专利名称：引导组织再生膜及其制备方法引导组织再生技术最早用于使在牙周病发展中所丧失的牙周组织再生和产生牙周新附着。其原理是用隔膜覆盖牙周骨丧失部位和裸露的牙根部位，利用隔膜的物理屏障作用，阻止牙龈上皮细胞和结缔组织的根向侵入生长，为牙周组织再生创造空间。不可吸收性和可生物吸收性的引导组织再生膜，在作为机械性隔离屏障上具有相似的组织学和临床修复效果。但以聚四氟乙烯为代表的不可吸收引导组织再生膜，由于其在体内不能自行降解，需二次手术取出，不仅增加了患者的痛苦，也加大了术后感染的可能性。而且，由于难以复合生物活性物质和抗生素等，不可吸收性膜只能起到单纯的屏障作用。生物可吸收引导组织再生膜的发展，全面改善了上述不足。具有优异生物学性能的天然生物可降解材料如胶原、明胶、壳聚糖等，具有良好力学性能的合成生物可降解材料如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚酰胺等，以及具有骨诱导生长能力的无机成分如纳米羟基磷灰石等，都已被用于生物可吸收引导组织再生膜的制备。但是，单组份、单层结构的膜材料，是无法满足引导组织再生膜要同时具有生物相容性、力学稳定性、骨诱导生成能力、上皮细胞和结缔组织阻隔性的要求，因此只有在结构和组成上存在梯度功能化变化的引导组织再生膜才能更好地满足临床要求。中国发明专利CN1216653C公开了一种用于引导组织再生的纳米晶羟基磷灰石/ 胶原/聚乳酸-羟基乙酸复合膜材料的制备方法，所制备的膜具有一面粗糙，一面表面光滑的结构特点。中国发明专利CN1319604C公开了一种双层复合胶原基引导组织再生材料及其制备方法，以胶原和透明质酸或其钠盐制备成具有致密层和疏松层结构的双层复合材料。中国发明专利CN100408115C公开了一种具有多孔结构的生物材料膜及制备方法，其特征是在医用聚酰胺成分或医用聚酰胺/纳米类骨磷灰石复合成分膜的两侧表面间以孔径渐变地分布有相互贯穿的孔，膜的一面是孔径为0. 01 30um的细小孔隙的致密面， 另一面是孔径为30 300um的大孔疏松面。这些膜材料疏松多孔的一侧可面向缺损区，有利于组织再生，致密的一侧可面向周围组织，阻止上皮细胞和结缔组织进入缺损区。虽然这样的膜结构以可满足引导组织再生膜的临床要求，但基于天然细胞外基质的纤维网络特性，从仿生观点出发，静电纺丝技术在制备多层结构的引导组织再生膜方面得到了应用。中国发明专利公开CN101584885A中，将一定比例的天然生物材料、可降解聚合物、纳米羟基磷灰石混合物溶于特定溶剂中，通过层层静电纺丝、以铝箔为接收器的方法制备了三层梯度复合膜，膜材料一面粗糙疏松，一面光滑致密。但是，在此发明专利公开中，由于电场强度的变化，层层静电纺丝制备的膜的厚度会受到限制；此外，以铝箔为接收器收集到的无纺纤维膜，虽然孔隙率高，但常因纤维堆积密度高抑制了细胞进入生长的效果，而且强度也十分有限。
本发明就是为了解决现有技术中存在的膜的厚度受到限制、细胞进入生长的效果不好及强度有限的技术问题，提供一种引导组织再生膜及其制备方法。为此，本发明提供一种引导组织再生膜，它具有层状结构，其排列顺序依次为纤维呈无规排布的无规排布纤维层、纤维呈平行排布的平行排布纤维层和纤维呈网格排布的网格排布纤维层，上述纤维层中都含有脂肪族聚酯。本发明优选的技术方案是无规排布纤维层还含有天然高分子；网格排布纤维层还含有天然高分子；网格排布纤维层还含有纳米羟基磷灰石；膜厚度为0. 05 2mm，进一步优选为厚度为0. 1 0. 5mm ；脂肪族聚酯为聚左旋乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-己内酯、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯中的一种；天然高分子是胶原或明胶中的一种；纤维层的层数η满足3 < η < 30，无规排布纤维层层数χ、平行排布纤维层层数y和网格排布纤维层层数z，满足1 < x、y、z < 10 ；复数的平行排布纤维层的铺层角度为0 180°。