专利名称：含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法技术领域本发明属于生物技术领域，涉及含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种后代真实性的分子鉴定方法。杂种优势的研究和利用可显著提高棉花的产量、改进品质、提高抗性。我国育苗移栽地区的绝大部分棉农栽种杂交棉；黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。目前棉花杂交种子的生产方式主要是人工去雄授粉杂交制种法，棉花生产上种植的杂交种子90%以上都是通过这种方式生产的。然而随着棉花主要生产区及其周边地区劳动力成本逐年提高，种子生产成本越来越高，大规模推广利用难度也愈来愈大。因此，开展三系杂交棉选育和推广工作就显得尤为重要。与其它制种方式相比，三系杂交棉具有明显的优势:制种程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，种子纯度高，适合大面积制种。因而,三系杂交棉花的大面积推广,对于提高植棉效益,增加棉农收益,稳定棉花种植面积都具有重要的意义。基于三系杂交种在制种方式特殊性的考虑，为了确保三系杂交种的真实性，如何稳定可靠又快速简便的鉴定三系杂交种成为本专利的关键核心。DNA是生物的基本遗传物质，DNA多态性是生物多样性的本质内容。分子标记直接从分子水平反映出核苷酸序列的任何差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，数量非常丰富，遗传稳定。分子标记的检测技术多种多样，新的方法不断产生，已有几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD, ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP、CAPS和SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外在植物杂交种鉴定中已经越来越多的应用各种分子标记技术。SSR(simple sequence repeat)也称为微卫星,是由基因组中1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA。在所有真核生物基因组中均存在并且含量非常丰富，不仅存在于内含子中，也可以存在于编码区以及染色体的其它任何区域，具有多态性丰富、稳定性好、位点专一性、共显性等特点。序列特异扩增区域(Sequencecharacterized amplified regions, SCAR)标记是由 Paran 等于 1993 年提出的一种基于PCR技术的单基因位点多态性遗传标记，由于使用较长引物和引物序列与模板DNA完全互补，在高严谨条件下扩增，结果稳定性好、重复性强。该方法对于目的基因具有很好的辅助选择效果，已成为分子标记在育种实践中直接应用的首选方法。发明内容本发明的目的是解决现有技术中含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系杂交种真实性的田间鉴定检测方法所需时间长，消耗大、准确性差等的问题，提供一种棉花三系杂交种真实性的分子鉴定方法。为了实现上述的 目的，本发明首先提供一种用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明以含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花不育系和保持系为研究材料，通过对10个线粒体基因的RFLP和Genomewalking的分析，从不育系atpA基因侧翼序列中分离到可能与棉花细胞质雄性不育相关的一段约500bp的特异片段(见参考文献 WuJianyong, Gong Yangcang, Cui Minghui, Qi Tingxiang, Guo Liping, Zhang Jinfaand Xing Chaozhu.Molecular characterization ofcytoplasmic male sterilityconditioned by Gossypium harknessii cytoplasm(CMS-D2)in upland cotton[J].Euhpytica，DO1:10.1007/sl0681-011-0357-6.)，该特异性片段可作为鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记。本发明优选了 315bp的特异性片段作为鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SCAR标记(SEQ ID N0.1)，该片段特异性更强。本发明还提供用于鉴定前述SCAR标记或其特异性片段的引物，优选的引物为:正向引物5’ -AAGTGGCCGCCCTTGCTCAATTT-3’ (SEQ IDN0.2)；
反向引物5’ -GGTTTGTGTGTGCCCCTGAAGT-3’ (SEQ IDN0.3)。
更进一步，本发明以含恢复基因近等基因系的群体为材料，通过对7256对SSR引物的筛选，从中筛选到得到两对可以用于检测恢复系和棉花三系杂交种的SSR引物:
NAU3938 引物对:
正向引物5’ -CCAGTCGGAGATTTCTTCTT-3’ (SEQ IDN0.4)；
反向引物5’ -AGCCCTAACGATCTCTCTCA-3’ (SEQ IDN0.5)。
NAU6466 引物对:
正向引物5，-GCCTCATGTTTGTTTTCTGTT-3，(SEQ IDN0.6)；
反向引物5’ -TCTTGAAACCTTTCGGACTC-3’ (SEQ IDN0.7)。
本发明还提供用于鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的SSR标记，其为用SEQ ID N0.4和5所示的引物扩增出的400bp处的特异性条带和/或SEQ ID N0.6和7所示的引物扩增出的280bp处的特异性条带。
本发明的另一个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种中的应用。
