专利名称：一种受精卵胞质内注射dna生产转基因水牛的方法一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法技术领域本发明属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。具体是一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。动物转基因技术(Animal Transgenic Technology)是借助基因工程技术将外源基因导入受体动物基因组内，并能稳定表达且能将导入的外源基因稳定遗传给后代的技术。其主要特点是能人为有目的地改变动物的遗传结构，而赋予转基因动物新的表型特征。水牛是我国南方的一种极具开发前景的重要家畜，因其适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，而倍受人们关注与重视。 然而，目前我国水牛的品种的产奶量和繁殖率低，制约水牛奶业的发展，急需应用胚胎工程技术对其进行品种改良。转基因技术的出现，为动物的品种改良和新品种的培育提供了一条新的途径。与其他转基因技术相比，受精卵胞质内注射DNA转基因技术是将携带有外源基因的质粒DNA直接注入到受精卵的胞质中，以生产转基因动物。其具有步骤简单、容易操作，胚胎成活率高，且成本较低等优点，使转基因动物的培育过程大大简化。为此，本发明通过受精卵胞质内注射DNA技术体外生产水牛转基因胚胎，并结合胚胎移植技术建立一种生产转基因水牛的新方法。这为转基因动物的生产提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。本发明通过以下技术方案解决上述技术问题一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法，包括如下步骤(1)水牛受精卵的制备从屠宰场收集的水牛卵巢上抽取的卵母细胞经体外成熟培养24h后进行体外受精(IVF)，IVF后7 他，用吸管轻轻反复吹打使粘附于卵母细胞周围的精子脱落，再在50倍的体视显微镜下选择排出第二极体的受精卵，以进行受精卵显微注射DNA，(2)受精卵胞质内注射DNA制作水牛转基因胚胎将携带有增强绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的转基因载体(pEGFP-Nl)质粒DNA通过显微注射的方法直接注入到IVF后7 8h的受精卵胞质中，注射的质粒DNA浓度为20μ g/ml，注射量为15 30pL，注射后的水牛受精卵置于颗粒细胞单层共培养6 7d后，在荧光显微镜下检测发育到囊胚的EGFP表达情况，筛选获得水牛转基因胚胎，25%转基因胚胎发育至囊胚阶段，63%的囊胚表达EGFP，(3)转基因水牛的生产将挑选出表达EGFP的水牛转基因囊胚移植到自然发情或同期发情处理的受体母水牛的子宫角中，每头母牛移植2枚胚胎，受体水牛经妊娠足月后产下2头犊牛。分别取2头犊牛耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到用该方法生产的水牛犊耳部组织均表达有EGFP标记基因。
本发明的突出优点在于
采用本发明的方法，成功生产了转基因水牛胚胎，25%转基因胚胎发育至囊胚阶段，63 %的囊胚表达EGFP，经过胚胎移植后有1头受体水牛获得妊娠到期并产下2头犊牛，2 头都存活，分别取2头犊牛的耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定， 检测到用该方法生产的水牛犊耳部组织明显均表达有EGFP标记基因。


图1是本发明获得的表达有EGFP的常光下的水牛转基因囊胚。
图2是本发明获得的表达有EGFP的荧光灯下的水牛转基因囊胚。
图3是本发明获得的转基因水牛犊耳部组织的PCR检测结果(1、Marker ；2、①号转基因水牛；3、②号转基因水牛；4、阴性对照)。
图4是本发明获得的转基因水牛犊耳部组织的Southern Blot检测结果(1、①号转基因水牛；2、②号转基因水牛)。
图5是本发明获得的表达有EGFP的转基因水牛。

