专利名称：一种油棕组织培养的繁殖方法油棕属多年生单子叶植物，属于棕榈科油棕属，是重要的热带木本油料作物，我国油棕主要分布在海南、两广南部、台湾南部、云南南部等地区。油棕是世界上生产效率最高的产油植物，产油量是椰子的2 3倍，花生的7 8倍，大豆的9 10倍，远远高于其它油料作物，所以被人们誉为“世界油王”。棕榈油是世界油脂市场的一个重要组成部分，目前它在世界油脂总产量中的比例超过30%，广泛应用于食品工业及化工工业，并成为生物能源(生物柴油)最有竞争潜力的生产原料。目前我国已经成为世界最大的棕榈油消费国，而 且主要依赖进口。油棕的繁殖方法通常是传统的种子进行繁殖，但种子繁殖所需周期长，种子发芽过程中如处理不当会导致发芽率低、出苗不整齐等不利因素，而且需要消耗大量的人力、物力和财力。由于油棕树只有一个生长点，基本不分枝，难以实现无性繁殖，国内油棕的组织培养技术产业发展缓慢。上世纪80年代在油棕组织培养方面取得了些成绩，但从幼胚诱导出愈伤组织并分化成植株是国内空白，之后中国热带农业科学院有油棕组织培养的类似报道，但无公开详细的关键技术，故有必要寻找一种快捷而创新、有效而经济的方法提高繁育种苗的品质和数量，加速油棕产业的发展。
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种油棕组织培养的繁殖方法，以油棕的幼胚为外植体，通过诱导分化获得再生植株，解决目前油棕增殖分化率低、增殖缓慢、不能满足大规模种植的问题，有效地缩短种苗组织培养时间，具有很强的可实施性与重复性，为油棕工厂化、规模化育苗奠定了良好的理论基础，为油棕产业化发展提供先决条件。本发明所采用的技术方案一种油棕组织培养的繁殖方法，其步骤如下I、取开花期后6 12周采集的皮半红色、未发育到硬核期的种果，洗净后取出种核中带幼胚的胚乳块，消毒后用无菌水冲洗，然后将幼胚接种到诱导愈伤组织培养基中，暗室培养，培养温度为23 27°C，培养60 85天，得到愈伤组织。所述诱导愈伤组织培养基是以N6I培养基为基本培养基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉胶4. 5g/L、2，4_D2.5mg/L。2、将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件温度23 27°C，光照时间12h/d，光照强度1500 20001ux ;培养时间为75 85天，待不定芽生成后再进行继代增殖培养，继代增殖培养所用培养基、培养条件、培养时间与不定芽诱导培养过程相同。所述不定芽诱导培养基是以N6I培养基为基本培养基，并添加活性碳3. Og/L、鹿糖 30g/L、卡拉胶 4. 5g/L、NAA0. 3mg/L。3、将经过增殖培养的不定芽切下，接种到生根培养基中培养，培养条件温度23 27°C，光照时间12h/d，光照强度1500 20001ux，培养25 30天后便开始生根。所述生根培养基是以R68培养基为基本培养基，并添加活性碳3. Og/L、蔗糖30g/L、卡拉胶4.5g/L、NAA 7mg/L、PBZ 9 mg/L、氨节青霉素 I. 2mg/L。4、将生根数为5条根以上的生根苗进行开盖炼苗，使其与空气接触，温度23 27°C下生长5 10d，然后用流水洗去再生苗根上的培养基，移栽到经消毒的栽培基质中培养，薄膜覆盖，每5d浇一次水以保持土壤湿润，获得油棕再生植株。所述栽培基质是将蛭石、珍珠岩和营养土按质量比为1:1:2的比例混合。 所述生苗根在消毒栽培基质中培养的条件为温度为25V，光照周期为12h/d，光照强度为20001ux 25001ux。本发明以油棕的幼胚为外植体，通过诱导分化获得再生植株，解决目前油棕增殖分化率低、增殖缓慢、不能满足大规模种植的问题，有效地缩短种苗组织培养时间，具有工艺简单、培养周期短、生根率高、移栽成活率高等特点，为油棕工厂化、规模化育苗奠定了良好的基础，为油棕产业化发展提供先决条件。作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一I、取开花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半红色，未发育到硬核期的种果80个，在室内用自来水洗净后除去果肉，切开种核取出带胚的胚乳块，先用70%的酒精浸泡几秒钟，然后用灭菌水冲洗3遍，再用饱和漂白粉消毒液消毒10 30分钟，消毒后的材料均须用无菌水冲洗3遍后将接种到诱导愈伤组织培养基(N6I培养基+活性碳3. Og/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培养，培养温度为24°C，培养80天，得到愈伤组织，结果见表I。