专利名称：通过减少净化血液或骨髓中的一些细胞群的系统的制作方法通过减少净化血液或骨髓中的一些细胞群的系统相关申请本申请要求美国临时申请序列号61/315，109，提交日20年3月18日以及美国临时申请序列号61/436，964，提交日21年I月27号的优先权。这些临时申请所披露的全文内容被纳入本文。本发明涉及细胞分离系统，特别是涉及用于从常规血液、胎盘/脐带血、骨髓或曾经从脂肪组织分离的间质血管部分(stromal vascular fraction) (SVF)细胞中减少 (depleting) 一些血液成分的系统。发明背景正常人体血液通常包括血小板(“PLTs”)、血浆、红细胞(“RBCs”)、白细胞 (“WBCs”)，以及，非常少量的干细胞和祖细胞(SPCs)。平均的(因人而异，且随着时间的推移，同体也不同)RBCs组成个体的血细胞总数的约99. 9%,占个体总血体积量的约45%。 RBCs具有非常重要的功能，其是输送氧气到身体组织的主要装置。几乎所有的个人的血液体积的其余部分包括血浆、非细胞的液体组分，以及占血液总体积的约55%，并且所有的血细胞悬浮在其中。因此，超过99体积％的常规血液是由血浆和RBCs组成。剩余的约〈O. 6体积％的正常血由所有其他血细胞类型和PLTs组成。PLTs是小的、形状不规则的无核细胞，其在数目上多于WBCs，系数为 10。PLTs在伤口护理中发挥着重要作用，可以止血和释放大量的生长因子以修复和再生受损组织。其次最普遍的血细胞是WBCs，在典型的血样中，其数目只有约I %细胞总数的十分之一。然而，WBCs是人体的免疫系统的关键，保护身体免受传染病和异物侵袭。WBCs可以进一步划分为更小的子群。最大的这样的子群是粒细胞(GRNs)，约占所有WBCs的60%，其他的约40%是单核细胞(MNCs)。在整个本申请中，使用术语WBC可能专指GRNs，专指MNCs， 或两者的某种组合。MNCs可以进一步细分成淋巴细胞和单核细胞，但由于在每个细胞的单轮核 (single round nucleus)的存在,可被统称为MNCs。MNCs是免疫系统的关键元素,其包括 T细胞、B细胞和NK细胞，其迁移到身体组织的感染处，然后分裂和分化成巨噬细胞和树突状细胞，以诱发免疫反应。最后，MNCs自己可以进一步划分成更小的子类-包括极少量的多能造血(造血)干细胞和祖细胞以及间充质(骨、脂肪、软骨、肌肉和皮肤形成)干细胞和祖细胞(mesenchymal (bone, fat, cartilage, muscle and skin forming) stem andprogenitor cells)，都对人体健康起关键作用。MNCs的另外来源是间质血管部分细胞(SVFCs)，其已从在吸脂过程期间从个人移去的脂肪细胞中分离。
在业界，每年抽取超过25百万次常规血样、胎盘/脐带血样或骨髓样品。由于样品通常是作为治疗疾病的研究的一部分，或用于直接的临床治疗，最经常分离的血细胞是WBCs，其次是MNCs。MNCs包括所有的干细胞和祖细胞，及约40%的极为重要的免疫细胞。 因此，大多数情况下，所需要的细胞只是针对典型样品抽取的细胞的非常小的部分。
因此，如果需要相对纯化的细胞群，该细胞群含有基本上所有的干细胞和祖细胞 (SPCs)且减少基本上所有的RBC，有必要分离上述血液或骨髓的成分，以便分离出WBCsjn 果需要更高的纯度，分离出MNCs。由于研究、临床试验以及保健医疗实践对SPC的需求不断增长，特别迫切需要一致的、有效的工艺来分离这些细胞群以及收集靶细胞。
对SPCs的兴趣和研究是惊人的。截至20年11月，全球已发表超过100，800干细胞的研究论文。目前全世界有至少7000名基础研究人员集中研究SPCs。仅在美国，有大约 300个干细胞研究中心，以及约10000个个人实验室。作为这种广泛研究的结果，有199个临床试验中使用脐带血造血干细胞,34个临床试验中使用脂肪组织和1405个使用骨髓干细胞的临床试验目前正在进行，其根据clinicaltrials. gov,美国国立卫生研究院的网站 (NIHwebsite)。
相关技术详述
从全血或骨髓吸出物样品(aspirate sample)中分离和收集一些类型的细胞的常规方法，一般涉及对样品离心。在离心过程中，根据它们的密度，细胞群倾向于迁移到沿轴线上从小到大加速度的相对位置，并且分层富集，在该过程中，置换其他更高和更低的密度类型的细胞和血浆。
图I示出在人的血液中发现的各种细胞类型的密度和平均直径。当血液离心时， 不同类型的细胞之间的物理差异是很重要的。当血液离心时，细胞开始以根据许多流体动力学因素、包括Stokes定律、的速度移动到新的位置。事实上，所有的细胞保持轻微的负电荷阻碍细胞膜与细胞膜的直接接触。在主要包括血浆和相对较少的细胞的环境中，较大的细胞会更迅速地移动。然而，当细胞的浓度上升时，细胞电荷(cell charge)的效应开始主要决定细胞速度。
然而，在所有的情况下，密度越大的细胞，其最终将迁移和停留在容器的越低的位置(即，越远离离心机的旋转轴线)。因此，如图2所示，密度最大的细胞，RBCs(具有的密度在I. 08和I. 12之间)，将迁移到离心分离的容器的底部。在RBC层内的有核红细胞 (其存在于脐带血和骨髓中，但不存在于常规血液中)将在红细胞部分的顶部。在RBCs的顶部是GRNs (密度1.07-1. 11)，然后，以靠近容器中的旋转轴线的顺序，淋巴细胞(密度 I. 05-1. 09)、单核细胞(密度 I. 045-1. 0750)和 PLTs (I. 03-1. 065)。已知 SPCs 最接近单核细胞和淋巴细胞的密度，从而如果更大量的这些细胞被捕获，就可捕获SPC。通过利用在一定的条件下形成的公知层，可以通过仅收集该层而促进收集这种类型的细胞。图2还示出常规血、脐带血和骨髓的典型样品中的血细胞类型的相对频度，并最后，表明通过密度组织的细胞群中有些重叠，如下面将要讨论的那样。
虽然在进行细胞分层时，一般只需要施加高的G力超过设定的时间，但是精确地移出特定的细胞层是有问题的。为了说明给定样品中的一些细胞种群的稀有和体积小，图3、4和5详细示出了离心和分层后，每个细胞种群在正常血(NB)、脐带血(CB)和骨髓(BM) 中各自的平均体积。
图3和图4示出，基本上大多数的细胞是RBCs，而图5清楚地示出非RBC血液细胞成分的体积是如此之小，即使在200毫升的脐带血样品中，所有GRNs (上线)、MNCs (中间CN 102946890 A书明说3/16 页线)和PLTs (下线)的总体积大约是I毫升。在脐带血中，每1000个血细胞(细胞总数的约O. 08% )不到I个MNC。在包含lOOOORBCs的脐带血样中，预期可以找到40_200PLTs、 3-6MNCs和5-10粒细胞。
正如所说明的那样，大多数血液的大部分、按细胞数以及按体积计、是由WBCs 以外的细胞组成。由于这些WBCs的稀缺性和其在充斥大量的RBCs的溶液中滞留 (residence),目前的分离WBCs的方法是(A)劳动和时间密集的，需要优秀的实验室技术， (B)通常不能在无菌的环境中完成，(C)通常WBCs捕获效率只有50-75% (25%至50%的 WBCs损失)，和(D)涉及可能会不利地影响细胞功能的过程。鉴于典型的血样的小尺寸和在常规血中SPCs是极其罕见的事实，在常规血液的典型的WBCs收集中有可能根本没有SPCs， 并且，虽然在脐带血中比在常规血中有更大量的SPCs，他们在脐带血中仍然是罕见的。