在本发明一个优选的实施方案中，用鉴定所述SCAR标记或其特异性片段的引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，筛选`出与不育系具有相同特异性条带的棉花样本；
2)用所述的SSR引物扩增步骤I)筛选出的具特异性条带的棉花样本的基因组DNA，能扩增出与恢复系具有相同特异性条带的即为含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种。
本发明采用SSR标记和SCAR相结合的方法对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系材料及其三系杂交种后代进行了分子水平的多态性检测，结果表明，两标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于棉花三系杂交种真实性的室内鉴定，也可用于三系杂交品种鉴定和纯度分析。
本发明与现有技术相比，有益效果为:
I)速度快:结合SSR标记和SCAR标记鉴定含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系杂交种的真实性具有重要的作用。棉花三系杂交种制种过程中，如果发生混杂将在杂交后代中产生不育棉株，从而对棉花产量造成重大影响，并严重影响棉农受益。而正常的田间鉴定试验需要测量大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，不能准确、真实地反映杂交种的遗传情况。该发明只需提供杂交种材料的DNA，用SSR和SCAR引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出杂交种的真实性。
2)准确率高:SSR标记和SCAR标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增和琼脂糖或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明结合SSR弓丨物对和SCAR引物对对杂交种进行真实性鉴定，增加了鉴定的可靠性，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定杂交种的遗传情况，提高了准确性。
3)实用简单:本发明鉴定含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系杂交种真实性的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。


图1不育系、恢复系、保持系、3个三系杂交种和2个人工制种杂交种SCAR分析。M:marker, 1-9分别为恢复系亲本9708R(配组中棉所83的恢复系)，不育系亲本9708A，恢复系亲本中恢46，三系杂交组合中棉所83，三系杂交组合CRI 09-1，三系杂交组合CR108-2，人工制种杂交种中棉所47,人工制种杂交种中棉所52和保持系9708B。其中不育系未本9708A和3个三系杂交种组合中棉所83、CRI 09-1, CRI 08_2在以marker为标准的315bp处有特异性条带。
图2 1-9分别为恢复系亲本9708R，不育系亲本9708A，恢复系亲本中恢46，三系杂交组合中棉所83，CRI 09-1，CRI 08_2，人工制种杂交种中棉所47，人工制种杂交种中棉所52和保持系9708B。其中两个恢复系亲本9708R、中恢46和3个三系杂交种组合中棉所83、CRI 09-1、CRI 08-2 在以 marker 为标准的 400bp (A,以 NAU3938 引物对(SEQ ID N0.4和5)进行扩增)和280bp (B,以NAU6466引物对(SEQ ID N0.6和7)进行扩增)处有特异性条带。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法
1.DNA 提取
含哈克尼西棉不育胞质的不育系亲本9708A(配组中棉所83的不育系)、哈克尼西棉不育胞质恢复系亲本9708R、中恢46 (CGMCC5166)、保持系9708B(不育系9708A的保持系)、含哈克尼西棉不育胞质的不育系亲本及其相应恢复系亲本配制的3个三系杂交种组合中棉所83 (审定编号:晋审棉2011003)、CRI 09-1 (不育系ZBA (CGMCC5168)和中恢46配组)>CRI 08-2 (不育系ZBA和中恢80 (CGMCC5167)配组)和2个非三系杂交种(中棉所47 (审定编号:国审棉2004001)、中棉所52 (品种权授权号:CNA20050668.4))材料的种子去壳，粉碎后转入2ml的离心管中；加入ΙΟΟΟμ IDNA提取液，漩涡混匀后，65°C水浴30min，间隔IOmin左右轻摇下；水浴结束后，加入800 μ I苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)，上下颠倒混勻至不分层(动作轻缓时间充分)，12000rpm离心IOmin ;吸取上清液(约800 μ I)转移到另一 2ml离心管 中，加入2 μ I RNase酶(10mg/ml),混勻后37°C水浴30min ;取出后加入1000 μ I的苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24: I)，上下颠倒混匀至不分层(动作轻缓时间充分)，12000rpm离心IOmin ;用剪口枪头吸取上清液转移(约700 μ I)到另一 2ml离心管中，加入0.7倍体积(500 μ I)异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后(约30min)，加入200 μ I ddH20,温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/l.! 1，_20°C保存备用。
其中，DNA抽提液:0.05M Tris-Cl, 0.0lM EDTA，2% SDS，I % PVP，0.5 % 山梨醇，0.705M NaCl，调整PH值为8.0，高压灭菌；使用前加入I % β-巯基乙醇。
2.SCAR 标记