本发明同时提供一种引导组织再生膜的方法，其含有如下步骤(1)将脂肪族聚酯溶于溶剂，室温下搅拌6 M小时得到浓度为0. 05 0. 4g/ml 的溶液A，将上述溶液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，接收到平行排布纤维层；(2)将天然高分子溶于溶剂，室温下搅拌6 M小时，得到浓度为0. 05 0. 4g/ ml的溶液B，将上述溶液B与溶液A进行混合，得到溶液总浓度为0. 05 0. 4g/ml的溶液 C，该溶液C中脂肪族聚酯与天然高分子的重量比为90/10 10/90，将该溶液C进行静电纺丝，分别以铝箔和铜网为接收装置，接收到无规排布纤维层和网格排布纤维层；(3)将纳米羟基磷灰石分散于溶剂，超声分散后得到含量为0. 1 0. 5g/ml悬浊液，取上述悬浊液加入溶液A或溶液C，得到聚合物与纳米羟基磷灰石的重量比为100/0 70/30的溶液，将上述溶液进行静电纺丝，以铜网为接收装置，接收到网格排布纤维层；(4)将步骤(1)得到的纤维膜沿纤维排列方向进行牵伸，牵伸力200 500g，牵伸温度50 100°C，牵伸率100 ~ 300% ；(5)将步骤⑵、(3)、(4)得到的纤维膜置于真空干燥箱中，恒温25 35°C，真空度低于40Pa下，干燥12 48h ；(6)将步骤(5)中的得到的纤维层按平行排布纤维层在中间，无规排布纤维层和网格排布纤维层在两侧的顺序进行叠加，然后用浓度为0. 001 0. 02g/ml的天然高分子水溶液浸润后，冷冻干燥得到弓I导组织再生膜。本发明优选的技术方案是，溶剂为三氟乙醇或六氟异丙醇中的一种；脂肪族聚酯为聚左旋乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-己内酯、聚乳酸-羟基乙酸-己内酯中的一种；天然高分子是胶原或明胶中的一种；步骤⑵和⑶中所用的铜网孔径为100 550 μ m0本发明提供的引导组织再生膜，从面向周围组织的一侧到面向缺损区的一侧依次为无规排布纤维层，可面向周围组织，高密度的纤维堆积对上皮或结缔组织的进入生长有5阻止作用，同时有利于上皮或成纤维细胞等的贴附生长；平行排布纤维层，可保证膜的力学强度，同时起到阻止上皮或成纤维细胞等向缺损处的长入；网格排布纤维层，可面向缺损区，其网格间疏松的纤维排布区域，有利于骨或牙周膜细胞的贴附生长。具体如表1和附图 4、5、6、7 所示。表1 具有不同纤维排布的聚左旋乳酸纤维膜的力学性能比较(n = 10,ρ< 0. 05)组别膜的厚度 (mm)拉伸强度 (MPa)拉伸断裂应变 (%)拉伸弹性模量 (MPa)网格0. 033±0. 0028. 47 ±1.99133. 51±16. 4624. 89±9. 59无规0. 031±0. 0047.86±1. 13127. 81±29. 5166. 32 ±32. 48平行0. 016±0. 00342. 3±6. 520. 3±3. 11025. 9±59. 1本发明采用复合的生物可降解脂肪族聚酯和天然高分子作为梯度功能化结构的引导组织再生膜两侧的主要成分，疏水性可降解脂肪族聚酯成分有利于纤维膜遇水遇热后的结构维持，亲水性天然高分子成分有利于提高生物相容性和细胞亲和性。本发明网格排布纤维层中，纳米羟基磷灰石成分的加入，提高了对骨再生的诱导性。本发明通过不同纤维层铺层组合，可实现对单个功能层的独立控制，可通过对多层纤维平行排列的生物可降解脂肪族聚酯纤维膜的多角度(0 180° )铺层，使引导组织再生膜具有各向同性的高机械强度。本发明通过天然高分子水溶液将铺层的多个纤维层进行复合，层间结合好，同时增加了生物相容性。本发明通过选择不同组成的生物可降解脂肪族聚酯，调控梯度功能化结构引导组织再生膜的降解速率及体内吸收速率。本发明利用静电纺丝技术分别制备在组成和排布上存在差异的纤维膜，再通过铺层复合的方式，不仅更易于实现引导组织再生膜的梯度功能化结构，也使引导组织再生膜的厚度和力学性能更易得到控制，生长因子和抗生素的引入及控制释放更易于实现，可以更好地满足弓I导组织再生修复的临床需要。以下结合附图，以对本发明的内容进行详细说明，但本发明并不限于以下这些实例，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