为了进一步说明从常规血液中收集WBCs是多么困难，图6是在传统手动血液成分分离方法中通常使用的50毫升试管的示意图。这些管子通常是宽28毫米。离心后，分离的血液成分是血浆(顶部)和RBCs (底部)和在两者之间的几乎看不见的薄层被称为“血沉棕黄层”(为了说明的目的在图6中放大尺寸)。该“血沉棕黄层”包含几乎所有的WBCs、 SPCs 和 PLTs0
虽然有几个从全血收集WBCs的半自动化系统目前正在市场上销售，其细胞回收效率相对手动方法的优势是不显著的，且其市场占有率小。目前流行的在血液或骨髓样品中分离和捕捉WBCs的方法，采用两种人工处理技术(A)密度梯度颗粒的方法和(B)密度梯度盘方法·。对于诊断或研究的目的，据估计，WBCs从血液或骨髓中分离时，99%使用这些技术分离。通常都利用圆筒形试管，和都依靠小心谨慎的密度操作。例如，如果目标是分离MNCs，成千上万的微小颗粒或密度约1.08的盘(直径略小于试管的内径)放置在管内。 选择这个特定的密度值，因为它与GRNs和淋巴细胞密度中位数相当(itis equidistant between the median densities of GRNs and lymphocytes)(见图 2)。为了正常工作，这两种技术都需要将血样先用2 4倍的血液体积的缓冲剂稀释。
首先，参考颗粒法，在试管中混合缓冲的血样和颗粒后，启动离心。在离心过程中， 颗粒的密度使它们聚结，并从MNCs/PLTs分开RBC/GRNs。图7说明了使用Ficoll密度梯度颗粒从RBCs/GRNs分开MNCs的过程。
采用密度梯度盘的方法是非常相似的，并示于图8。这里，密度I. 08的盘在离心作用下迁移到淋巴细胞和GRN之间的界面。然而，大多数的密度梯度盘包含一项上述的颗粒没有的功能它们包括上部和下部的盘之间的空腔，预期MNCs将停留，通过行进在空腔和试管顶部之间的柔性导管，在一定程度上简化收集MNCs的步骤。
这些从血样中分离和捕捉MNCs的人工方法需要耐心和出色的手动熟练度。这些方法通常需要I. 5到2个小时来执行，即使有最丰富的经验，回收的MNCs往往小于60%。 因此，该通常使用的从血样分离和捕捉MNCs的手动方法在精度和速度方面不是最佳的，因为这项技术中存在许多限制。
首先，通过仅依赖一个物理因子-密度，用密度梯度溶液从血液或骨髓中分离 WBCs群。一旦离心分离开始，密度梯度介质移动到一个位置，在该位置处它悬浮在细胞溶液中且停止在那里。通常情况下，细胞群到它们的最终位置的迁移发生在加速和持续期间，其中这两者都是固定的，所以对单个血样而言极少到达最优。12CN 102946890 A书明说4/16 页
基本上这两种密度梯度技术收集WBC或MNC的效率受限于将定位空隙中心处的目标，所述空隙位于粒细胞和淋巴细胞的中位数密度钟形曲线之间(即，I. 08)，如上面提到的图2。正如图2阐明，这个固定的密度显然不排空所有的粒细胞，或甚至所有的RBCs，并其实上，丢弃了一些所需的细胞。
这种简单化的方法也并不容纳以下事实，即使对正常健康的人，每种类型细胞的数量和密度也存在显著的不同，样品之间的沉积速率的不同可能高达数量级。另外，如果病人有一些疾病，细胞群的相对比例的不同和细胞沉积速率的变化可能 大得多，达到两个数量级。因此，这些原始WBC或MNC分离技术对任何特定的血样很少是最佳的。
预想这种限制的严重程度的最好方法是了解，血样细胞，其在离心之前是均匀地分布在整个体积中，在离心开始时竞相奔向新的位置。这种WBC或MNC分离技术的效率取决于所有的WBCs最终多么精确地处于同一层一以及技术人员多么彻底地从这个位置用移液管在正常的IG条件下提取WBCs，此时，容器的仅仅丝毫的移动，或者移液管尖端丝毫的移动，细胞就会开始再混合。
科学家们早就研究了 IG条件下，RBCs从常规血液向容器下端迁移的速率。这种测量被称为红细胞沉降率，或ESR。虽然在常规的MNC分离工艺中使用的离心加速加速该沉积速率，它们不会改变不同细胞类型的沉积速率的变化百分比。此外，由于RBCs超过 WBCs 1000倍多，和超过MNCs2000倍多，且所有的细胞保持轻微的负电荷，RBC的迁移，对分离WBC群最有影响。
图9示出了不同年龄的成年人的ESR(以毫米每小时为单位测量，mm/hour)。在儿童中，已发现在出生时常规ESR值是I至2毫米/小时，分娩后8天上升到4毫米/小时， 然后第14天至17毫米/小时(在不到两个星期就有超过数量级的变化)。ESR是可变的， 这种性质可以用来诊断恶性的疾病，如，多骨髓瘤，各种自身免疫疾病，如类风湿关节炎，慢性肾脏疾病，其中ESR可能会超过100毫米/小时，5倍于正常的成人。
另外，应当指出，作为浮起在被沉降的RBCs置换的向上升起的血浆上的结果， WBCs只能从容器的底部向上移动，加入从所述容器的顶部沉降的那些中。需要注意的是，溶液中极少数的WBCs在向上流动时必须与相对的RBCs流较劲，其数千倍于WBCs，以及经过相同的垂直通道沿相反的方向移动。另外，由于在运行开始时，启动离心机的加速和持续的程度，满足特定样品内所有细胞再定位的持续时间，对许多其它的血样来说可能是不充足的， 因为大部分的RBCs可能没有到达试管的底部，并因此许多目标WBCs可能还没有通过上升的血浆浮起至“血沉棕黄层”。由于这个过程发生在封闭的离心机的快速转动的离心头内， 操作者无法观察细胞的实际运动。
因此，需要一种系统，它可以实时的光学跟踪在离心过程中每个单独血样内部细胞群的迁移。根据构成该血样的细胞群的特定大小和密度，这样的系统将允许对每个单独的血样进行定制处理。这种改进的解决方案还应该大大提高目标WBC或MNC细胞群的收集效率。
密度梯度介质的另外缺点是，它们需要缓冲剂，其占据给定收集管的大部分体积， 最小化从中收集WBCs的血液体积。缓冲剂通常占典型的50毫升体积收集管的70 %至 90%，留出只有5至15毫升的血液空间。因此，技术人员需要从100毫升血液中收集WBCs， 必须采用7 20个试管-进一步增加完成目标需要的劳动力。另外，为了从最终的WBC群13CN 102946890 A书明说5/16 页中除去污染物，达到足够的纯度，颗粒密度梯度介质和缓冲剂需要洗干净，不可避免地导致革巴细胞的进一步损失。
因此，需要有一种装置，其用于从血液或骨髓的样品减少不需要的细胞，它不需要体积大的密度梯度介质或缓冲剂。该装置可任选地允许从较大体积样品收集WBCs，进一步增加构成成分细胞的数目，该构成成分细胞可以被回收用于诊断或临床使用。
如上所述的基于密度梯度的血液分离方法的第三个缺点是，密度梯度收集管的平行的垂直壁不会在分离期间辅助WBCs上升到RBCs之上。在传统的系统中，密度梯度收集管有垂直的平行壁，这意味着，在离心过程中，所有的细胞垂直地沿着管的轴线下降或上升。 如上所述，每个上升的WBC必须和几千个在相反的方向移动的RBCs较劲。收集试管的平行的垂直壁不会对下降的RBCs和上升WBCs提供侧向的移动，可以辅助离心过程中的WBCs上升。作为结果，在所选择的离心方案期间，在试管底部开始旋转循环(spin cycle)的显著量的WBCs可能不会上升到收集的“血沉棕黄层”。
因此，有必要通过利用基本上在底部狭窄的漏斗形的收集室，使得大部分下降的 RBCs迫向中心，增强由上升到RBC体积顶部的最轻的RBCs导致的涡流而克服试管底部的 WBCs滞留。反过来，这些涡流辅助数量上少得多的但更轻快的WBCs的上升。
基于密度梯度分离方法的第四个缺点是在IG时手动收集MNCs位置，密度梯度收集试管的恒定的大的横截面面积。
