专利名称：川西云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法云杉属(Picea dietr)植物全世界约有40种，主要分布在北纟韦50° 60°的寒温带或冻原地带，少数分布在温带或亚热带的湿冷高山上，即多数种呈环极式分布，而在我国和美国可分布到北纬30°附近，是低热量地区的重要建群树种。云杉属树种单位面积年生长量高，木材品质好，用途广，成为西欧、北欧、波罗的海沿岸国家、俄罗斯和加拿大的重要工业用材树种。我国云杉属有17种和9个变种，是世界上该属种类最多的地区，主要分布在东北、华北、西北、西南等高山地带，是我国高山区的重 要造林树种和最佳纸浆材树种。川西云杉(Picea balfouriana)又名西康云杉、康藏云杉、包氏云杉。川西云杉林是四川的主要森林类型，为青藏高原东部地区的特有森林植物群落，其不仅分布辽阔，且资源丰富，是重要的用材林树种。同时，它还是川西高原地区组成森林草原过渡地带的连缘森林，对防止草原南移、森林线下降及涵养水源、保持水土和长江源头地区的防护都有极为重要的作用。体细胞胚胎发生是细胞工程中植株再生的重要途径之一，可作为遗传转化的受体系统，同时也是为研究全能性细胞分化及其形态而建成的理想试验体系。在应用上，体细胞胚胎发生是一种有效的大规模无性繁殖方法。川西云杉天然林生长较慢，种子成熟率很低，造成繁殖和品种选育的很大困难，且苗期和幼林期生长慢，严重影响着遗传改良进程，特别是遗传评价进程。而通过体细胞胚胎发生可以大大缩短苗期，因此川西云杉体细胞胚胎发生技术会成为能否加速育种的关键之一。若能开发出一种川西云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，克服现有技术存在的不足，是非常有必要的。
本发明的目的是提供一种川西云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法。本发明提供的一种川西云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，包括采集川西云杉自由授粉无性系球果，分离出未成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养包括四个阶段胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚萌发阶段。其中，分离出未成熟合子胚进行体胚发生培养是在无菌条件下进行的。未成熟合子胚是指球形期至子叶期的未成熟合子胚。其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段和胚性愈伤组织增殖阶段均采用1/2LM基本培养基，其附加激素均分别为0. 55^2. 2mg/L的2，4-氯化苯氧乙酸(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid,简称 2，4_D),0 I. lmg/L 的 6_ 节基氨基嘌呤(benzylaminmopurine,简称 6-BA)和 0 0. 44mg/L 的 6-糖基氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine,简称 KT)。进一步地,所述2，4-D均优选2. 2mg/Lo所述6-BA在诱导阶段优选0. 55^1. Img/L，更优选I. lmg/L ；6-BA在增殖阶段优选0. 8^1. lmg/L,更优选0. 8mg/L。所述KT在诱导阶段优选(T22mg/L，更优选0. 22mg/L ；KT在增殖阶段优选(TO. 44mg/L,更优选Omg/L。其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段和胚性愈伤组织增殖阶段1/2LM基本培养基中附加激素中，2，4-D的用量为6-BA的2倍以上，优选2倍。其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段和增殖阶段的培养基中，均还包括浓度为1%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺，lg/L的酶解酪蛋白和0. 2%的植物凝胶。本发明所述方法，在胚性愈伤组织增殖阶段之后(体细胞胚成熟阶段之前)，还包括胚性愈伤组织的状态调整阶段，为采用1/2LM基本培养基，不添加任何激素进行培养7 天。其目的和作用是使胚性愈伤组织由增殖状态向分化状态转换。其中，所述体细胞胚成熟阶段采用1/2LM基本培养基，其附加12 20mg/L的丙烯基乙基巴比妥酸(脱落酸，abscisic acid，简称ABA)和(Tl%的活性炭。所述ABA优选为16 20mg/L，更优选16mg/L。活性炭优选为0. 4 0. 8%，更优选0. 4%。其中，所述体细胞胚成熟阶段的培养基中，还包括0. 6%的植物凝胶，6%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺和lg/L的水解酪蛋白。其中，所述胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段和体细胞胚成熟阶段的培养条件均为将培养基的PH值调至5. 8，121 °C、压力lOlkp，高温、高压灭菌20分钟，培养温度为24±1°C，黑暗条件培养。本发明所述方法，胚性愈伤组织诱导阶段和增殖阶段，以及体细胞胚的萌发阶段使用的激素浓度，能够起到很好的协同作用，最大程度地发挥其作用，对川西云杉胚性愈伤组织的诱导和增殖起到较优的效果，有利于维持胚性愈伤组织的胚性能力。其中，所述体细胞胚萌发阶段采用1/4LM基本培养基，其附加(T0. 25%的活性炭。活性炭优选0. 125 0. 25%，更优选0. 25%。其中，所述体细胞胚萌发阶段的培养基中，还包括谷氨酰胺500mg/L，2%蔗糖、lg/L水解酪蛋白和0. 4%的植物凝胶。其中，所述体细胞胚的萌发阶段的培养条件均为在24土 1°C，80 UEnT2s-1下光照培养16h。