Hnf1b基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法[0002]肝细胞核因子I β (hepatocyte nuclear factor I β , HNFI B),也称转录因子2(transcription factor2，TCF2)。该基因位于 17 号染色体 17ql2 上，位于 36046433到36105095碱基对之间。HNFlB基因在肾发育中发挥着作用，对胚胎胰腺的发育有调节作用，是对胰腺细胞形成和维持血糖稳态具有重要作用的转录因子。目前大量研究表明，HNFlB基因突变将导致肾囊和糖尿病综合症，即第五型青少年起病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of theyoung5, M0DY5),表现为早发糖尿病、肾脏、胰腺和生殖管等各种组织器官发育异常。HNFlB基因的突变也会导致非胰岛素依赖型糖尿病和11型遗传前列腺癌的发生，在其它类型的癌症中，也发现了这个基因的表达发生了改变。[0003]目前，HNFlB基因突变检测方法主要有=Illumina光纤微珠芯片技术、荧光定量PCR技术、SNPlex Genotyping System技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-TOF-MS ),虽然Illumina光纤微珠芯片技术是高灵敏度和精确性的高通量检测系统，但是自动化程度低，手工操作比较多，难以满足实际应用的需要，荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种突变类型，SNPlexTM System技术对单核苷酸多态性位点(SNPs)所在序列特异性要求较高，不能随意地分析所选择的SNPs，难以应用于临床检测诊断，而且该方法操作比较复杂，不能满足实际应用的需要。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。
[0004]本发明的目的之一是提供HNFlB基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测HNFlB基因五种常见基因型A12057G、C8941T、G35118A、C3784A和G13582A的野生型和突变型。[0005]实现上述目的的技术方案如下:[0006]一种HNFlB基因突变检测液相芯片，包括有:
[0007](A).针对HNFlB基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A12057G位点的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，针对C8941T位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，针对G35118A位点的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16，针对 C3784A 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 G13582A 位点的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对A12057G位点的SEQ ID N0.31及SEQIDN0.32，针对 C8941T 位点的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，针对 G35118A 位点的 SEQ IDN0.35 及 SEQ ID N0.36，针对 C3784A 位点的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38 ;和 / 或针对G13582A 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE弓丨物为:针对A12057G位点的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11组成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12组成的序列，针对C8941T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14组成的序列，针对G35118A位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16组成的序列，针对C3784A位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18组成的序列；和/或针对G13582A位点的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于HNFlB基因突变检测的特异性引物。
[0013]具体技术方案如下:
[0014]用于HNFlB基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为:针对A12057G位点的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，针对 C8941T 位点的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，针对 G35118A 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 C3784A 位点的 SEQ ID N0.17 及SEQ ID N0.18 ;和 / 或针对 G13582A 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的HNFlB基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的HNFlB基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，5种突变位点检测可通过一步PCR即可完成5条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可 大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

[0020]实施例1HNFlB基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]三、ASPE引物
[0022]针对HNFlB 基因五种常见基因型 A12057G、C8941T、G35118A、C3784A 和 G13582A 的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1HNFlB基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特异性引物序列)