由于标准的50毫升密度梯度收集管的壁固定相隔 28毫米，来自10毫升外围血样( O. 028毫升)的体积非常小的MNCs是遍布试管的整个横截面面积( 615平方毫米)的，其形成几乎看不见的薄层( O. 023毫米)。由于这种宽截面面积和由此形成的 MNCs薄层，细胞群之间的密度差异的分层效果是微乎其微的。因此，在IG时收集MNCs需要训练有素的技术人员来缓慢地并小心地将移液管尖端插入到这种非常薄的在密度梯度 (下方)和血浆(上方)之间浮动的细胞层中，然后轻轻地应用吸力将MNCs拖曳上升至移液管中。然而，在不使用巨大的离心力放大时，细胞群之间非常小的密度差异，以及大的试管截面积一起导致MNCs/PLTs基本上保持在相同的薄的垂直层中。因此，在这种手动的吸入过程没有更多的关注以防止MNC/PLT层以及密度梯度介质的搅动继而至使MNCs损失和密度梯度颗粒导致重大细胞污染。因此，在此过程中失去约25 %至40 %的MNCs并不少见。
因此，有必要通过具有狭窄的横截面面积的漏斗出口以避免由减少RBCs和大部分的GRNs收集MNCs期间的损失，实质上的离心保持了细胞层的完整性和纯度并由于其在锥形漏斗中下降而在垂直方向拉长细胞层。
常规的密度梯度颗粒基的系统的第五个缺点是由于密度梯度颗粒和细胞之间的直接接触。已报道，由于毒性，这些颗粒和要收集的细胞之间广泛的直接接触会损伤细胞的功能。例如，Yuhan Chang 等人最近报道的 “TheEfficiency of Percoll and Ficoll Density Gradient Media in the Isolation ofMarrow Derived Human Mesenchymal Stem Cells with OsteogenicPotential，，(Chang Gung Med J 2009; 32:264-75)，当对 CFU-Fs (passage one)进行细胞毒性测试，该测试通过用控制介质和Percoll或Ficoll的混合物的系列稀释液培养来评估这两种梯度介质的生长抑制或细胞毒性效应，在两组测试中，随着梯度介质的比率的增加，CFU-Fs表现出更多的细胞死亡。
因此，有必要在不需要添加可能会改变或破坏细胞的功能的密度梯度颗粒或其他14异物的情况下而减少掉RBCs，或RBCs和GRNs，或RBCs、GRNs和PLTs，或RBCs、GRNs和MNCs。
常规的有或没有密度梯度颗粒的血液分离方法的第六个缺点是，由于技术人员的能力差异和在IG时，易于无意中再混合细胞，显著量的RBCs可能会保留在最终产物中。最近的一些研究强调了 RBC污染最小化的重要性，因为这种污染减小使用这些MNCs药物的疗效。
这些RBC污染的不利影响的例子比比皆是，例如参见“Red Blood CelIContamination of the Final Cell Product Impairs the Efficacy of AutologousBone Marrow Mononuclear Cell Therapy，，，Assmus et al·，Journal of theAmerican College of Cardiology, 55. 13，20，其中公开了 RBCs 污染影响分离的BMCs的功能，并决定冠脉内BMC输注后的急性心肌梗死患者左室射血分数恢复的程度。也参见，“Packed Red Blood Cells Suppress T-CeIIProIiferation Through a Process Involving CelI-CelI Contact，，，Bernard et al. , TheJournal of Trauma, Injury, Infection, and Critical Care, 69. 2, Aug. 20,其中公开了储存的 RBCs 产生对T-细胞增殖的强烈抑制效果，很可能输血后在体内发生类似的T-细胞增殖的抑制，其和输血相关的免疫调节有重要关系。
因此，有需要提供的更大和更可预测的从收集的正常或脐带血、骨髓或从脂肪组织中分离出来 的SVF细胞的样品中减少RBCs、GRNs以及、可能的话、PLTs，以恢复较高纯度的含SPCs溶液。
也有一些商用系统已自动化细胞分离和减少过程(如瑞士 Biosafe SA的 Hemonetics V50, the Cobe Spectra, the Sepax 系统，以及加利福尼亚 Thermogenesis Corp.的Thermogenesis AXP)，也有重大缺点并且也没有实现相对传统的手动装置改进的纯化的WBCs的回收率。另外缺点是，使用这些市售的自动化系统需要昂贵的设备投资。如果需要大量生产纯化的WBCs单位(unit),如脐带血造血干细胞库,每天可处理40至200个单位，这些自动化设备就耗资数十万美元，占据大量的实验室空间。图10示出了使用两个现有技术的系统和当前系统处理4个单位的血液的成本。
如图11所示，目前市售的自动化系统的第二个缺点是，它们需要复杂的、昂贵的、 难以制造的单次使用一次性的集成袋(bag set),其与真正的试管连接在一起以处理细胞。 正确地加载这些集成袋到他们的专用设备并准备处理的血液或骨髓的系统大约需要五分钟。制造这些现有技术的集成袋是复杂和昂贵的。如图11中所示，这些现有技术的集成袋需要超过20个单独形成的胶接。
因此，需要一种更简单、更便宜、更快、更容易使用的自动化系统，其也能达到更高的WBCs回收率、更少的RBCs污染。进一步需要一种系统，它采用简单的、制造成本低的单次使用的一次性处理容器，其不需要多个袋和复杂的连接管。
图12示出本发明的简单性，它提供了一种多合一的筒状仓盒，所有的细胞处理都在其中发生，并在其中设置所有与细胞分层和减少有关的组件。仅一两秒钟，该仓盒就可锁定到专用的圆柱形的控制模块的顶部，并准备好插入到离心杯。所述控制模块包含光学和重力传感装置，以及用于控制仓盒中的动作的装置。
这种多合一仓盒得益于注射成型的制造精度并且简单得多，比现有技术的包括多个集成袋和复杂的连接管的自动化系统使用的常规的处理用一次性容器的劳动效率高。
因此，本发明的第一个目的是对每个单独的血样的细胞群的迁移进行光学跟踪， 然后通过在离心过程中将它们转向至第二的和在相同的仓盒内的独立腔室来减少一些类型的细胞。
本发明的第二个目的是，选择性减少基本上所有不想要的类型的细胞，而不需要使用占体积的密度梯度介质或缓冲剂。
本发明的第三个目的是，提供刚性的漏斗形收集室，其在底部基本上更窄，以至于下降的RBCs被迫到漏斗的中心，从而增强由上升到红细胞体积顶部的最轻的RBCs导致的垂直的涡流，其辅助数量上少得多的但更轻快的WBCs上升到初始WBC分层和浓度水平。
本发明的第四个目的是，提供多合一仓盒，所有的细胞处理均在其中发生，并且在其中，分离完成时与细胞分层和减少有关的所有组分均就位。仓盒可以是方便、快捷、可拆卸地锁定至控制模块，在离心作用下，依赖自身强度支持，而不是依赖它嵌套的支撑结构支持。此仓盒优选包括至少三个刚性腔室=(I)RBC腔室，其中导入了大量RBCs和、由操作员决定的、不需要的GRNs ; (2)干细胞(SC)腔室，其中导入了目标WBCs，其可以包括、由操作员决定的、GRNs、淋巴细胞、单核细胞、SPCs和/或血小板；和(3)漏斗状收集器，其初始包含整个血液或骨髓样品，保留加工后的任何多余的血浆。
本发明的第五个目的是，在漏斗状收集器内生成WBCs层，当通过离心力推动向下时，遇到直径减 小的漏斗的部分，从而使所述WBC层的垂直厚度增加。
