专利名称：产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法慢性淋巴细胞白血病是一种相对少见的恶性肿瘤，大约占所有癌症的0. 8%，它是一种影响B淋巴细胞系的恶性肿瘤，其特点是产生大量不成熟的淋巴细胞，这些细胞在骨髓内聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能够通过血液在全身扩散，导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。慢性淋巴细胞白血病是一种进展缓慢、惰性的肿瘤，患者通常保持无症状达数月至数年。发病原因仍未明确。慢性淋巴细胞白血病慢性淋巴细胞白血病可以发生于任何年龄的人群，但以60岁以上的人群最常见，男性比女性更常见。 因为慢性淋巴细胞白血病进展比较缓慢，所以很多病人没有症状，尤其在早期的病人，随着疾病的进展，白血病破坏骨髓正常造血功能，浸润器官，引起了明显但非特异的症状。包含有贫血，表现为乏力、头晕、面色苍白或活动后气促等；反复感染且不易治好，主要由于缺少正常的白细胞，尤其是中性粒细胞；出血倾向容易出血、出血不止、牙龈出血、大便出血及月经不规则出血等，由于血小板减少引起；浅表淋巴结肿大、不明原因的消瘦及盗汗等。慢性淋巴细胞白血病是一种惰性的淋巴系统肿瘤，患者可以维持无症状长约数月至数年，不需要治疗。但对于某些出现症状等需要治疗，为了进一步研究可以用于治疗或预防或抑制慢性淋巴细胞白血病药物，在研发过程中进行药物试验、药效试验时，均需要大量的慢性淋巴细胞白血病细胞作为标本。
本发明所要解决的技术问题是提供一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法，包括下述步骤 1)准备受过辐射的巨噬细胞分散在细胞培养器中； 2)从慢性淋巴细胞白血病病人的血样中分离出外周血液单核细胞，将分离的外周血单个核细胞置于完全培养基中冲洗，冲洗后置于离心管中以1500RPM离心3分钟； 3)将离心后的外周血单个核细胞重新分散于完全培养基中形成2*106个外周血单个核细胞/ml的完全培养基，该完全培养基包含50 V- g/ml的胰岛素-反义c_myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸和5 u g/ml环孢菌素A ； 4)向步骤3)的完全培养基中添加疱疹病毒悬浮液； 5)在含5%二氧化碳的恒温箱中，37°C下培养细胞4小时；
6)保温后，将疱疹病毒感染后的细胞以3500-4000个细胞/ml重新分散在包含有18 u g/ml胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的完全培养基中，然后分散于包含受过辐射的巨噬细胞的细胞培养器中；
7)在含5%二氧化碳的恒温箱中，37°C下培养细胞；
8)每周一次,从每格中取出100V- I培养基,再添加100 V- I包含5 V- g/ml胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的新鲜培养基；
9)在感染后2-4周，用ELISA收集细胞培养器中的抗体产品，然后用杂交瘤细胞融合法产生并克隆出源于慢性淋巴细胞白血病细胞的杂交瘤细胞株。具体地，所述步骤I)中的巨噬细胞为J774A. I细胞。 所述步骤I)中受过辐射的辐射剂量为4200rad。所述步骤9)中杂交瘤细胞融合法的具体步骤为在感染后2-4周后，对HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒结合和中和活性筛选抗体，选择呈阳性的细胞培养器中的细胞与杂交瘤细胞株融合，经有限稀释后获得杂交瘤细胞株。本发明的有益效果是本发明提供一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法，该方法可以获得大量的慢性淋巴细胞白血病细胞作为研究标本，在研究用于治疗或预防或抑制慢性淋巴细胞白血病药物时用于药物试验或药效试验。并且，可以通过研究获得的杂交瘤细胞株研究或者提纯抗体，可以对于制备防治慢性淋巴细胞白血病细胞的药物或者抗体或者生物片段作出进一步研究。

对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不仅限于下述实施例。本实施例适用于产生无限克隆的B慢性淋巴细胞白血病细胞的方法具体步骤为 I、在疱疹病毒感染的24h前，准备受过辐射(辐射剂量为4200rad)的巨噬细胞(本实施
