专利名称：在无机硅材料表面共图案化固定生物大分子的方法 细胞的选择性粘附和定向诱导在生物传感器、组织工程以及细胞生物学基础研究等领域具有重要应用价值，图案化固定利于和不利于细胞粘附的生物大分子可以有效实现细胞定位和诱导生长。有多种技术可以实现生物大分子的图案化固定，包括光刻、微接触印刷以及机械微点样技术等。微接触印刷技术能够在金、玻璃、硅以及聚合物等表面以物理吸附的方式实现生物大分子的图案化固定，但存在易脱附和寿命短的缺点，在细胞培养中易被细胞分泌蛋白取代，使其定位效果受到影响。如何实现生物大分子的牢固性固定和细胞的精确定位，成为当前急需要解决的问题之一。通过共价键合的方式共图案化固定两种对细胞粘附具有相反影响的生物大分子，可以实现细胞更长期、更精确的定位和诱导。连续反应性微印刷技术可以把多种生物大分子共图案化键合于同一表面，但存在要么图案对比度低，要么容易污染，且难以形成互补图案的缺点(细胞精确定位所需要的共图案)。
本发明的目的是提供一种操作工艺简单，能够实现上述要求的在无机硅材料表面共图案化固定生物大分子的方法。本发明的方法包括以下步骤1)将无机硅材料表面胺基化后进行醛基化处理产生活泼自由醛基；2)在醛基化无机硅材料表面用具有特征表面拓扑结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)印章反应性微接触印刷生物大分子形成微图案，反应温度为4～50℃，所用压力为50～300g/cm2，时间0.1～5小时；3)在已图案化固定了一种生物大分子的无机硅材料表面滴加另一种生物大分子的0.1～20mg/ml的溶液进一步反应0.1～5小时，使后者固定在前者未覆盖的区域，反应温度为4-50℃；4)反应后的无机硅材料表面用后一种生物大分子相应pH值的缓冲液或水溶液冲洗并超声波清洗1～20分钟，即得两种生物大分子在同一表面的共图案化固定。本发明中，所用的无机硅材料是指载玻片、石英、硅，或是表面含有或能产生硅羟基(Si-OH)的其它材料。本发明中，所述的生物大分子是指蛋白类生物大分子及其衍生物，如白蛋白、纤连蛋白、多聚赖氨酸、明胶、胶原以及多糖类生物大分子如壳聚糖等。步骤3)所说的生物大分子溶液是指其相应pH值的缓冲液溶液或水溶液，如白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液、明胶的PBS溶液，胶原或壳聚糖的0.3％的乙酸溶液等。本发明中所用的PDMS印章是先通过常规的“光刻”技术构建一个含有微米级微井(或突起柱)的底模，再在此底模表面浇注PDMS预聚物，加热交联固化后揭起制得的，其表面含有与底模表面相反的微米级突起柱(或微井)，一般光刻条件均可实现。
本发明中所说的胺基化是指将无机硅材料在H2SO4/H2O2混合液中浸泡5～60分钟，所用的混合液中浓硫酸和双氧水的体积比为1∶9～9∶1；然后用去离子水冲洗，再浸入按体积比浓度为0.1～10％的胺基烷氧基硅烷的95％乙醇溶液中，调节pH值为1～6，在0～50℃温度下反应0.5～24小时，超声波下95％乙醇清洗1～10分钟，超声波下去离子水清洗1～10分钟，80～120℃下烘0.1～2小时。醛基化是指把胺基化后的无机硅材料置于0.1～10％的戊二醛溶液中，在0～50℃温度下反应0.1～1小时，水洗若干次，即得醛基化无机硅材料表面。
本发明可采用激光共聚焦显微镜(CLSM)验证固定的生物大分子共图案的存在。为便于观察，所用两种生物大分子分别用不同的荧光染料标记，用相应波长的激发光激发即可以得到各自独立的、互补的图案。两图案复合后即得共图案照片。
本发明中，共图案的质量可以通过两种生物大分子固定的先后顺序、反应时间、温度，以及超声波清洗时间来控制。
本发明工艺简单，可控性和重复性好，反应条件温和。所得共图案均具有较高对比度和牢固度，是一种简单不贵的共图案化固定两种生物大分子的有效方法。本发明方法适用于两种生物大分子的共图案化牢固性固定。在细胞选择性粘附和定向诱导，基于细胞的生物器件制作及组织工程等领域具有良好的应用前景。


图1是无机硅材料表面胺基化、醛基化流程图。
图2是在微接触印刷生物大分子时所用PDMS印章的原子力显微镜照片。其中(a)为表面含突起柱的正相印章，(b)为表面含有微井的反相印章。
图3是在醛基化载玻片表面先用正相PDMS印章微印壳聚糖，再滴加白蛋白溶液反应而制得的壳聚糖/白蛋白CLSM图像。其中浅色的连续相为白蛋白图案，深色的分散相为壳聚糖图案。
图4是在共图案化固定的壳聚糖/白蛋白CLSM图像中自蛋白的荧光强度分析。其中(a)为在醛基化载玻片表面的，(b)为在空白对照载玻片表面的(无活泼醛基)。
图5是在醛基载玻片表面先用反相PDMS印章微印白蛋白，再滴加壳聚糖溶液反应而制得的白蛋白/壳聚糖CLSM照片。其中浅色的连续相为白蛋白图案，深色的分散相为壳聚糖图案。
图6是在醛基化载玻片表面先用正相PDMS印章微印明胶，再滴加白蛋白溶液反应而制得的明胶/白蛋白CLSM图像。其中浅色的连续相为白蛋白图案，深色的分散相为明胶图案。