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所述的一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法，包括如下步骤
(1)水牛受精卵的制备
从屠宰场收集水牛卵巢，置于含有K+、Ca2+、Na+、Mg2+的；35 37°C生理盐水的保温瓶内，4h内送到实验室，用37°C的生理盐水洗净，剪掉卵巢周围的悬韧带，用带有12号针头的IOml注射器抽取直径为2 6mm的卵泡中卵母细胞。在实体显微镜下挑选出细胞质均勻，并有完整致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合物(COCs)，用洗卵液清洗两遍后，放入含1. 5ml水牛体外成熟液(TCM-199+5% 0CS+0. 1 μ g/ml FSH)的30 X IOmm玻璃平皿中，在 38. 5°C,5% CO2和最大饱和湿度的培养箱中体外成熟培养Mh。
体外成熟培养后的水牛COCs用200 μ L的微量加样器轻轻反复抽打使卵母细胞周围的部分卵丘细胞脱落，然后将具有第一极体、细胞质均勻的成熟卵母细胞选出，移到预平衡池的培养液中，置于培养箱中待用。
本实验所用水牛冷冻精液均购买于广西畜禽品种改良站。将细管冷冻精液在37°C 水浴中解冻，悬浮于平衡的受精液中30min。吸取含活精子的上清液，离心5min(1600 转/min)，去上清，收集的精子留待体外受精用。将已去掉卵丘细胞的卵母细胞移入受精液中洗涤两次，并转移至覆盖石蜡油的30 μ 1受精液滴中，每滴以10 15个卵母细胞为宜。 加入一定量经上述获能处理的精子，使精子在受精液滴中的最终浓度约为1 X IO6个精子/ ml。最后，将其放入CO2培养箱中进行IVF。将IVF后7 他的受精卵取出，用200μ L的微量加样器轻轻反复吹打使粘附于卵母细胞周围的精子脱落，再挑选排出第二极体的受精卵，以进行DNA显微注射配用。
(2)受精卵胞质内注射DNA制作水牛转基因胚胎
首先，取一个60mm培养平皿的皿盖，在皿盖的中央根据实验需要做4个10 μ 1的 PBS液小滴，然后用石蜡油盖过小滴，防止PBS液蒸发。将其中一滴PBS液吸掉，以制备好的DNA代替。在另外一滴PBS液加入15 20个准备好的受精卵开始DNA的显微注射。注射的质粒DNA浓度为20μ g/ml，注射量为15 30pL。在DNA滴内用注射管吸取一定量的 PEGFP-Nl质粒DNA，然后转移至放置卵母细胞的微滴，用固定针吸住一个体外受精后的水牛胚胎，置其极体于6点钟的位置，然后从3点钟方向进针，将15 30pL DNA液缓慢注入胚胎的卵胞质并反复轻轻回吸胞质使之与DNA充分混合。随后，撤出注射针，并将卵母细胞从固定管释放。完成操作后，把注射DNA后的受精卵用培养液洗2遍后，置于颗粒细胞单层微滴中，在38. 5°C,5% CO2最大湿度的培养箱中进行体外培养。培养液每隔48小时更换一次。
(3)转基因水牛的生产
注射DNA后的水牛受精卵在体外培养6 7d后，将发育至囊胚期的胚胎在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，挑选表达EGFP的转基因囊胚装入胚胎移植管中，采用非手术法将胚胎移植到自然发情或同期发情处理的受体母牛的子宫角中，每头母牛移植2枚胚胎。3个月后检测受体水牛妊娠情况。其中，1头受体母牛怀孕至足月后分娩，生下2头水牛犊，2头均成活。分别取2头犊牛耳部组织进行PCR和Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到生产的水牛犊耳部组织表达有EGFP标记基因。
实施例
试验共将6枚新鲜或冷冻/解冻的表达有EGFP基因的水牛受精卵胞质内注射DNA 的转基因囊胚分别移植给3头受体水牛的子宫角中，每头受体牛移植2枚囊胚，其中有1 头受体水牛获得妊娠，经过妊娠足月后，产下2头牛犊，均成活。取其耳部组织进行PCR和 Southern Blot等分子生物学技术鉴定，检测到生产的水牛犊耳部组织均表达有EGFP标记基因。这一实施例证明，本发明利用受精卵胞质内注射DNA技术生产转基因水牛的方法是可行的。


一种受精卵胞质内注射DNA生产转基因水牛的方法。体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精IVF后，将携带有增强绿色荧光蛋白EGFP基因的转基因载体pEGFP-N1质粒DNA直接显微注射到水牛受精卵胞质中，制作水牛转基因胚胎，然后在倒置荧光显微镜下挑选表达EGFP的水牛转基因囊胚，移植到受体水牛子宫角中，获得转基因水牛。采用本发明的方法，成功生产了表达EGFP的水牛转基因囊胚，囊胚阳性率达到63％，胚胎移植后成功获得2头表达EGFP基因的转基因水牛。应用本发明培育转基因水牛，操作简单，成本较低，使转基因动物的培育过程大大简化，这为转基因动物的生产提供了一个重要的技术基础，具有重要的理论意义和实际意义。