一种用于肝组织体外循环灌流消化的实验仪器的制造方法 [0002]在对肝脏相关疾病的实验研宄中，从实验动物甚至人的肝组织中分离培养肝细胞、库普否细胞、肝星状细胞等肝组织中的细胞是必不可少的实验方法。目前从实验动物体内分离这些细胞往往采用的是原位循环(体内循环)消化的方法，具体方法是:将实验动物麻醉后，腹部消毒，打开腹腔，暴露门静脉及下腔静脉，行门静脉插管，经门静脉插管灌注平衡盐液(灌注液)，并剪开下腔静脉放血，待肝脏中血液冲净、肝脏呈黄色后停止灌注平衡盐液，开始灌注有消化作用的酶溶液(一般为胶原酶)。灌注酶溶液时，需切开胸廓，暴露心脏，剪开右心房，将一导管逆行插入腔静脉横膈上方，结扎，下腔静脉放血处用止血钳夹紧；使酶溶液从腔静脉导管流出，将腔静脉导管流出液回收进胶原酶溶液瓶，循环灌注。此外，还需尽量结扎肝与膈肌之间的侧支循环血管，以减少酶的流失。通过原位循环消化，酶溶液将肝组织内胶原组织消化，使细胞易于分散，便于细胞的分离。但这种原位循环消化方法存在以下缺点:1、实验中手术操作难度大，不易掌握；2、循环灌流过程中，部分酶溶液会经肝包膜渗出，无法经腔静脉导管回流；且肝与膈肌之间存在侧支循环血管，且有的较细，不可能将所有的侧支完全结扎，循环过程中酶溶液也会经未结扎的侧支血管流走，故这种循环方法必然有大量昂贵的消化酶损失；3、原位灌注消化后的肝包膜软化、极易破裂，一旦肝包膜破裂，则容易导致细胞损失或污染，进而导致实验失败。为了使手术操作简单化，有学者将上述方法进行了改进，改进的方法为:于下腔静脉处做一插管，待肝脏中血液冲净、换用含酶消化液进行灌注时，将下腔静脉插管接入酶溶液瓶，循环灌注。这种方法减少了一些操作步骤，适当降低了手术难度，但仍需做下腔静脉插管，且可能存在循环灌注过程中消化酶丢失更多的问题，同时，消化后的肝脏从动物体上取下时仍存在肝包膜破裂所致的细胞损失及易污染等致命缺陷。 [0003]申请号为“200410084625.7”的专利申请公开了一种“生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法”，虽然其公开了可采用体外循环的方法来分离肝细胞，但是该申请仅仅描述了提取肝细胞的方法(包括分离方法中的条件、试剂、时间、步骤等)，并未公开任何关于体外循环灌流装置的内容，因而无法在实际应用时进行实施； [0004]申请号为“01210227719.X”的专利申请公开了 “一种用于体外灌流法的重金属吸附剂及其制备方法”，虽然其也涉及“体外灌流”，但是其仅仅指全血体外灌流，目的是用于吸附血液中重金属离子，因而并不适用于分离肝组织中的各种细胞及对肝组织中各种细胞的生物学特性进行相关实验研宄。 [0005]申请号为“201410142209.1”的专利申请公开了一种“器官脱细胞循环灌流再生培养瓶”，虽然其也涉及循环灌流，但是该装置主要是用于脱细胞时去除细胞而保留器官支架(器官支架主要是一些胶原组织，实验中器官上的细胞被消化、脱落下来，留下支架)，而且其整个脱细胞过程需要3-5天，因而这些细胞脱落后已基本失活或严重受损，后期培养的成功率也极低，因而该培养瓶并不适用于分离肝组织中的各种细胞及对肝组织中各种细胞的生物学特性进行相关实验研宄。因而目前急需一种体外循环灌流实验仪器，来实现分离肝组织中的各种细胞以用于对肝组织中各种细胞的生物学特性进行相关实验研宄，根据检索， 申请人:并未发现有能解决上述问题的实验仪器公开。 实用新型内容 [0006]本实用新型的目的在于，提供一种用于肝组织体外循环灌流消化的实验仪器，它可以有效解决现有技术中存在的问题，用于快速分离肝组织中的各种细胞及实现对肝组织中各种细胞的生物学特性进行相关实验研宄。
[0007]为解决上述技术问题，本实用新型采用如下的技术方案:包括恒温箱和设于恒温箱内的灌流回路，所述的灌流回路包括:顺次连接的盛放肝组织容器、蠕动泵装置、三通管、过滤装置和无菌管道；所述的蠕动泵装置包括蠕动泵及与蠕动泵对应的柔性管道，柔性管道绕过对应的蠕动泵并且两端分别与盛放肝组织容器和三通管连通。