本发明的第六个目的是，提供用于将血样分层为RBCs、GRNs、MNCs、PLTs和血浆， 以及用于精确地打开和关闭一些细胞层之间的界面处的一些阀的装置。
本发明的第七个目的是，提供装置，其相比传统的手动或自动系统，收集更高百分比的WBCs同时减少更高百分比的RBCs，并且不需要RBC沉淀剂，例如羟乙基淀粉 (hetastarch)。
本发明的第八个目的是，相比传统的手动和自动系统，以更低的成本提供上述7 个目的。
随着下面的描述，这些以及其他的目的、优点、特征以及本发明的各方面将变得显而易见。到了完成前述的和相关的目的，那么，本发明包括的功能在下文中更充分地描述， 并在权利要求中特别指出，以下的描述和附图细化本发明的一些说明性实施方案，这些是指示性的，然而，一些变化的方式中也可以利用本发明的原理。
发明简介
本申请提出了方法和装置，其用于从血样中减少RBCs，并在一些情况下，减少 GRNs,并且，在其他的情况下，减少PLTs，所述方法包括离心仓盒基的细胞溶液托架和分离 器(the centrifugation of a cartridge based hoIderand separator of cell solutions)。图13示出了本文所描述的过程的简单的示意性概览。本发明从血液或骨髓样品中选择性地减少基本上所有不需要的RBCs以及、在操作员决定下、也减少一些WBCs (优选GRNs),同时,在操作员决定下,减少PLTs,从而最佳化分离以及然后收集纯化的MNCs。优选的本发明的实施方案包括单次使用的硬质塑料仓盒，所有的处理都发生在其中并且在离心过程中所有的细胞群、PLTs和血浆可以分布在其中。本发明不再需要密度梯度颗粒或盘 (disk)。本发明也不需要脆弱的薄膜塑料集成袋和它们复杂的和浪费的互连管，其导致在许多胶接处泄漏，而且其不可避免地捕捉(trap)MNCs和SPCs，其不能在随后被回收。本发明进一步提供易用的锁定仓盒，其包括内部的漏斗状收集器，其具有精确缩小的横截面以在重力井中最优化细胞流动和垂直地分层细胞群。
如图13所示，使用中，在高G力下，WBCs可首先从外围或脐带血、骨髓或从脂肪组织分出的SVF细胞溶液的样品中分层出来。其次，在较低的G力时，该装置和方法允许离心力促使细胞远离旋转轴线以及引导RBCs从漏斗状收集器底部到所含的腔室。随着分层的 WBCs进入正离开的RBCs曾占据的直径减小的空间，形成半径减小和垂直厚度增加的WBCs 和MNCs的盘。
通过在离心过程中除去RBCs，RBC层和血浆层之间的WBC层向下移动到这个漏斗状收集器的狭窄部，使得WBCs和MNCs处于漏斗状收集器的收窄的顶部。随着红细胞继续移除，不论到RBC减少室或先于待捕获的WBCs进入SC腔室，分层在垂直方向拉长，从而促进仅所需的细胞类型的移出。
应当理解，如图14所示，漏斗状收集器尖端也可以采用多样的圆周和几何形状。 随着细胞朝着漏斗状收集器出口运动，这些不同的圆周和几何形状会改变流率和细胞密度，以及随后的红外传感器的光测读数。
在优选实施方案中，当其离开漏斗状收集器时，光学传感系统识别每种类型的细胞群。光学传感系统与一个或多个阀装置联通，用于引导和控制的一些细胞群流向两个位置中的一个。例如,如图13所示，随着WBCs分层通过光学传感系统，WBCs可被引导至一次性仓盒内的第二 SC回收室。然后，WBCs可能通过流体的压力以及WBCs背面/上面的细胞推进以初始地移动到与旋转轴线垂直，然后向上朝向旋转轴线进入SC回收室的竖管·。
本发明可以进一步包括装置，其跟踪引力场随着时间推移的变化，以及提供从样品中减少RBCs以及、同时任选地、GRNs和/或PLTs的数据临界点。


本发明的上述方面和许多伴随的优点将变得更容易理解，相同的通过参照下面的详细描述以及结合附图变得更好理解，其中
图I是在人的血液中发现的各种细胞类型的密度和平均直径的曲线图2是在人的血液中发现的各种细胞类型的不同密度的曲线图3是离心后细胞群的体积比例表；
图4是不同体积的抗凝血血液中的细胞的体积表；
图5是抗凝血血液的体积与离心分离的细胞群的体积的曲线图6是人体血液在离心过程中在标准的试管中的分层图7是人体血液和Ficoll添加剂的混合物分离后的分层图8是标准试管中人体血液和血液分离盘离心分离时示意图9是不同年龄段的男性和女性的平均ESR值表。
图10是使用几个现有技术的系统和当前系统处理4个血样时的相对成本图11是现有技术的血液分离系统和本发明的一次性组件的相对复杂性图12是本发明的控制模块和一次性仓盒的立体图13是本发明过程的概述图14是本发明的几个实施方案的漏斗状收集器尖端的剖视图15是本发明的一次性仓盒、控制模块以及控制模块和仓盒的各种功能的局部线框透视图16是本发明的一次性仓盒、控制模块和示例性的离心杯的分解视图17是本发明的控制模块的立体图。
图18a是带A_A切割线的一次性仓盒线框侧视图18b是沿切割线A-A切割的一次性仓盒的透视图。
图19是具有狭窄底部的所示漏斗状收集器的一次性仓盒的立体剖视图20是离心前本发明的优选实施方案的剖视图21是离心过程中本发明的优选实施方案的剖视图22是离心过程中本发明的优选实施方案的阀系统部分的剖视图23是本发明的备选实施方案的悬臂式阀系统的详细视图24是本发明的优选实施方案中的凸轮部分的立体细节图25是本发明的优选实施方案的柔性导管的剖视图，示出了存在于人体血液和柔性导管的各种细胞的相对尺寸；
图26是本发明的优选实施方案10分钟的离心分离后的剖视图27是本发明的优选实施方案的光学传感部分的细节剖视图28是本发明的优选实施方案在RBCs减少期间阀系统、竖管、RBC收集室和SC收集室的详细的剖视图29是在RBCs和GRNs减少期间本发明的优选实施方案的阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图30是RBCs和GRNs减少后本发明的优选实施方案的阀系统、竖管、RBC收集室， 和SC收集室的详细的剖视图31是减少MNCs过程中本发明的优选实施方案的第一位置(IstPosition)的发射器/接收器对的测量值曲线图32是在减少MNCs和与血衆上浮期间(top-up with plasma)本发明的优选实施方案的阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图33是备选实施方案中的漏斗状收集器，阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图，其中，减少RBCs和GRNs后离心分离停止；
图34是备选实施方案中的漏斗状收集器，阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图，其中，减少RBCs和GRNs后离心分离停止，且振摇整个仓盒以便混合余下的血浆、MNCs和PLTs ；
图35是备选实施方案中的漏斗状收集器，阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图，其中，所述仓盒以较低的G力和更少的时间进行第二次离心分离，以收集基本上所有的MNCs以及仅一小部分的PLTs ；
图36是在离心分离停止以及MNCs、血浆和一小部分PLTs收集到SC收集腔室后的备选实施方案中的漏斗状收集器，阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图37是备选实施方案中的漏斗状收集器，阀系统、竖管、RBC收集室，和SC收集室的详细的剖视图，其中，希望GRNs在SC收集腔室中；以及
