专利名称：沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒的制作方法在各种畜产品中，细菌性食物中毒最为常见，而由沙门氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。动物性产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜沙门氏菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门氏菌的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。沙门氏菌不仅危害人类健康，还会给畜牧业带来巨大的经济损失。由沙门氏菌引起的疾病主要分为两大类一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。 鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等污染动物性产品是引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌污染主要来源于患病的人和动物及其带菌者，主要由其粪便、尿、乳汁以及流产胎儿、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和饲料等，其中饲料和水源的污染是导致沙门氏菌传染的主要原因。畜禽感染沙门氏菌可引起相应的传染病，如猪霍乱、鸡白痢等。一般情况下，畜禽肠道带菌率比较高，当动物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，猪霍乱沙门氏菌可引起仔猪副伤寒，急性病例出现败血症变化，死亡率相当高。慢性病例产生坏死性肠炎，影响猪的生长发育。鸡白痢沙门氏菌，主要侵害雏鸡，引起败血症，可造成大批死亡。在成年母鸡则主要引起卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。 沙门氏菌引起的食物中毒一般在5-10月份最易发生。人食用沙门氏菌污染的食物后，一般 8-24h后发病，潜伏期最短2h，长者可达72h。沙门氏菌食物中毒主要有三种表现类型，即胃肠炎型、伤寒型和败血症型，以胃肠炎型最为常见。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由Τ· Notomi (Notomi Τ, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000;28(12) :63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。 近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al. Rapid diagnosis of H5N lavian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ； 141 (2) :173-80.)禾Ij M LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N, Arai R, Tada S, Taguchi H, Ogawa Y. Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ；24 (7-8) :778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)^I彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测沙门氏菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。
本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测沙门氏菌的LAMP检测专用引物。本发明所提供的用于对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的沙门氏菌的特异性保守靶序列irwA基因设计的，用以定性检测待测样品中的沙门氏菌。具体来讲，所述用于对沙门氏菌进行LAMP检测的专用引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物 2 (B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对 引物5 (LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6 (LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。所述引物组合中各引物对(FIP和BIP) (LF和LB) (F3和B3)的摩尔比为 40 20 5。本发明的第二个目的是提供一种沙门氏菌的LAMP检测方法。本发明所提供的沙门氏菌的LAMP检测方法，可包括以下步骤1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；2)反应结束后进行结果判定在反应液中添加羟基萘酚兰(HNB)，根据反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在沙门氏菌，紫色表示待测样品中不存在沙门氏菌；或者不添加HNB直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在沙门氏菌，浊度无变化表示待测样品中不存在沙门氏菌。在上述沙门氏菌的LAMP检测方法中，所述步骤1)中的待测物包括纯菌、食品、痰液、尿液和粪便等样品；所述25 μ 1 LAMP反应体系可包括待测物的基因组DNA2 μ l,20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl，10mM(NH4)2S04,0. 1 % Tween20,0. 8M 甜菜碱(betaine)， 8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为40pmol FIP 和 BIP， 20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 禾口 B3。所述步骤1)中的LAMP扩增条件可为置60-65°C恒温40-60min (优选50min)。所述步骤2)中羟基萘酚兰的添加量可为1. 25 μ 1 (终反应体系为26. 25 μ 1)，浓度为 2. 4mmol/L。本发明的第三个目的是提供一种用于对沙门氏菌进行LAMP检测的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对沙门氏菌进行LAMP检测的引物。为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为沙门氏菌的DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系(如双蒸水)。具体的，该沙门氏菌的LAMP检测试剂盒包括20mM Tris · HCl (pH 8. 8)，IOmM KCl, 10mM(NH4)2S04,0. 1% Tween20，0. 8M 甜菜碱(betaine), 8mM MgSO4,1. 4mM dNTP each, 8U Bst DNA polymerase, 40pmol FIP 和 BIP，20pmol LF 禾口 LB，5pmol F3 和 B3，羟基萘酚兰指示剂，沙门氏菌的基因组DNA(25 μ 1 LAMP反应体系中使用2 μ 1)和双蒸水。采用以上方案，本发明具有以下优点1)高特异性6条引物对沙门氏菌靶序列的8个特异区域的识别保证了 LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；2)高灵敏度灵敏度比普通PCR方法高10倍；3)结果鉴定简便可通过肉眼观察结果(HNB显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；4)操作简单只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60_65°C恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；5)快速、高效扩增整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0. 5mg/mLo综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到沙门氏菌，不需要复杂仪器，为沙门氏菌的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果图2为本发明沙门氏菌LAMP检测方法特异性的HNB染色检测结果图3为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌特异性的浊度仪检测结果图4为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法特异性的HNB染色检测结果图5为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法对沙门氏菌灵敏度的浊度仪检测结果图6为本发明沙门氏菌的LAMP检测方法灵敏度的HNB染色检测结果图7为沙门氏菌的PCR检测结果


本发明公开了沙门氏菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。所述专用引物是根据如序列表中序列1所示的沙门氏菌的特异性保守靶序列invA基因设计的，用以定性检测待测样品中的沙门氏菌。本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到沙门氏菌，不需要复杂仪器，为沙门氏菌的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测沙门氏菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。