图1是本发明静电纺丝制备的纤维无规排列的聚左旋乳酸/明胶(50/50，w/w)复合纤维膜的扫描电镜照片(JSM 4700型扫描电镜，日本电子)；图2是本发明静电纺丝制备的纤维平行排列的聚左旋乳酸纤维膜的扫描电镜照片(JSM 4700型扫描电镜，日本电子)；图3是本发明静电纺丝制备的纤维呈网格排布的聚左旋乳酸/纳米羟基磷灰石复合纤维膜的扫描电镜照片(JSM 4700型扫描电镜，日本电子)；图4是牙周膜细胞在纤维无规排列的聚左旋乳酸纤维层上培养7天后，激光共聚焦显微镜观察细胞应力纤维照片(从左到右由纤维层的表及里，切片厚度1. 18ym)；图5是牙周膜细胞在100%热牵伸平行聚左旋乳酸纤维层上培养7天后，激光共聚焦显微镜观察细胞应力纤维照片(从左到右由纤维膜的表及里，切片厚度1. 17ym)；图6是牙周膜细胞在网格型聚左旋乳酸纤维层上培养3天后的SEM形态观察照片 (a :χ 200 ；b :χ 500 ；c :x 2000)；图7是牙周膜细胞在网格型聚左旋乳酸纳米纤维膜上培养7天后，激光共聚焦显微镜观察无纺区域的细胞应力纤维照片(从左到右由纤维膜的表及里，切片厚度5 μ m)。

2、将明胶溶于六氟异丙醇，室温搅拌M小时，得到浓度为40% (g/ml)溶液B ；3、将3ml溶液A和Iml溶液B混合，得到溶液C，聚乳酸-羟基乙酸与明胶的重量比为3/1，聚合物总浓度40% (g/ml)；4、将一定量纳米羟基磷灰石分散于六氟异丙醇，400W超声分散5min得到糊状悬浊液D，纳米羟基磷灰石含量50% (g/ml)；5、取IOml溶液A和2ml糊状悬浊液D混合得到溶液E，聚合物与纳米羟基磷灰石的重量比为4/1 ；6、取溶液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒卷绕速率12m/s，电压 12kV，接收距离15cm，流速0. 5mL/h,得到纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸纤维膜，纺丝 10h，厚度大约400μπι;7、取溶液C进行静电纺丝，以铝箔为接收装置，电压12kV，接收距离20cm，流速 0. 5mL/h，得到纤维无规排列的聚乳酸-羟基乙酸/明胶复合纤维膜，纺丝10h，厚度大约 400 μ m ；8、取溶液E进行静电纺丝，以400 μ m网孔的铜网为接收装置，电压12kV，接收距离 20cm，流速0. 5mL/h，得到纤维呈网格排布的聚乳酸-羟基乙酸/纳米羟基磷灰石复合纤维膜，纺丝IOh,厚度大约400 μ m ；9、将步骤6、7、8得到的纤维膜置于真空干燥箱中，恒温35°C，真空度低于12 下， 干燥48h ；10、将步骤6得到的纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸纤维膜沿纤维排列方向进行牵伸，牵伸力500g，牵伸温度70°C，牵伸率200% ；11、将5、6得到的纤维膜经步骤7干燥后与步骤8牵伸过的纤维膜依次叠加，用 2% (g/ml)明胶水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚1mm。实施例31、将聚己内酯(山东医疗器械研究所生产，下同)溶于三氟乙醇，室温搅拌6小时，得到浓度为5% (g/ml)的溶液A;2、将明胶溶于三氟乙醇，室温搅拌6小时，得到浓度为5% (g/ml)溶液B ；3、将溶液A和B等比例混合，得到溶液C，聚己内酯与明胶的重量比为1/1，聚合物总浓度5% (g/ml)；4、将一定量纳米羟基磷灰石分散于三氟乙醇，400W超声分散5min得到糊状悬浊液D，纳米羟基磷灰石含量50% (g/ml)；5、取IOml溶液C和0. 