其中N6I培养基可参照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458发表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A useful tool foroil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文,其配制方法相同。2、取愈伤组织50个接种到不定芽诱导培养基(N6I培养基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中进行不定芽诱导培养，培养条件温度26°C，光照时间12h/d，光照强度17001ux ;培养时间为78天，生成不定芽，结果见表I。待不定芽生成后再进行继代增殖培养，继代增殖培养所用培养基、培养条件、培养时间与不定芽诱导培养过程相同。3、将经过增殖培养的不定芽切下，取30个不定芽接种到生根培养基(R68培养基+ 活性碳 3. 0g/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉胶 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨节青霉素 I. 2mg/L)中培养，培养条件温度27°C，光照时间12h/d，光照强度16001UX，培养25 30天后便开始生根，生根个数见表I。4、取生根数为5条根以上的生根苗20棵进行开盖炼苗，使其与空气接触，温度26°C下生长6d，然后用流水洗去再生苗根上的培养基，移栽到经消毒的栽培基质(将蛭石、珍珠岩和营养土按质量比为1: 1:2的比例混合)中培养，置于温度为25°C，光照周期为12h/d,光照强度为24001UX的生长室内，薄膜覆盖，每5d浇一次水以保持土壤湿润，获得油棕再生植株，移栽成活结果见表I。实施例二I、取开花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半红色，未发育到硬核期的种果80个，在室内用自来水洗净后除去果肉，切开种核取出带胚的胚乳块，先用70%的酒精浸泡2 10分钟，然后用灭菌水冲洗3遍，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10 20分钟，消毒后的材料均须用无菌水冲洗3遍后将接种到诱导愈伤组织培养基(N6I培养基+活性碳 3.Og/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培养，培养温度为25°C，培养75天，得到愈伤组织，结果见表I。其中N6I培养基可参照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458 发表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A usefultool for oil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文，其配制方法相同。2、取愈伤组织50个接种到不定芽诱导培养基(N6I培养基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中进行不定芽诱导培养，培养条件温度25°C，光照时间12h/d，光照强度20001ux;培养时间为80天，生成不定芽，结果见表I。待不定芽生成后再进行继代增殖培养，继代增殖培养所用培养基、培养条件、培养时间与不定芽诱导培养过程相同。3、将经过增殖培养的不定芽切下，取30个不定芽接种到生根培养基(R68培养基+ 活性碳 3. 0g/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉胶 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨节青霉素 I. 2mg/L)中培养，培养条件温度25V，光照时间12h/d，光照强度19001ux，培养25 30天后便开始生根，生根个数见表I。4、取生根数为5条根以上的生根苗20棵进行开盖炼苗，使其与空气接触，温度25°C下生长8d，然后用流水洗去再生苗根上的培养基，移栽到经消毒的栽培基质(将蛭石、珍珠岩和营养土按质量比为1: 1:2的比例混合)中培养，置于温度为25°C，光照周期为12h/d,光照强度为23001UX的生长室内，薄膜覆盖，每5d浇一次水以保持土壤湿润，获得油棕再生植株，移栽成活结果见表I。