图38是本发明的优选实施方案的仓盒的立体图，示出了 SC收集管和RBC/GRN收集管。
发明详述
下面的详述使得本技术领域的普通技术人员能够制造和使用本发明的各个方面和实施例。所提供的具体的材料，技术和应用的描述仅仅是作为例子。对本技术领域的普通技术人员来说，本文所描述的实施例的各种修改将是显而易见的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原则可以应用到其他实施例和应用。因此，本发明不意在受限于描述和示出的实施例，而是应被赋予与所附的权利要求相一致的范围。
申请人公开了方法和装置，其用于从血样中减少RBCs，并且在一些情况下，减少特定的GRN，并且，在其他情况下，减少PLTs。本发明的优选实施方案通过离心实现这种基本上的减少(substantial depletion),以便最优的分离,然后收集包括基本上所有的SPCs 的 WBCs。
首先转向图15，申请人在优选的实施方案中的方法和装置I包括刚性的一次性仓盒10，其中可以容纳最多250毫升的液体，该刚性的一次性仓盒10是圆柱形的，单次使用的，并优选的由硬质塑料构成，并且更优选光学透明的聚碳酸酯。其中设置了一次性仓盒10 的控制模块40是一种电池供电的、有光学和重力传感的电动机械的设备。优选的实施例中还包括膜开关41、七位读数器(seven segment digital read out) 42和三个发光二极管 43以提醒并协助用户。图15左侧显示的是一种通用的电池标记44，提醒用户电池的充电状态。中心显示的是通断开关45，用于控制模块和LED，以及右侧是读数器42和LED，其指示是否按照设计进行细胞收集，如果不是，发生了哪种错误操作。
转到图16，显示的是根据本发明的优选实施方案的一次性仓盒10和控制模块40， 以及标准的750毫升的离心杯70的分解图。在操作中，一次性仓盒10和控制模块40可拆卸地锁定在一起。一次性仓盒包括多个腔室，其中之一是漏斗状收集器或刚性室11。优选的是，离心杯70罩住控制模块40，其目的是为了重复使用并在其上连接无菌的一次性仓盒10。组合的控制模块40和仓盒10优选重约450克。在后面将要描述的其它组件中，该仓盒包括在顶部的入口 12，用作进入的流体的入口。该入口可以连接导管，其可能加工成放血针或钉(spike)以连接到细胞溶液，并可能还可以耦合到内联的过滤器，其可以消除任何阻塞物(clot)，否则该阻塞物会在剩下的处理步骤中阻塞其他系统组件。一次性仓盒的顶部也可以含有O. 2-微米的过滤器13以在将血液或骨髓引入漏斗状收集器中时，提供从其中置换空气的通道。仓盒的顶部也可包括血液、骨髓或其他液体如稀释剂的无菌过滤的 (图中未示出)装置，当它们引入漏斗状收集器中时。
转到图17，示出了电动机电路板电子器件47，其位于较低处的控制模块40内。设备的机电部优选使用可再充电的电池系统来供电控制模块，其监视和控制引力和光学传感设备和指示一次性仓盒中的动作。用于确定G力的装置可以是在本领域中任何常规的装置，如通过离心机RPM的测定计算所述力，或通过直接测量加速度或力。
图18a显示带A-A切割线的一次性仓盒10的侧视图。图18b是沿A-A切割线切割的一次性仓盒10切的透视图。如下面的过程中，含有细胞的生物流体，如常规血，脐带血或骨髓，被传递到具有初始由阀装置(未示出)封闭的开口端部的大漏斗形腔室。仓盒包括大的第一刚性贮藏腔室或RBC减少腔室14和较小的第二刚性贮藏腔室或SC收集腔室15， WBCs和基本上所有的SPCs被转移到其中。RBC减少腔室14明显的大于SC收集腔室15，这是因为从血样中减少的RBCs的体积总是比收集的WBCs的体积大得多。所有的腔室都彼此不同，但相对于气流毗连。RBC减少腔室14和SC收集腔室15通过小通风筒(chimney) 29 连接到原来的腔室，以便细胞溶液从原来的室进入腔室时排空空气。
转到图19，示出了一次性仓盒10的立体剖视图，其具有漏斗状收集器11的狭窄底部。从漏斗状收集器的左侧剖视图中可见到更大的RBC减少腔室14。正如将要在下面详细描述地，在操作中，RBCs初始迁移向漏斗状的主腔室的底部，从离心机的旋转轴线沿径向向外运动，直到到达该装置的底部的阀系统16。这里，阀系统上方的流体压头推动流体进入两个腔室中的一个。流体被引导到哪个腔室取决于这些腔室的阀的状态(开，关)。无论在哪一种情况下，通过在仓盒10的底部的阀系统16后，在残留在主腔室的流体(主要是血浆) 的压力推动下，流体大致流向旋转轴线。然后，已经通过阀系统的流体保留在RBC减少腔室 14或SC收集腔室15。通过精密调整阀，不需要的细胞溶液会被减少，并可以收集期望的细胞溶液。
转到图20，示出了使用中的本发明的优选实施方案。如图所示，主漏斗状腔室11 内放置IOOml的脐带血。然后，操作者连接仓盒10到控制模块40 (图21中所示)，然后加载仓盒到离心机中，优选摇摆斗式离心机，如ThermoFisher的SORVALL ST-40台式离心机, 其配置为接收4个750毫升的圆柱形桶。可使用替代的离心机，其在一次离心时提供多于或少于四个仓盒。
转到图21，显示了仓盒10经受高G力时发生的情况。在这里，在示例性的2000G 离心下，RBCs开始向下迁移并且WBCs开始从漏斗状收集器的底部向上以及从顶部的流体体积向下至RBCs以上的位置。然后在RBCs之上，WBCs和PLTs开始形成非常薄的层并且在该层上形成血浆层，血浆的颜色是黄的。在高G力下，在漏斗状收集器11的底部附近，RBCs 逐渐增加地挤压在一起，包括下端的最重的RBCs和RBC体积上部附近较轻的RBCs。指出的是，如图所示，由于在离心过程中，图中所描述的仓盒绕轴旋转，其垂直于仓盒并位于仓盒上方，仓盒承受的G力按其与旋转轴线的距离成比例地增加，离心杯底部的(2000Gs)大约是顶部的(IOOOGs)两倍。
转到图22，显示了优选实施方案的详细的侧视剖面图。在该优选实施方案中，漏斗状收集器11通过阀系统16保持与RBC减少收集室14和SC收集腔室15分离。虽然可以设想许多的阀控制工具，在优选的实施例中，使用夹紧阀系统，其中，偏心凸轮17控制管钳子18，其最终引导液流从漏斗状收集器的底部至细胞减少腔室14及细胞收集腔室15。在这里，夹紧阀包括两个相对的夹具，其具有大约O. 088英寸宽的夹紧表面，需要约I. 6磅的夹持力来阻止所有流体通过氨基甲酸乙酯管，其内径为O. 062英寸，外径为O. 088英寸，管中的液压压力是325PSI。在更大的压力时可能需要超过I. 6磅的夹持力，并在较低的压力下，减小的夹持力可能就足够了。
转到图23，显示了一种悬臂系统以实现这些所需的夹持压力 (pinchingpressure)。悬臂系统19可根据需要打开和关闭阀(夹紧和释放管)。用于各悬臂21的弹簧20优选位于悬臂的最末端。传动装置克服弹簧的阻力以移动操作杆。一旦传动装置停止施加力，弹簧的偏压推动操作杆返回到其初始位置。
转到图24，所示的是管夹紧或阀关闭机构的凸轮部分的详细视图。凸轮将阀电动机的旋转运动转换成直线运动，其用来关闭或夹紧管。如上文所披露，悬臂系统可以与凸轮配合使用。当凸轮22顺时针旋转大约90度，由于高引力场在整个设备上的施加的大致向下的力，所述凸轮的较大部分对转子和电动机施加持续的顺时针扭转力。凸轮是为了运行在非常高的引力场而专门设计的。断流器(cutout) 23和位于凸轮的相对侧上的平衡块24 允许小型电动机提供足够的力，以将凸轮逆时针旋转90度到它的开始位置。因此，凸轮被专门设计，以不仅降低离轴(off-axis)的材料量和其受到的潜在的固定的引力，并且考虑到这样的力，也平衡所述凸轮的其余部分的重量。也就是说，由于凸轮轴绕其中心轴旋转， 这样的设计保证不存在增加或减去扭矩，其作为G力作用在凸轮上的结果。
