Exon 19、Exon 20和/或Exon 21的相应突变位点的目标序列的扩增引物。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的EGFR基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。

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