以下以实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1制备表面含有微井的PDMS印章先用常规“光刻”技术制备一原始底模，即在一块干净的3×3cm2的载玻片表面以2000转/分钟的速度旋涂BP218紫外正型光刻胶，随后置于90℃的烘箱中烘30分钟，再在1000瓦的紫外灯、光掩模下旋转曝光150秒，然后于2％的NaOH溶液显影45秒，注意显影的均匀性。因所用光掩模含有微阵列的通孔，制得的底模表面即含有相应的微阵列的微井。在此原始底模表面浇注PDMS预聚物，该预聚物已添加质量比10∶1的交联剂。60℃烘箱中交联固化12小时后即制得正相PDMS印章，其表面含有的对应尺寸的阵列突起柱可用原子力显微镜观察到(见图2a)。用刀片把PDMS印章切成1×1cm2的小块备用。
载玻片表面胺基化和醛基化将载玻片在H2SO4/H2O2混合液(浓硫酸和双氧水的体积比为7∶3)中浸泡一小时，然后去离子水冲洗，浸入体积比浓度为1.5％胺丙基三乙氧基硅烷的95％乙醇溶液中，冰醋酸调节pH值至4，室温下处理两小时，超声波下95％乙醇清洗，超声波下去离子水清洗，115℃下烘1小时以使其完成胺基化反应。接触角测量发现，干净的载波片静态接触角为3.8°左右，而硅烷化后的载波片为59°，这正是碳三短链的典型接触角值，说明胺丙基三乙氧基硅烷已被接枝到载玻片表面。再在37℃下把氨基化的载波片置于1％的戊二醛水溶液中30分钟，水洗两次，即得到醛基化载波片。
将正相PDMS印章用0.3％乙酸溶液超声波清洗10分钟，氮气吹干，涂上一层罗丹明标记的壳聚糖的2mg/ml的0.3％的乙酸溶液，静置10分钟后氮气吹干，室温、200g/cm2压力下在醛基化的载玻片表面压印10分钟。揭起，0.3％的乙酸溶液冲洗，CLSM观察，即见清晰的分散的壳聚糖图案(图3深色部分)。在有分散的壳聚糖图案的载玻片表面滴加一滴异硫氰酸荧光素(FITC)标记的1mg/ml白蛋白的PBS溶液使之完全覆盖原图案，静置1小时后用大量PBS冲洗3次，再在PBS中超声波振动10分钟。CLSM下观察，即见壳聚糖和白蛋白的共图案(图3)。两者之间界限分明，证明在壳聚糖(深色分散图案)预先占领的部分，白蛋白(浅色连续图案)没有附着。
实例2其它条件同实例1，但制备PDMS印章时，所用光掩模含有微阵列的盲孔，因而最终得到了表面含有微井PDMS反相印章(图2b)。先用此印章微接触印刷白蛋白，再滴加壳聚糖溶液反应而得到白蛋白/壳聚糖共图案，CLSM观察发现分散的壳聚糖图案(深色)强烈而模糊，连续的白蛋白图案(浅色)也不清晰(图5)，说明这种共图案化顺序是不恰当的。
实例3其它条件同实例1，但醛基化载玻片换成仅用H2SO4∶H2O2(7∶3 V/V)处理的空白载玻片(无胺基化和醛基化)。在超声处理以前，显微镜下也可以见到较清晰的壳聚糖分散图案及一层白蛋白，这是生物大分子在载波片表面吸附的结果。超声10分钟以后，图案变得相当暗淡，用CLSM观察发现，空白载玻片表面白蛋白图案的荧光强度(图4b)只是实例1中醛基化载波片表面白蛋白图案荧光强度(图4a)的三分之一至四分之一，证明生物大分子在醛基化后的载玻片表面是通过牢固的化学键接枝上去的。
实例4其它条件同例1，但把壳聚糖换成明胶，相应溶剂为PBS缓冲液。得到类似的共图案化结果，其中浅色的连续相为白蛋白图案，深色的分散相为明胶图案。(图6)。


本发明公开了一种在无机硅材料表面共图案化固定生物大分子的方法。它包括以下步骤1)无机硅材料表面胺基化后进行醛基化处理；2)在醛基化的无机硅材料表面用聚二甲基硅氧烷印章微接触印刷生物大分子形成微图案；3)在已图案化固定了一种生物大分子的无机硅材料表面滴加另一种生物大分子的溶液，使后者固定在前者未覆盖的区域；4)冲洗及超声波清洗，即得两种生物大分子在同一表面的共图案化固定。本发明方法操作工艺简单，可控性和重复性好，反应条件温和。所得共图案具有较高对比度和牢固度，是一种简单廉价的共图案化固定两种生物大分子的有效方法。本发明方法适用于两种生物大分子的共图案化牢固性固定。在细胞选择性粘附和定向诱导，基于细胞的生物器件制作及组织工程等领域具有良好的应用前景。