2ml糊状悬浊液D混合得到溶液F，聚合物与纳米羟基磷灰石的重量比为5/1 ；6、取溶液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒卷绕速率12m/s，电压 12kV，接收距离15cm，流速0. 4mL/h，得到纤维平行排列的聚己内酯纤维膜，纺丝10h，厚度大约20 μ m ；7、取溶液C进行静电纺丝，以铝箔为接收装置，电压12kV，接收距离20cm，流速 0. 4mL/h,得到纤维无规排列的聚己内酯/明胶复合纤维膜，纺丝10h，厚度大约20 μ m ；8、取溶液F进行静电纺丝，以100 μ m网孔的铜网为接收装置，电压12kV，接收距离20cm，流速0. 4mL/h，得到纤维呈网格排布的聚己内酯/明胶/纳米羟基磷灰石复合纤维膜，纺丝10h，厚度大约20μπι;9、将步骤6、7、8得到的纤维膜置于真空干燥箱中，恒温25°C，真空度低于40 下， 干燥iai ；10、将步骤6得到的纤维平行排列的聚己内酯纤维膜沿纤维排列方向进行牵伸， 牵伸力200g，牵伸温度50°C，牵伸率300% ；11、将5、6得到的纤维膜经步骤7干燥后与步骤8牵伸过的纤维膜依次叠加，用 0.5% (g/ml)明胶水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚0.05mm。实施例41、将聚乳酸-羟基乙酸-己内酯(山东医疗器械研究所生产，下同)溶于三氟乙醇，室温搅拌M小时，得到浓度为30% (g/ml)的溶液A;2、将明胶溶于三氟乙醇，室温搅拌12小时，得到浓度为20% (g/ml)溶液B ；3、将2ml溶液A和3ml溶液B混合，得到溶液C，聚聚乳酸-羟基乙酸-己内酯与明胶的重量比为1/1，聚合物总浓度(g/ml)；4、将一定量纳米羟基磷灰石分散于三氟乙醇，400W超声分散5min得到糊状悬浊液D，纳米羟基磷灰石含量50% (g/ml)；5、取IOml溶液C和0. 5ml糊状悬浊液D混合得到溶液F，聚合物与纳米羟基磷灰石的重量比为10/1 ；6、取溶液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒卷绕速率12m/s，电压 15kV，接收距离18cm，流速0. 8mL/h，得到纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜，纺丝10h，厚度大约250μπι;7、取溶液C进行静电纺丝，以铝箔为接收装置，电压15kV，接收距离20cm，流速 0. 4mL/h,得到纤维无规排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶复合纤维膜，纺丝20h，厚度大约ΙδΟμ ；8、取溶液F进行静电纺丝，以400 μ m网孔的铜网为接收装置，电压15kV，接收距离 20cm，流速0. 4mL/h，得到纤维呈网格排布的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶/纳米羟基磷灰石复合纤维膜，纺丝20h，厚度大约150 μ m ；9、将步骤6、7、8得到的纤维膜置于真空干燥箱中，恒温30°C，真空度低于12 下， 干燥24h ；10、将步骤6得到的纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜沿纤维排列方向进行牵伸，牵伸力200g，牵伸温度70°C，牵伸率100% ；11、将5、6得到的纤维膜经步骤7干燥后与步骤8牵伸过的纤维膜依次叠加，用 0.5% (g/ml)明胶水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚650 μ m。实施例51、将聚乳酸-己内酯溶于三氟乙醇，室温搅拌12小时，得到浓度为10% (g/ml)的溶液A ；2、将胶原溶于三氟乙醇，室温搅拌12小时，得到浓度为10% (g/ml)溶液B ；3、将溶液A和B等比例混合，得到溶液C，聚乳酸-己内酯与胶原的重量比为1/1， 聚合物总浓度10% (g/ml)；4、将一定量纳米羟基磷灰石分散于三氟乙醇，400W超声分散5min得到糊状悬浊