图25示出了一示例性实施方案的相对于连接管或柔性导管(大外圈)的各种细胞的相对大小，该连接管或柔性导管位于主腔室11和RBCs减少腔室14或SC收集腔室15 之间。在一示例性实施方案中，管的内径是O. 062英寸(I. 575毫米)。只要可以通过阀装置完全截止所有细胞和液体，也可以采用具有其他的内径和外径的管。在示例性实施方案中，这些柔性导管的长度与直径的比率不超过20。
返回到示例性过程的描述，图26显示了在2000Gs的离心约10分钟后的示例 性的仓盒。血沉棕黄层(buffy coat) 2在RBCs和血浆之间的界面处分层。在漏斗状收集器11 最底层的细胞，可能会达到接近90的HCT (血细胞比容，红细胞所占的血液量的比例)，但靠近RBC层的顶部的HCT可能只有60-70，由于在该与旋转轴线的距离处的较低的离心力以及在该位置处的漏斗状收集器的较大面积。
转到图27，显示了漏斗状收集器11的狭窄区域的详细视图。当一次性仓盒10被连接到控制模块40上，在主腔室的狭窄区域中有至少一个但优选两个或更多的光学传感器或其它传感器48，其检测流经处理用的漏斗状收集器的部分的细胞类型。在该主腔室的狭窄区域中还有至少一个但优选两个或更多的光学或其他发射器49。在所示的示例性实施方案中，4个红外发射器/检测器对成垂直布置。在优选的实施方案中，红外传感器位于成对的红外线发射器的正对面。在第二优选实施方案中，提供优先被红细胞吸收的波长的发射机位于对该频率敏感的成对的传感器的正对面。在第三优选实施方案中，传感器用于识别已吸收荧光染料的细胞。在第一优选实施方案中，细胞的存在干扰所发射的红外光，红外光检测器量化透过流体的信号的振幅。在优选的实施方案中，传感器可赋予发送水平从 0-1000的值。纯血浆，其类似水，不阻止红外光，登记值为大约1000。当压实的RBCs通过时，基本上所有的红外光被阻止并且检测器登记值为O。
转到图28，示出过程的下一步。样品离心分离一设定时间(20分钟，在示例性实施方案中)，离心机的速度可能会减缓到使在离心机筒底部(即，从旋转轴最远的)创建 IOOGs的速度。板载的加速计可以跟踪整个过程中的G-力。一旦该加速计检测到离心机已经达到lOOGs，设备将等待一设定的时间(为了确保离心机稳定在lOOGs，而不是一些较低的G力，例如，如果机器有发生故障或丢失部分的功率)，然后与RBC减少腔室14和主腔室11连接的第一阀25打开，允许通过高度浓缩的RBCs和部分血浆。可以看到RBCs通过初始填充竖管26 (优选具有ImL的体积，如下面将描述的那样)而进入减少腔室14。在使用过程中，RBCs会继续流入到减少腔室14直到竖管26充满，而在此时，RBCs将溢出并填充减少腔室14的较大部分。
图29示出了竖管26溢出和RBCs填充较大的减少室。RBCs和血浆之间的界面，血沉棕黄层2，是显而易见的。由于漏斗状收集器11狭窄，相同体积的细胞必须占据较少的水平空间。作为结果，占用的垂直空间增加，区分每个分层的细胞类型变得更容易。
转到图30，示出了进入漏斗状收集器11的窄部的WBCs。当WBCs进入这个较窄部分，其分层继续，GRNs在底部(未标示)，MNCs3在中间，并PLTs 4在MNCs上面。体积大的血浆5显示位于PLTs之上。
发射器/探测器对，如图27所示，监测细胞通过主腔室的狭窄区域。图31显示了在100G条件下，经过第一位置(最顶层)的发射器/检测器对的血细胞群的红外光学计数数量。水平线表示无细胞血浆中观察到的光学计数。低的光学计数表示WBCs和PLTs仍存在于样品中，其通过发射器/探测器观察。在图形左下方的从O的初始上升表示，当在RBCs 上面的血沉棕黄层通过第一位置的发射器/探测器对。上升的值表示通过发射器/检测器对之间的溶液变得更加澄清，这意味着它包含较少的RBCs。随着接近更澄清的层，数值增加，例如至50，然后100,200等。
在一些情况下如图31中所示的光学计数值，在细胞被减少时升高，可能会在减少停止时开始下降，这表明越来越多的细胞进入传感区。这种情况的原因是复杂的。首先，光学测量通过流体进行，该流体经历湍流和涡流，当不同密度的颗粒通过漏斗状收集器的半径减小的底部排空时进行重组。由于它们不同的尺寸，RBCs和WBCs以不同的速度下降。 因此，如果排空RBCs的速率大于一些颗粒的沉积速率(如PLTs，相对于其他细胞尺寸较小)，然后这些颗粒将落后其他具有更快的沉积速率的颗粒。仔细分层的混合物在排空过程 (evacuation process)会部分混合。不仅RBCs以与WBCs以不同的速率下降,而且WBCs的运动也可能被多得多的RBCs的运动抑制。此外，RBCs的密度在其整个生命周期中是变化的。因此，密度较小的RBCs将与置换的血浆一起上升而密度大的RBCs挤到漏斗状收集器的底部。因此，WBCs，其在漏斗状收集器的底部开始上升并升向RBC/血浆界面，在上升时伴随有多得多的“较轻”的RBCs。由于所有的细胞具有轻微负电荷，并因此倾向于彼此排斥的事实，这些上升的细胞回旋在下降的密度大的RBCs周围。
本系统的示例性实施方案中，为了应对不可避免地发生在减少期间的这种混合， 在设定时间的排空后关闭导管，细胞通过该导管传递，允许下降的细胞再紧凑化以及再分层。重新打开导管，混合再次开始在漏斗状收集器内出现。因此，若此混合不适合于给定的应用时，本发明能够采用启动-停止的方法，定期停止排空过程。
转到图32，示出了过程的较后部分。在该过程的某一点上，通向RBC减少腔室14 的管是关闭的，通向SC收集腔室15的管是打开的。图32示出了该过程中稍后的时间，其中，通向SC收集腔室15的通路已经打开，通向RBC减少腔室14的通路夹紧切断。因为RBC 减少腔室竖管26保持进入RBCs减少腔室15的最后ImL的RBCs，在竖管26中包含最不密集的RBCs，并因此具有比RBC减少腔室15整体上更大的GRNs和NRBCs浓度。技术人员可随后回收竖管26的内含物，从而获得用于HLA分型的GRNs和NRBCs而不会牺牲较小的SC 腔室15中SPCs的回收。随着离心分离继续，更大的密度的细胞继续远离旋转轴线。残留在主腔室的血浆5继续给它下面的流体和细胞施加压力，并驱动MNCs3，和PLTs4上升到管至SC收集腔室15。如图所示，甚至在MNCs和PLTs大量地从主腔室除去后，然后允许血浆 5流入到SC收集腔室15，在这个过程中，清洗该连接管，确保所有的SPCs被收集在收集腔室15中。
定时控制阀系统16，以便流体(和细胞)被引导到SC收集腔室15，而不是到RBC减少腔室14是至关重要的。如果阀门切换过早，RBCs可能进入SC收集腔室15，提高HCT 且收集的样品的纯度降低。如果阀切换太迟，一些MNCs可能移动到RBC减少收集腔室14， 从而减少回收收集的MNCs和SPCs。