[0008]上述的无菌管道具有一定的硬度，并且包括粗细不等的几种型号，可用于行门静脉插管，如静脉留置针去芯、聚乙烯管、静脉输液针去针等。
[0009]本实用新型中所述的柔性管道应设计成可消毒的，因为柔性管道内流动的液体直接与肝组织接触，为保证分离到的细胞无菌，所有与肝组织接触的器皿都应是无菌的；同时该管道可重复使用，因而也有必要将其设计成可消毒的。
[0010]优选的，所述的恒温箱的温度为37?39°C，从而可以使得在含酶灌注液时使得酶的活性较高。
[0011]更优选的，所述的恒温箱的温度为37°C，从而在含酶灌注液时使得酶的活性较高(37°C为酶的最适温度)，而且长时间进行含酶灌注液时效果也不会减退；而虽然在38、39°C时酶的效率会更高，但酶在该高温下时间较长则可能会发生变性而失去活性。
[0012]优选的，所述的盛放肝组织容器的底部呈漏斗形，从而可以使得灌流消化的液体汇集后流入回流管道(即柔性管道)，实现液体的循环；所述的盛放肝组织容器内部设有一块带孔的隔板，从而可以支撑肝组织使肝组织放置在容器内又能让灌流消化肝组织的液体流出容器。
[0013]更优选的，所述的盛放肝组织容器顶端设有挂钩，无菌管道通过挂钩固定于盛放肝组织容器上，从而可以方便的实现无菌细塑料管(即无菌管道)的固定，使细塑料管(即无菌管道)与门静脉连接处不易扭转或拔脱。
[0014]本实用新型中所述的柔性管道为硅胶管，硅胶管具有弹性，因而可实现蠕动泵滚轮转动时对其进行挤压，进而使管内液体向滚轮转动的方向流动。
[0015]本实用新型中所述的三通管上设有开关，从而可以实现随时方便的更换管道中的灌注液或消化液。
[0016]与现有技术相比，本实用新型的实验仪器具有以下优点:
[0017]1、本实用新型的实验仪器可应用于肝组织中各种细胞的分离，能够通过循环消化的方式消化肝组织中的胶原组织，使细胞分散，并收集细胞用于后续培养(留下的是细胞，消化掉的是胶原)并实现对肝组织中各种细胞的生物学特性进行相关实验研宄；该装置可以在短时间内快速完成消化过程(即实现快速分离肝组织中的各种细胞，通常循环消化的时间是10?20分钟)，由于细胞是在较短的时间内分出的，因而分离出的细胞活力较高，后期培养更容易成功；
[0018]2、通过本实用新型的实验仪器，可在分离肝组织中各种细胞的实验中将常用的体内循环消化方法改为体外循环消化方法，而体外循环消化时只需行门静脉插管，不再需要结扎肝与膈肌之间的侧支循环血管，从而大大降低了实验操作的难度，缩短了实验周期；
[0019]3、利用该实验仪器分离肝组织中各种细胞的实验操作更简单，成功率更高，同时缩短了实验周期；
[0020]4、通过本实用新型的仪器进行肝组织的体外循环消化时，含酶的消化液是经肝包膜渗出或肝静脉及其分支等血管残端流出，而流出后全部经柔性管道回流，不存在消化酶的损失现象(而体内循环，则存在部分酶经肝包膜渗出或经未结扎的分支流走而没有被全部收回，使得酶溶液大量损失)；同时采用循环的方式进行消化时酶可以反复利用(并非像体内灌流一样流入肝脏后就流走)，因而可大大节约酶的用量，降低实验成本；
[0021]5、本实用新型应用简单但特别的器材(应用一些现有材料进行巧妙组合，如:带开关的三通管放置在循环回路中便可轻易更换管道中的灌注液或消化液；回路中设置过滤装置便可过滤掉灌流消化过程中的红细胞或组织碎肩，避免这些红细胞或组织碎肩聚集在肝组织中影响消化效果。另外，通过在盛放肝组织容器内设置一带孔的隔板，即可支撑肝组织使肝组织放置在容器内又能让灌流消化肝组织的液体流出容器；通过将盛放肝组织容器的底部设置成漏斗形便可使灌流消化的液体汇集后流入回流管道(即柔性管道)，即可实现液体的循环；盛放肝组织容器的顶端通过设置挂钩便可方便的实现无菌细塑料管(即无菌管道)的固定，使细塑料管(即无菌管道)与门静脉连接处不易扭转或拔脱)相互组合构成一个方便、高效的实验仪器，该仪器能够大大降低实验操作难度，从而缩短实验时间、提高细胞活力，且能降低酶的用量，从而降低实验成本(酶的价格非常昂贵)。
