专利名称：一种生产体细胞克隆牛囊胚的方法哺乳动物体细胞克隆是指将体细胞核移入去核受体细胞(成熟卵母细胞或受精卵)中，新的重构胚按供体的遗传信息重新进行编程、分裂、分化和发育。目前较为流行的体细胞核移植方法是手工克隆法和显微操作法。 克隆技术本身的效率受各个环节的影响，包括卵母细胞的去核、体细胞注入卵母细胞、去核卵母细胞与体细胞的融合、重构胚的激活、重构胚的体外培养。在克隆过程中成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节，要求去得完全，又尽可能地减少对细胞质的损伤。手工克隆法去核采用切割法，其对细胞损伤大，死亡率较高；显微注射法则将操作针刺入卵母细胞质中，对细胞骨架和膜的破坏性较强，而且去核时吸走的、包含染色体的细胞质一般占卵母细胞总体积的四分之一左右，造成卵母细胞质的大量丢失。另外，还有荧光引导去核法、盲吸法等。荧光引导去核法，由于使用荧光照射对卵母细胞有一定的损害，有报道称〔Critser等，1986〕，在突光照射下照射时间不能超过20秒,否则发育能力下降或丧失。盲吸法是指用McGrath和Solter的方法〔McGrath等，1983〕，即从靠近卵母细胞排放第一极体的部位将细胞膜内的核物质和部分细胞质一起吸出。因为除小鼠和兔以外，其它大动物的成熟卵母细胞中期板在显微镜下无法看到，所以去核就是盲目的。由于颗粒细胞的干扰或第一极体退化或卵子老化，使得染色体位置与第一极体偏离，所以盲吸法去核并不完全成功。融合是动物克隆技术过程中另一个重要环节，常用方法是电刺激。电融合的原理就是利用高压电场在卵细胞膜和供核细胞膜上同时击出一些微孔，这样紧贴在一起的卵细胞膜和供核细胞膜就通过这些微孔发生融合，最终将供核引入去核卵细胞质内。显微注射法中融合率低，平均为70-80%，融合的失败导致胚胎的丢失和克隆效率的降低。体细胞克隆技术在多个品种的家畜中都获得成功，时至今日全世界已有数千头体细胞克隆牛诞生。尽管如此，牛的体细胞克隆效率仍然很低，因此，从体细胞克隆的关键环节入手，开发一种高效率的体细胞克隆牛囊胚的生产方法具有重大的意义。
本发明要解决的技术问题为提供一种高效率的生产体细胞克隆牛囊胚的方法。本发明所提供的生产体细胞克隆牛囊胚的方法，包括以下步骤(I)以牛耳缘成纤维细胞为核移植供体细胞；(2)将牛卵母细胞进行体外成熟培养，将体外培养成熟并排出第一极体的卵母细胞作为核移植受体细胞；(3)将步骤(2)所得卵母细胞挤压去核并去除透明带；(4)先将一枚步骤(3)所得卵母细胞与一枚供体细胞用PHA法黏附形成复合体，施以交流电，再将另一枚步骤(3)所得卵母细胞黏附在上述复合体上，使其排列顺序为卵母细胞-供体细胞-卵母细胞；最后施以直流电对其进行融合，构建重构胚胎；(5)所述重构胚胎激活后，进行体外培养得克隆囊胚。上述生产方法中，所述牛耳缘成纤维细胞的代龄为5-15代，在核移植前经过血清饥饿处理或不经过血清饥饿处理。所述牛卵母细胞是由直径为2_8mm的牛卵泡中采集的、由完整致密的卵丘细胞包裹的卵母细胞。上述方法中，步骤(2)所述体外成熟培养的培养基的制备方法为，在TCM199培养基中添加体积百分比为10%的FBS, 0. 01IU/ml的FSH, 0. 01IU/ml的LH和I y g/ml的E2。步骤(3)所述挤压去核是在显微镜下用拔尖的去核针挑破第一极体处的透明带，并将第一极体及其下方的胞质挤除；所述去透明带是用链酶蛋白酶消化去除。步骤(4)所述电融合与步骤(5)所述重构胚胎激活的间隔时间为l_3h，优选间隔时间为2h。发明人比较了电融合与激活的时间间隔分别为lh、2h和3h的无透明带克隆牛胚胎的卵裂率和囊胚率，结果如表I所示。所述卵裂率的计算公式为卵裂率=重构胚卵裂数/融合后重构胚数；所述囊胚率的计算公式为囊胚率=囊胚数/卵裂胚胎数。下同。表I、电融合与重构胚激活的时间间隔对卵裂率和囊胚率的影响本发明公开了一种生产体细胞克隆牛囊胚的方法。该方法以牛耳缘成纤维细胞为核移植供体细胞，以体外培养成熟的牛卵母细胞为核移植受体细胞，将卵母细胞挤压去核并去除透明带后，与供体细胞以卵母细胞-供体细胞-卵母细胞的排列方式黏附并进行电融合得重构胚胎，重构胚胎激活后进行体外培养得克隆囊胚。该方法可提高克隆牛囊胚的生产效率。