本发明的示例性实施方案克服的在现有技术中存在的困难是，收集预定最终体积的在离心过程中传送的液体的挑战。这是很重要的，例如，因为各种其它类型的设备会被配置以接纳预定体积的液体，如20毫升，其中，这些设备预期从将要使用的本发明的设备接受血样(This is important forexampIe because various other types of equipment in which it is anticipatedbIood samples from the current invention will be used are configured to accept apredetermined volume of liquid, such as 20mL.)。虽然在离心过程中，可以使用专门用于测量收集的流体的重量的秤来检测什么时候已经收集到一定体积的流体，但出于可靠性的目的，固态溶液是优选的。要确定到SC收集室的流过液体的体积，一些假设是必需的。首先，已知通过主腔室的传感区域的细胞之上的流体对这些细胞产生向下的压力，并促使其通过漏斗状收集器的底部排空。随着液体继续在恒定加速度下排空，排空速率减慢，因为在这些细胞上存在较少的压力，压力较少是由于它们上方的血衆积减小了。也已知，虽然不同的血细胞比容(hematocrit)以及不同的人,细胞粘度可能会有所不同，但是关于粘度血浆是足够一致的。因此，一旦所有的靶细胞已通过以及只有血浆残留以通过管转移到SC腔 室，它会以与其上的血浆的动态压头成比例的可预测的流速流动。
本发明中，上述的事实结合到一种方法中，该方法使排空的细胞经过多个发射器/ 探测器对。例如，如上面所述，随着血沉棕黄层接近顶部传感器，顶部或第一位置的发射器/ 探测器对检测到的光学计数，将开始上升。预先确定任意的光学计数值(在这种情况下是 4)，当该第一位置发射器/检测器对检测到该任意值时，启动时间戳(timestamp)。随着继续排空，第二位置的发射器/探测器对(也就是，最上面的一对的正下方的一对)读取该相同的任意值时，设置第二时间戳。考虑第一位置和第二位置的发射器/探测器对之间的距离，以及任意值达到第二位置所花费的时间，通过计算，可以确定2对传感器之间的血液成分流的速度。也可以采用同样的过程，确定任何任意值从一个传感器到位于它下面的任何其他传感器所需的时间量。
进一步了解传感器之间的血液体积，就可以计算体积减少的速度。比如，已知，在本发明的一实施方案中，第一位置传感器的下面的漏斗状收集器的底部前端(bottom tip) 的体积是6毫升，而第二位置传感器下面的体积为4毫升。基于第一时间戳和第二时间戳之间有2mL的血液被排空的认识，该流速可以因此计算出来。通过检测在何时第三和第四位置(最低)的发射器/探测器对读取到相同的任意值，该速率可进一步得到优化。更重要的是，在此过程中，进行了上述的启动-停止技术且记录了全阀关闭对排空速率的影响。 总之，通过基于流过层叠的发射器/探测器对的观测速率的外推法，在通往SC收集腔室的阀由于包括SPCs的WBCs溶液用血浆补足到希望的体积而打开时，可以设定边界。该边界依赖于流速而改变,其最终是依赖于排空点上的液压头引起的压力，并在一定程度上依赖于血浆的粘度引起的压力，该血浆用于“补足”干细胞溶液至预定的最终体积。
在本发明的备选实施方案中，RBCs可以在较高或较低的加速度收集，因而当前选择100G，例如在50至200Gs的引力场。
本发明的备选实施方案包括显著减少与MNCs 5—起收集的PLTs 4数目的方法。
如图33所示，在离心过程中，MNCs 3和血小板4在主腔室11的底部狭窄部分浓缩。在过程的这一点上，如果通往SC收集腔室15的夹紧阀被打开，那么血浆的质量将以首先垂直于旋转轴线然后沿着朝向旋转轴线的右侧管的方向推动MNCs并进入SC收集腔室15。不采取额外的步骤，血浆随后将迫使PLTs进入SC收集室，直到它们被减少，此时血浆流将补足SC收集腔室。
为了减少进入SC收集腔室15的PLTs的数量，技术人员可以编程控制模块，在 RBC/GRN减少周期结束时(通过关闭RBC阀，而不是打开MNCs阀)暂停收集过程，并允许离心机停止。在该方法中，技术人员然后从离心机桶中移除仓盒并轻轻摇动仓盒，以在漏斗状收集器的整个血浆5中重新分配MNCs3和PLTs4，如图34中那样分散它们。
如图35所示，仓盒然后在较低的加速度下离心较小段时间。所述较小段时间和较低的加速度足以引起MNCs 3更密集和更快速的移动以在漏斗状收集器的底部再浓缩，但不足以引起PLTs也这样。PLTs具有较低的密度和大小，因此，需要更多的时间迁移到漏斗状收集器的底部。不提供足够的时间，大部分的MNCs和大部分的PLTs能够如所示分离。
转到图36，然后当打开通往SC收集腔室15的夹紧阀时，MNCs 3首先流入，继而血浆5和一小部分的PLTs 4，然后SC收集管被夹紧封闭。虽然一些PLTs仍成功进入SC收集腔室，该部分与转移到SC收集室的血浆的体积相比一次性仓盒中的血浆的总体积的比值成tti列(the fraction isproportional to the volume of plasma that was transferred into the SC harvestcompartment compared to the total volume of plasma in the disposablecartridge)。例如100毫升体积的血液典型地含有约55毫升的血衆。如果5 毫升血浆被转移到SC收集腔室，在主腔室中留下50毫升血浆，那么，在MNCs中的PLTs的比例为总PLTs的约10%，造成MNC收集物中减少大约90%的PLTs。
转到图37，示出了另一备选实施方案。在本发明的该备选实施方案中，期望GRNs 6在SC收集腔室15中。比如，在脐带血收集中，总的WBC计数往往决定两个对匹配病人来说难分伯仲的脐带血单位中，究竟选择哪个。因此，可能期望与MNCs —起包含大多数的GRNs。 为了得到这种结果，技术人员可以编程控制模块以在早于其他(上述公开的)的实施方案时打开到SC收集腔室的阀，从而允许RBCs (包括许多的GRNs)的顶层进入该收集腔室。显而易见，通过调整定时，不同量的GRNs可能被允许进入SC收集腔室。收集腔室中所收集的样品随后最后为血楽·，以使该样品保留相对低的(约2_10%的血细胞比容)(The sample collected in the harvest compartment issubsequently topped off with plasma so that the sample retains a relatively low(approximately 2-10% hematocrit))。
转到图38，在任何上述实施方案中，设当地设置机制用于除去SC的收集腔室中的内含物以及竖管的内含物，该竖管包含最后I毫升转移到RBC腔室的RBCs。图38显示了配置有用于收集的SC收集管27以及RBC/GRN收集管28的一次性仓盒。RBC/GRN收集管以任何本领域中已知的装置连接到仓盒的外部，并与竖管的底部建立流体连接，从而提供了简单的方式以从最后ImL的细胞溶液中取回NRBCs和GRNs进行采样，例如获得人类白细胞抗原(HLA)分型(typing)，然后根据需要，移除剩余的RBC/GRNs。
在本发明的任何实施方案中，应当理解,抗体珠(antibody beads),无论是浮在 (bouyant)血浆中或大约具有和RBCs —样的密度，可以在收集之前引入到样品中与已知在特定的研究或临床无用的细胞结合在一起。
在本发明的任何实施方案中，应该很容易理解，可以在收集之前，引入能被一些细胞群吸收的荧光材料，以允许在收集过程中以及之后跟踪所述细胞群。