例选用的巨噬细胞为J774A. I细胞)分散在细胞培养器中，培养器为圆底薄板，受过辐射的巨噬细胞并以50000细胞每格(IOOug/格)分散在96格薄板上。2、从慢性淋巴细胞白血病病人的血样中分离出外周血液单核细胞，将外周血单个核细胞置于完全培养基中，取300g置于15ml锥形离心管中，以1500RPM离心3分钟。3、将离心后的外周血单个核细胞重新分散于完全培养基中，形成的细胞浓度为2*106个细胞/ml，该完全培养基包含50 u g/ml的胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸和5 u g/ml环孢菌素A。4、添加疱疹病毒悬浮液
5、在含5% 二氧化碳的恒温箱中，37°C下培养细胞4小时。6、保温后，将细胞以3500-4000个细胞/ml重新分散在包含有18 y g/ml的胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的完全培养基中；
7、以3500-4000个细胞/格(100 iil/格)分散在96格包含受辐射的J774A. I细胞的薄板上。8、在含5% 二氧化碳的恒温箱中，37°C下培养细胞。9、每周一次，从每格中取出100 ill培养基，再添加IOOiU包含5 ii g/ml胰岛素-反义c-myb-硫代磷酸寡脱氧核苷酸的新鲜培养基。
10、当EBV病毒感染的细胞生长到足够多(培养3周后)，用ELISA收集细胞培养器中的抗体产品，对HIV-I、丙型肝炎病毒和流感病毒结合和中和活性筛选抗体，选择呈阳性的细胞培养器中的细胞与杂交瘤细胞株融合，经有限稀释后可产生并克隆出源于慢性淋巴细胞白血病细胞的能产生IgM的杂交瘤细胞株。上述方法中，J774A. I为小鼠巨噬细胞株。一般一个巨噬细胞株(例如啮齿目动物的巨噬细胞株)用作饲养细胞，实验证明，J774A. I巨噬细胞株产生适合杂交瘤细胞的生长和克隆的生长因子。由J774A. I细胞制备的条件培养基已经广泛用于强化巨噬细胞的生存能力，也同样显示J774A. I细胞株作为饲养细胞与T细胞、EBV病毒感染的B细胞联合培养有助于在体外清除凋亡的细胞。根据上述方法，巨噬细胞株受到辐射以阻止饲养细胞的过度生长，最佳的Y辐射量为4200 Rad，然后受到辐射的细胞分散在培养器中(例如，当用96孔板时，大约每孔可分散50000个细胞(大约100 1/孔))。使用现有技术手段，可以使B慢性淋巴细胞白血病细胞的EBV病毒感染生效。例 如，可以从慢性淋巴细胞白血病病人的血样中分离出外周血液单核细胞，然后这些细胞在完全培养基中冲洗，然后悬浮在包含例如环抱霉素A的完全培养基中，加入环抱霉素A来抑制任何EBV病毒B细胞特异性细胞毒素T细胞反应，通过测定EBV病毒B细胞的刺激潜力，实验发现，5 y g/ml为环孢霉素A较好的浓度范围。根据上述方法，产自B慢性淋巴细胞白血病细胞的有治疗作用的抗体(例如抗HIV抗体、抗丙型肝炎抗体和抗流感抗体)或可以配制为一个成分(例如一种药品成分)。上述方法中，完全培养基的制备需要用到的物质为1) 15. 2%热灭活胎牛血清(FCS)、2) 1% 非必需氨基酸(NEAA)、3) ImM 丙酮酸钠、4) 15mM HEPES 缓冲液，pH 为 7.3、5)2mM L-谷氨酰胺(Glu)、6) 100 U/ml 青霉素 G (Pen)
7)IOOu 1/ml 链霉素(Strep)。具体制备方法为
I、解冻一瓶FCS (500ml/瓶，-200C )，为了热灭活在56°C下保温30分钟。2、冷却，加入 31ml Glu+ Pen/ Strep (100X，IOOml/瓶，_2(TC )。3、将FCS-抗生素混合物分装在两个试管中，每个试管50ml，在_20°C冷冻。4、加入 IOOmlFCS-抗生素混合物于一瓶 RPMI 1640 中(500ml/ 瓶，4°C)。5、向瓶中加入 6.2ml HEPES 缓冲液(100X，IOOml/瓶，4°C )。6、加入 6. 2ml 丙酮酸钠(100X，100ml/瓶，4°C )。7、加入 6.2ml NEAA (100X，100ml/瓶，4°C )。8、用0. 22 ii m的滤纸过滤完全培养基。9、总 CM :618. 6ml。如上所述，便可较好的实现本发明。


本发明公开了一种产生无限克隆的慢性淋巴细胞白血病细胞的方法。该方法包括下述步骤1)准备受过辐射的巨噬细胞分散在细胞培养器中；2)外周血单个核细胞置于完全培养基中，离心；3)重新分散于完全培养基中；4)添加疱疹病毒悬浮液；5)培养；6)保温后，将细胞重新分散在完全培养基中，然后分散于包含受过辐射的巨噬细胞的细胞培养器中；7)培养细胞；8)每周一次，更换新鲜培养基；9)在感染后2-4周，然后用杂交瘤细胞融合法产生并克隆出源于慢性淋巴细胞白血病细胞的杂交瘤细胞株。本发明可以通过研究获得的杂交瘤细胞株研究或者提纯抗体对制备防治慢性淋巴细胞白血病细胞的药物或者抗体或者生物片段作出进一步研究。