[0022]6、本实用新型的实验仪器可实现体外消化(没有该仪器则只能进行体内消化)，以体外消化方式进行消化时，先将肝脏分离于动物体，再在该实验仪器内进行消化；未经消化的肝脏组织相对较硬，容易从动物体上分离，肝包膜不易破裂，所以相对于体内消化更能有效的避免细胞损失及污染。




[0023]图1是本实用新型的一种实施例的结构示意图。
[0024]附图标记:1-恒温箱，2-盛放肝组织容器，3-蠕动泵，4-蠕动泵装置，5-三通管，6-过滤装置，7-无菌管道，8-隔板，9-挂钩，10-开关，11-柔性管道。
[0025]下面结合附图和

【具体实施方式】
[0026]本实用新型的实施例:一种用于肝组织体外循环灌流消化的实验仪器，如图1所示，包括恒温箱I和设于恒温箱I内的灌流回路，所述的灌流回路包括:顺次连接的盛放肝组织容器2、蠕动泵装置4、三通管5、过滤装置6和无菌管道7 ;所述的蠕动泵装置4包括蠕动泵3及与蠕动泵3对应的柔性管道11，柔性管道11绕过对应的蠕动泵3并且两端分别与盛放肝组织容器2和三通管5连通。所述的恒温箱I的温度为37°C。所述的盛放肝组织容器2的底部呈漏斗形，且其内部设有一块带孔的隔板8。所述的盛放肝组织容器2顶端设有挂钩9，无菌管道7通过挂钩9固定于盛放肝组织容器2上。所述的柔性管道11为硅胶管。所述的三通管5上设有开关10。这里的温度需实验者根据具体实验情况来调控。其中，为保证分离到的细胞无菌，则要求盛放肝组织容器2、柔性管道11、三通管5、过滤装置6和无菌管道7在使用时是无菌的。
[0027]工作原理:恒温箱I为肝组织的循环灌流、消化提供适宜的温度环境，该恒温箱I的温度可调，且其余部件均位于该恒温箱I内，当将恒温箱I调至合适温度(在灌注平衡盐液时，通常置于室温下，相对低温下可通常可设置在37°C，但如果灌注得比较好时(肝脏中血液冲得非常干净)也可选择38°C或39°C，但与此同时缩短循环消化的时间)，整个系统将在这个温度下工作；盛放肝组织容器2的设计为底部呈漏斗形，内部设有一块带孔的隔板8，当将有一定硬度的无菌管道7插入肝门静脉结扎固定，并把肝组织连同有一定硬度的无菌管道7从动物体上分离后，置于该容器中进行循环灌流、消化时，带孔的隔板8可以支撑肝组织，而进入肝组织的灌流液或消化液流经肝组织后又可经隔板8上的小孔漏下并经漏斗形底汇集，再流入可消毒的蠕动泵装置4中的柔性管道11内，消化酶得以循环利用(其它方法均会导致昂贵的消化酶大量流失)；可消毒的柔性管道11绕过对应的蠕动泵3，并且一端连通盛放肝组织容器2的底部，另一端与三通管5连通，然后三通管5、过滤装置6和有一定硬度的无菌管道7顺次连接。这样的设计可使在循环灌流的过程中灌流液或消化液从肝组织流出后于盛放肝组织容器2中汇集，由蠕动泵3提供动力回流经过可消毒的柔性管道11、三通管5、过滤装置6，最后经有一定硬度的无菌管道7流进肝门静脉，从而实现了循环灌注或循环消化。回路上的三通管5上设有开关，当实验过程中需要放掉可消毒的柔性管道11中的液体时，打开三通管5的开关10，即可放掉液体。另外，如需将循环时的灌注液换成含酶消化液时，只需打开三通开关10，放掉灌注液，再在盛放肝组织容器2中加入含酶消化液即可。回路上的过滤装置6可有效阻挡循环灌流过程中流出的红细胞及消化过程中出现的组织碎肩，避免了红细胞或组织碎肩堵塞肝组织内细小管道，从而提高了循环消化的效率。该仪器中配备的有一定硬度的无菌管道7分粗细多种型号，具体实验中可根据所取肝组织的动物种类(或人)及大小不同选择相应的型号，以便能够行肝门静脉插管或部分肝组织的残存血管插管(如对手术切除的病人的部分肝组织进行细胞分离时，需要将细塑料管插入残存血管来实现循环灌流消化)。
[0028]蠕动泵装置4的工作原理:蠕动泵装置4中的蠕动泵3的圆形滚轮在转动的过程中对弹性输送软管(即柔性管道11)交替进行挤压和释放管内流体(就像用两根手指夹挤软管一样，随着手指的移动，管内形成负压，液体随之流动)，从而使管内液体向滚轮转动的方向流动。