虽然一些实施方案已示出和描述本发明，在阅读和理解本说明书后，本领域的其它普通技术人员对其等效的改变和修改将是显而易见的。特别是，关于由上述组件执行的各种功能，用来描述这种组件的术语(包括任何参考的装置)是旨在对应于，除非另有说明，任何执行所述组件的特定功能的组件(例如，功能上是等效的)，即使在结构上不等同于本文中本发明的示例性实施方案中所公开的执行该功能的组件。此外，虽然本发明的特定特征可能相对于仅一个实施例中公开，这样的特征可以结合其它实施方案中的一个或多个其他特征，如对于任何给定的或特定的应用是所期望的或有利的。

1.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，其中所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括a.在离心机内放置刚性仓盒，所述刚性仓盒包括刚性室、第一刚性贮藏腔室和第二刚性贮藏腔室，其中所述刚性室具有流体连接到初始封闭的阀系统的端部；b.转移所述样品到所述刚性室中，所述样品包括血小板、血浆、高密度细胞和低密度细胞；c.离心所述刚性仓盒，使得所述样品在至少IOG的第一G力下，然后由低于所述第一 G力的第二G力下被推向所述端部；d.提供第一通路，使所述高密度细胞通过所述端部到所述第一刚性贮藏腔室；e.跟踪所述高密度细胞通过所述端部的迁移；以及f.提供第二通路，使所述低密度的细胞以及一定量的血小板和血浆通过所述端部到所述第二刚性贮藏腔室。
2.根据权利要求I的方法，其中所述跟踪以光学方式进行。
3.根据权利要求I的方法，其中所述提供步骤利用所述阀系统。
4.根据权利要求I的方法，其中所述刚性室通常是圆锥形的。
5.根据权利要求I的方法，还包括检测所述的第一G力和第二 G力。
6.根据权利要求I的方法，还包括从所述样品减少至少一种额外的细胞类型。
7.根据权利要求6的方法，进一步包括以下步骤a.在所述离心步骤之后，减速所述刚性仓盒到IG的G力，并且其中部分所述样品保留在所述刚性室中；b.搅拌所述刚性仓盒以混合所述部分；并且c.离心所述刚性仓盒至大于IG的G力用于后续处理。
8.根据权利要求I所述的方法，其中多个柔性导管连接所述刚性室到所述第一和所述第二刚性贮藏腔室，且其中，所述柔性导管的长径比不超过20。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述的阀系统包括凸轮和柔性导管。
10.根据权利要求I所述的方法，其中在所述提供步骤之前，抗体珠被引入到所述样品O
11.根据权利要求10的方法，其中所述抗体珠大约和RBCs—样密集。
12.根据权利要求10的方法，其中所述抗体珠浮在血浆中。
13.根据权利要求I的方法,其中所述样品还包含荧光材料。
14.根据权利要求13的方法，进一步包括跟踪所述荧光材料步骤。
15.根据权利要求I的方法，进一步包括以下步骤a.在所述离心步骤之后，减速所述刚性仓盒到IG的G力，并且其中部分所述样品保留在所述刚性室中；b.搅拌所述刚性仓盒以混合所述部分；以及c.离心所述刚性仓盒至大于IG的G力用于后续处理。
16.如权利要求15所述的方法，其中在所述提供步骤之前，一种抗体珠被引入到所述样品。
17.根据权利要求16的方法，其中所述抗体珠大约和RBCs—样密集。
18.根据权利要求16的方法，其中所述抗体珠浮在血浆中。
19.根据权利要求15的方法，其中所述样品还包含荧光材料。
20.根据权利要求19的方法，进一步包括跟踪所述荧光材料步骤。
21.根据权利要求I的方法，进一步包括添加红细胞沉降加速剂的步骤。
22.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括a ·提供i.离心机，其具有旋转轴线；以及 .样品，包括血浆和高密度的第一部分以及低密度的剩余部分；iii.刚性仓盒，包括1.内部刚性室，其具有出口；2.第一刚性贮藏腔室和第二刚性贮藏腔室；3.输入口；4.阀系统，其联通所述出口和所述刚性贮藏腔室；以及iv.传感器；b.通过将所述样品通过所述输入口转移到所述刚性室而将所述样品置于所述刚性仓盒内；C.离心所述刚性仓盒，使得所述第一部分首先由所述阀系统引导通过离心力被推向所述出口，然后被推向所述旋转轴线并进入所述第一刚性贮藏腔室；以及d.由所述阀系统引导一定量的所述其余部分朝向所述旋转轴线并进入所述第二刚性贮藏腔室。
23.根据权利要求22的方法，其中所述的阀系统包括凸轮和柔性导管。 22的方法，其中所述传感器是光学传感器。22的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一部分通过所述出口
24.根据权利要求
25.根据权利要求的活动。
26.根据权利要求定位在所述小的端部。
27.
28.
29.
30.
31. 之后。
32. 之后。
33. 的活动。
34.根据权利要求根据权利要求根据权利要求根据权利要求根据权利要求 22的方法，其中所述刚性室进一步包括小的端部，且其中，所述出口 22的方法，还包括分层所述样品，从而生成至少一个界面。 27的方法，还包括利用所述传感器检测所述至少一个界面。 27的方法，其中所述分层步骤产生第一和第二界面。29的方法，还包括利用所述传感器检测所述第一和第二界面。30的方法，其中所述引导步骤发生在所述传感器检测所述第一界面根据权利要求30的方法，其中所述引导步骤发生在所述传感器检测所述第二界面根据权利要求32的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一部分通过所述出口根据权利要求22的方法，进一步包括以下步骤在所述离心步骤之后，从高于IOG的G力减速刚性仓盒到大约IG的G力，并且其i.基本上大多数所述第一部分在所述第一刚性贮藏腔室内；且 .基本上大多数所述剩余部分在所述刚性室中；f.通过搅拌所述刚性仓盒以混合所述剩余部分；并且g.使所述刚性仓盒回复到大于IG的G力用于后续处理。
35.根据权利要求34的方法，还包括利用所述传感器跟踪所述第一或第二部分通过所述出口的活动。
36.根据权利要求35的方法,其中所述传感器是光学传感器。
37.根据权利要求36的方法，其中所述光学传感器包括至少一个红外发射器/检测器对。
38.用于从样品中减少红细胞、粒细胞或血小板中的至少一种的方法，所述样品包括血液、骨髓或从脂肪组织分离的间质血管部分细胞，该方法包括a.提供刚性仓盒，包括 i.刚性的外壳； .大致漏斗状的内部刚性室，其具有包含出口开口的小的端部以及包含入口开口的大的端部；iii.第一和第二刚性贮藏腔室，其初始不与所述小的端部流体连接；iv.第一阀，联通所述出口开口和所述第一刚性贮藏腔室，其中所述第一阀是初始封闭的；以及V.第二阀，联通所述出口开口和所述第二刚性贮藏腔室，其中所述第二阀是初始封闭的；b.提供离心机，其配置为接纳所述刚性仓盒；c.提供样品，其包括高密度细胞、低密度的细胞、血小板和血浆的混合物；d.通过所述入口开口转移所述样品到所述刚性仓盒中；e.将所述刚性仓盒置于所述离心机中；f.施加离心力，以将所述样品推向所述小的端部；g.分层所述样品，以使基本上大多数所述高密度细胞形成高密度的成分层和基本上大多数所述低密度的细胞形成低密度成分层；并且h.打开所述第一阀，以使所述成分层迁移向所述小的端部，并且其中通过离心力所述基本上大多数所述高密度细胞被推动首先远离所述旋转轴线，然后朝向所述旋转轴线并进入所述第一刚性贮藏腔室。
39.根据权利要求38的方法，其中第一阀是由凸轮启动。
40.根据权利