9液D，纳米羟基磷灰石含量50% (g/ml)；5、取IOml溶液C和0. 2ml糊状悬浊液D混合得到溶液F，聚合物与纳米羟基磷灰石的重量比为10/1 ；6、取溶液A进行静电纺丝，以不锈钢滚筒为接收装置，滚筒卷绕速率12m/s，电压 12kV，接收距离15cm，流速0. 8mL/h，得到纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜，纺丝10h，厚度大约IOOym ；7、取溶液C进行静电纺丝，以铝箔为接收装置，电压12kV，接收距离20cm，流速 0. 4mL/h,得到纤维无规排列的聚乳酸-己内酯/胶原复合纤维膜，纺丝10h，厚度大约 50 μ m ；8、取溶液F进行静电纺丝，以400 μ m网孔的铜网为接收装置，电压12kV，接收距离 20cm，流速0. 4mL/h，得到纤维呈网格排布的聚乳酸-己内酯/胶原/纳米羟基磷灰石复合纤维膜，纺丝10h，厚度大约50 μ m ；9、将步骤6、7、8得到的纤维膜置于真空干燥箱中，恒温30°C，真空度低于12 下， 干燥24h ；10、将步骤6得到的纤维平行排列的聚乳酸-己内酯纤维膜沿纤维排列方向进行牵伸，牵伸力300g，牵伸温度100°C，牵伸率100% ；11、将步骤5、6得到的纤维膜经步骤7干燥后与步骤8牵伸过的纤维膜依次叠加， 用0.5% (g/ml)胶原水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚200 μ m。实施例61、纤维无规排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶复合纤维膜制备方法同实施例4 ；2、纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜制备方法同实施例4 ；3、纤维呈网格排布的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶/纳米羟基磷灰石复合纤维膜同实施例4 ；4、将4层纤维无规排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶复合纤维膜、4层纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜和4层纤维呈网格排布的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯/明胶/纳米羟基磷灰石复合纤维膜依次叠加，其中四层纤维平行排列的聚乳酸-羟基乙酸-己内酯纤维膜分别以0、45、90、135°四个方向进行铺层，用0.5% (g/ml) 明胶水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚大约2mm。实施例71、纤维无规排列的聚左旋乳酸/明胶复合纤维膜制备方法同实施例1 ；2、纤维平行排列的聚左旋乳酸纤维膜制备方法同实施例1 ；3、纤维呈网格排布的聚左旋乳酸/明胶复合纤维膜同实施例1 ；4、将10层纤维无规排列的聚乳酸/明胶复合纤维膜、10层纤维平行排列的聚乳酸纤维膜和10层纤维呈网格排布的聚乳酸/明胶复合纤维膜依次叠加，其中10层纤维平行排列的聚乳酸纤维膜分别以0、45、90、135°四个方向进行铺层，用0.5% (g/ml)明胶水溶液浸渍，冷冻干燥得到梯度功能化复合的纤维膜，膜厚2mm。


本发明涉及一种引导组织再生膜及其制备方法，解决了现有技术中存在的膜的厚度受到限制、细胞进入生长的效果不好及强度有限的技术问题，本发明提供的引导组织再生膜，具有层状结构，其排列顺序依次为纤维呈无规排布的无规排布纤维层、纤维呈平行排布的平行排布纤维层和纤维呈网格排布的网格排布纤维层，上述纤维层中都含有脂肪族聚酯，本发明提供的引导组织再生膜可以更好地满足引导组织再生修复的临床需要。