本发明所述的方法，在对未成熟合子胚进行体胚发生培养前，还包括对川西云杉自由授粉无性系球果进行消毒，然后在无菌的环境下取出未成熟合子胚。其中，所述消毒方式为利用75、5%的乙醇对川西云杉自由授粉无性系球果消毒15^20min,再用无菌水冲洗3 4次。优选利用95%的乙醇消毒对川西云杉自由授粉无性系球果15min,再用无菌水冲洗3次。进一步地，在消毒前还可以对川西云杉自由授粉无性系球果于4°C条件下冷藏(T30天。优选4°C条件下冷藏7天。经过冷藏和消毒处理的球果，会使得诱导率增加，污染率低于0. 1%。本发明中出现的浓度百分数“％”均指质量-体积浓度g/mL (IOOmL溶液里需要添加的克数)。本发明采用未成熟合子胚，尤其是利用球形期至子叶期的未成熟合子胚进行体胚发生培养，能够成功诱导出川西云杉胚性愈伤组织，优势是幼嫩的未成熟合子胚可以有效地提高诱导率。本发明提供的方法，是专门针对川西云杉天然结实率低，种子成熟率很低，苗期和幼林期生长慢，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的现状，寻找一种川西云杉优良无性系的体细胞胚胎发生与植株再生的技术。和现有技术相比，该方法大大缩短了苗期，天然结实率、种子成熟率和分化率以及萌发率均有提高。为在林业生产中大规模推广种植川西云杉提供了一种周期短，繁殖率高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的育苗方法，适用于川西云杉细胞工程快速繁殖技术体系，满足市场对川西云杉的需要。图I为川西云杉的未成熟合子胚。 图2为川西云杉的胚性愈伤组织。图3为川西云杉的成熟体细胞胚。图4为川西云杉的体细胞胚萌发的植株。实施例8体细胞胚的成熟阶段将实施例5 7得到的胚性愈伤组织，进行体细胞胚成熟培养。采用1/2LM基本培养基，附加的激素和活性炭分别为16mg/L的ABA，0. 4%的活性炭。此时培养基中的蔗糖浓度为6%，植物凝胶(Gelrite，Sigma)为0. 6%，水解酪蛋白替代诱导同增殖阶段的酶解酪蛋白，为lg/L，谷氨酰胺的量为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段和增殖阶段相同。平均每IOOmg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成143个成熟的子叶胚。得到的成熟体细胞胚如图3所示。
实施例9体细胞胚的成熟阶段将实施例5 7得到的胚性愈伤组织，进行体细胞胚成熟培养。采用1/2LM基本培养基，附加的激素和活性炭分别为16mg/L的ABA，0. 6%的活性炭。此 时培养基中的蔗糖浓度为6%，植物凝胶(Gelrite，Sigma)为0. 6%，水解酪蛋白替代诱导同增殖阶段的酶解酪蛋白，为lg/L，谷氨酰胺的量为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段和增殖阶段相同。平均每IOOmg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成129个成熟的子叶胚。实施例10体细胞胚的成熟阶段将实施例5 7得到的胚性愈伤组织，进行体细胞胚成熟培养。采用1/2LM基本培养基，附加的激素和活性炭分别为20mg/L的ABA，0. 8%的活性炭。此时培养基中的蔗糖浓度为6%，植物凝胶(Gelrite，Sigma)为0. 6%，水解酪蛋白替代诱导同增殖阶段的酶解酪蛋白，为lg/L，谷氨酰胺的量为500mg/L，其中ABA和谷氨酰胺均为过滤灭菌。且培养条件均与诱导阶段和增殖阶段相同。平均每IOOmg愈伤组织在这种分化培养基上可以形成106个成熟的子叶胚。转入上述成熟阶段培养基以后胚性愈伤组织开始分化，经过两个月的发育会依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚。在本发明改良培养基上，成功的调整了胚性细胞的生长状况，使得体细胞胚胎发生中最难的关键技术问题-畸形胚和不同步化的发生得到有效控制，且分化率高，平均每IOOmg愈伤组织可以形成106 143个成熟的子叶胚。在添加活性炭的成熟阶段培养基中形成的体细胞胚在形态上更接近其合子胚(由于体细胞胚胎发生具有两极性的特点，所以，成熟的子叶胚可以同时形成子叶和根，成为完整的幼苗，继而很好的解决了针叶树体细胞胚胎发生中生根难的问题)且分化时间要缩短一半，仅需40 50天。实施例11体细胞胚的萌发阶段将实施例8 10得到的体细胞胚继续进行萌发。使用1/4LM基本培养基，添加活性炭0. 25%，谷氨酰胺500mg/L，2%蔗糖、lg/L水解酪蛋白和0. 4%的植物凝胶(Gelrite, Sigma)。温度为 ZdilUOiiEnriV1 下光照培养 16h。由于体细胞胚胎发生具有两极性的特点，所以，成熟的子叶胚可以同时形成子叶和根，成为完整的幼苗，继而很好的解决了针叶树体细胞胚胎发生中生根难的问题。根据本实施例得到植株(如图4所示)的萌发率为22. 52%。实施例12体细胞胚的萌发阶段其他条件同实施例11，活性炭浓度分别为0、0. 1%、0. 125%、0. 2和0. 25 (同实施例11)，体细胞胚的萌发率如下表所示


本发明涉及一种川西云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，包括采集川西云杉自由授粉无性系球果，分离出未成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养包括四个阶段胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚萌发阶段。和现有技术相比，本发明方法大大缩短了苗期，天然结实率、种子成熟率和分化率以及萌发率均有提高。为在林业生产中大规模推广种植川西云杉提供了一种周期短，繁殖率高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的育苗方法，适用于川西云杉细胞工程快速繁殖技术体系，满足市场对川西云杉的需要。