将上述DNA 样品 I μ I 与 19 μ I PCR 反应液(10 XPCR Buffer2.0 μ 1，IOmM dNTPs0.4 μ l,25mM MgCL2L 6 μ I, IOmM SCAR 引物对各 1.0 μ 1，5U/μ I TaqDNA 聚合酶 0.2 μ 1，ddH2012.8μ I)混合，进行 PCR反应:94°C预变性 3min，94°C变性 30s，59°C退火30s，72°C延伸Imin, 25个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
配制1%琼脂糖凝胶，将10μ I PCR产物加入凝胶点样孔中，6伏特/厘米的电压进行稳压电泳30分钟；取出凝胶，放入I μ g/ml溴化乙锭(EB)溶液中，染色15分钟；放入凝胶成像系统，在254nm紫外光下,记录样品DNA条带,结果如图1所示。不育系亲本9708A和3个三系杂交种中棉所83、CRI 09-UCRI 08-2能扩增出315bp的特异条带，2个恢复系亲本、保持系和2个非三系杂交种没有扩增产物。
3.SSR 标记
SSR:将上述 DNA 样品 I μ I 与 9μ I PCR 反应液(10XPCR Bufferl.0 μ 1，IOmMdNTPs 0.2 μ l,25mM MgCL20.8 μ I, IOmM SSR 引物对各 0.5 μ 1，2U/μ I TaqDNA 聚合酶0.2 μ 1，ddH20 5.8 μ I)混合，进行 PCR 反应:95°C预变性 2min，94°C变性 30sec，55°C退火45sec，72°C延伸 45sec，30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保存。
扩增结束后，在扩增产物中加入2 μ I溴酚蓝混匀，加样与6%的聚丙烯酰胺凝胶中，在IXTBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为:220伏，电流:164毫安，时间:50分钟。电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下:固定液(95%乙醇40ml+100%乙酸2ml+358ml蒸馏水)中固定10分钟；染色液(0.6g硝酸银+300ml蒸馏水)中染色12分；用蒸懼水快速洗两遍，在显色液(6g氢氧化钠+5ml甲醒+3ml 0.2%硫代硫酸钠(最后力口)+400ml蒸馏水)中显色约5分钟，直`至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液(3g碳酸钠+400ml蒸馏水)中终止反应。结果如图2所示。2个恢复系亲本9708R、中恢46和3个三系杂交种中棉所83、CRI 09-UCRI 08_2分别以NAU3938引物对(SEQ ID N0.4和5)和以NAU6466引物对(SEQ ID N0.6和7)进行扩增，两对引物分别在400bp (NAU3938)和280bp(NAU6466)位置有特征带，不育系、保持系和2个非三系杂交种不能扩增得到相应特征带。
因此，利用SCAR引物对和两对SSR引物对对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的三系亲本、三系杂交种和非三系杂交种的鉴定结果表明，含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的不育系亲本、恢复系亲本和3个三系杂交种能很好的被SCAR引物对和SSR引物对检测至丨J，从而确定其为真三系杂交种。
实施例2本发明的分子鉴定方法的应用
利用筛选出的SCAR和SSR引物对含哈克尼西棉不育胞质的3个不育系母本9708A、DBA (ffu Jianyong等，2011，中棉所)、ZBA和3个恢复系父本9708R、中恢46、中恢80配制的9个三系杂交组合进行鉴定，首先利用SCAR引物(SEQ ID N0.2和3)对9个杂交组合进行鉴定，扩增结果表明所有的杂交组合在以marker为标准的315bp处有含哈克尼西棉不育胞质母本的特异性条带，然后进一步以NAU3938引物对(SEQ ID N0.4和5)和以NAU6466引物对(SEQ ID N0.6和7)对9个杂交组合进行扩增，在以marker为标准的400bp (NAU3938)和280bp (NAU6466)位置处分别能检测到恢复系父本的特异性条带。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保 护范围。
序列表〈110>中国农业科学院棉花研究所<120>含哈克尼西棉不育胞质的棉花三系杂交种的分子鉴定方法〈130〉KHPl1112806.0<160>7<170>PatentIn version 3.3<210> I〈211〉 315〈212> DNA〈213〉含哈克尼西棉不育胞质的棉花〈400〉 Iaagtggccgc ccttgctcaa tttgggtcag accttgatgc tgcgactcag gcattactca 60atagaggtgc aaggcttaca gaagtaccga aacaaccaca atattcacca ctgccaattg 120aaaaacaaat tcccaaaaag aaaaaatgtc cgtcgttccg ctttttagga attttttctt 180ttttcctaaa aatcctcatt ttgttttggg tcctatattc catcaaccat gaccttttcc 240ttgtggcttt ttgcgatgag gacgtggggg gtgtagatgc tacgggtgct tctacttcag 300gggcacacac aaacc315<210> 2〈211〉 23〈212> DNA〈213〉人工序列〈400〉 2aagtggccgc ccttgctcaa ttt23<210> 3<211> 22〈212> DNA<213>人工序列〈400〉 3ggtttgtgtg tgcccctgaa gt22<210>4〈211〉20〈212>DNA〈213〉人 工序列


本发明属于生物技术领域，涉及棉花三系杂交种后代真实性的分子鉴定方法。本发明采用SSR标记和SCAR相结合的方法对含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质的棉花三系材料及其三系杂交种后代进行了分子水平的多态性检测。该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花三系杂交种真实性的室内鉴定。