实施例三I、取开花期后6 12周采集的大小基本一致、皮半红色，未发育到硬核期的种果80个，在室内用自来水洗净后除去果肉，切开种核取出带胚的胚乳块，先用70%的酒精浸泡几秒钟，然后用灭菌水冲洗3遍，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10 20分钟，消毒后的材料均须用无菌水冲洗3遍后将接种到诱导愈伤组织培养基(N6I培养基+活性碳3. 0g/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L+2, 4-D 2. 5mg/L),暗室培养，培养温度为27°C，培养65天，得到愈伤组织，结果见表I。其中N6I培养基可参照Ruslan Abdullah在2004年第七期0717~3458发表的 Electronic Journal of Biotechnology 的 Immature embryo: A useful tool foroil palm (Elaeis guineensis Jacq. ) genetic transformation studies 一文,其配制方法相同。2、取愈伤组织50个接种到不定芽诱导培养基(N6I培养基+活性碳3. Og/L+蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L+NAA0. 3mg/L)中进行不定芽诱导培养，培养条件温度23°C，光照时间12h/d，光照强度19001ux ;培养时间为83天，生成不定芽，结果见表I。待不定芽生成后再进行继代增殖培养，继代增殖培养所用培养基、培养条件、培养时间与不定芽诱导培养过程相同。3、将经过增殖培养的不定芽切下，取30个不定芽接种到生根培养基(R68培养基+ 活性碳 3. Og/L+ 鹿糖 30g/L+ 卡拉胶 4. 5g/L+NAA 7mg/L+PBZ 9 mg/L+ 氨节青霉素 I. 2mg/L)中培养，培养条件温度23°C，光照时间12h/d，光照强度20001ux，培养25 30天后便开始生根，生根个数见表I。4、取生根数为5条根以上的生根苗20棵进行开盖炼苗，使其与空气接触，温度23°C下生长9d，然后用流水洗去再生苗根上的培养基，移栽到经消毒的栽培基质(将蛭石、 珍珠岩和营养土按质量比为1: 1:2的比例混合)中培养，置于温度为25°C，光照周期为12h/
d,光照强度为21001ux的生长室内，薄膜覆盖，每5d浇一次水以保持土壤湿润，获得油棕再生植株，移栽成活结果见表I。对照试验分两组进行对照试验，其中对照组一I、愈伤组织培养基采用N6I培养基+2. 4-D2. 5mg/L+NAA0. 3 mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L+活性碳3g/L。其它步骤同实施例一。2、不定芽诱导培养采用将N6I培养基+6-BA0. 5 g/L+活性碳3g/L+蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L，pH为5. 8-6. 5。培养12个星期，诱导不定芽，其它步骤同实施例一。3、生根培养基采用R68培养基+活性碳3g/L +蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L+氨苄青霉素L2mg/L +NAA7mg/L+PBZ3mg/L，pHS5.8-6.5。其它步骤同实施例一。培养4个星期形成种苗。4、炼苗及移栽过程同实施例一。对照组二 I、愈伤组织培养基采用N6I培养基+2. 4-D2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L+活性碳3g/L，其它步骤同实施例一。2、不定芽诱导培养采用将N6I基本培养基+6-BA0. 2 g/L+活性碳3g/L+蔗糖30g/L+卡拉胶4. 5g/L，pH为5. 8-6. 5。培养12个星期，诱导不定芽，其它步骤同实施例一。3、生根培养基采用R68基本培养基+活性碳3g/L +蔗糖30g/L +卡拉胶4. 5g/L+氨苄青霉素I. 2mg/L +NAA7mg/L+PBZ6mg/L, pH为5· 8-6. 5。其它步骤同实施例一。培养4个星期形成种苗。4、炼苗及移栽过程同实施例一。表I不同培养基的油棕组织培养的结果对比


本发明属种苗组织培养技术领域，涉及是一种油棕组织培养的繁殖方法，是取油棕幼胚为外植体，灭菌后诱导愈伤组织；将愈伤组织进行不定芽培养，之后进行增殖培养；将增殖培养后的不定芽进行生根培养；将生根苗炼苗，移栽到消毒栽培基质中培养，获得油棕再生植株。本发明以油棕的幼胚为外植体,通过诱导分化获得再生植株，解决目前油棕增殖分化率低、增殖缓慢、不能满足大规模种植的问题，有效地缩短种苗组织培养时间，具有工艺简单、培养周期短、生根率高、移栽成活率高等特点，为油棕工厂化、规模化育苗奠定了良好的基础，为油棕产业化发展提供先决条件。