专利名称：朱砂兰组织培养方法朱砂兰为兰科兰属的植物，因花色红似朱砂而得名；明朝时期朱砂兰曾被当作贡品，因此又被称为“贡品兰”和“神品兰”。朱砂兰植株雄健，根粗而长，每年9-10月开花(一般是重阳节前后盛放，少数延至年底，甚至春节前后)，花期约I月；葶高30-40cm，花杆铁锈红，每葶着花3-5朵，花径6-8厘米，柳叶瓣，萼片披针状，呈等边三角形排列，色朱砂红见紫色，香味纯正，花舌白底，布鲜红小斑点，但斑点散，不成形。朱砂兰已有千余年的家养历史，是与大雪素、小雪素齐名的云南传统兰花，属滇兰四大名品之一。云南民间认为种养此花能增添家庭喜庆气氛，其叶健茂而花明丽，很有气派，有大富大贵、大红大紫之寓意，深受人们喜爱。朱砂兰曾屡次在各级各类兰博会上获得嘉奖，在中国第十届秋季兰博会获得两枚金奖、在2003年昆明国庆秋季兰展亦获金奖。朱砂兰的传统繁殖方式是利用分株进行繁殖，繁殖系数低，并且在后期生长中花色会产生变异。目前文献资料中没有朱砂兰组织培养方面的相关报道。
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种在短期内获得出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，生产出性状一致的种苗，保证后续产品整齐划一的商品性能， 易于操作，可进行大规模生产的朱砂兰组织培养方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现朱砂兰组织培养方法，其特征在于， 该方法包括以下步骤(I)外植体采集10-11月是朱砂兰蒴果成熟时期，当蒴果外表转为褐色，达到形态成熟而尚未开裂时采收；时间过早，种子胚发育不全影响发芽率；时间太迟，蒴果破裂，会造成不必要的损失;⑵消毒灭菌取朱砂兰未开裂的蒴果，流水冲洗25-35min，在超净工作台上用70_75%酒精处理25-35s后再用O. 1-0. 2%升汞液浸泡10_15min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4_5次，每次不少于4-5min,后用无菌纸吸干果实表面水分；⑶播种在无菌条件下，将灭菌过的朱砂兰种子播种在人工配制的播种培养基上；培养 30-40天，待培养物膨大形成原球体时，即开始下一阶段；⑷增殖将上一步所得培养物在无菌条件下转接到人工配制的增殖培养基上，经过培养30-40天左右，膨大的原球体开始出现幼嫩的朱砂兰小苗，待小苗长到常规壮苗程序所需高度时可将苗转接到壮苗培养基上；(5)壮苗将上一步所得的朱砂兰小苗在无菌条件下转接到人工配制的壮苗培养基上；经过 25-35天培养的小苗开始出现2-3片叶子，形成独立的植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上；(6)生根将上一步所得的朱砂兰壮苗在无菌条件下转接到生根培养基上，经过培养30-50 天植株开始出现长高和5-6片叶子，在苗的基部长出多条肉质、绿色气生根，最后形成完整的植株；最终生根率高达80-95% ；所述的种子萌发培养基包括MS+苄基腺嘌呤6-BA0. 1-0. 5mg/L+l_3%蔗糖；所述的增殖分化培养基包括MS+萘乙酸NAA O. 1-0. 3mg/L+6苄基腺嘌呤 6-BA0. 8-1. 2mg/L+l-3%蔗糖；所述的壮苗培养基包括MS+10-15%香蕉+萘乙酸NAA l-2mg/L+l_3%蔗糖；所述的生根培养基包括MS+10_15%香蕉+萘乙酸NAA I. 5-2. 5mg/L+吲哚丁酸 IBA O. 8-1. 2mg/L+l-3%蔗糖。所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素和有机成分组成。所述种子萌发培养基成分优选为MS+苄基腺嘌呤6-BAO. lmg/L+2%蔗糖。所述增殖分化培养基成分优选为MS+萘乙酸NAAO. 2mg/L+苄基腺嘌呤6_BA lmg/ L+2%鹿糖。所述壮苗培养基成分优选为MS+10%香蕉+萘乙酸NAA1. 5mg/L+2%蔗糖。所述生根培养基成分优选为MS+10%香蕉+萘乙酸NAA 2mg/L+吲哚丁酸IBA lmg/L+2% 鹿糖。各培养基PH值为5. 5-6. 0，培养温度为23_25°C，光照强度1600-2000LX，光照时间 9-12h/d。与现有技术相比，本发明通过组培技术，利用植物组织培养对朱砂兰进行繁殖时， 可发挥快繁的优势，短期内获得大量种苗；相对扦插而言，后期培养中植株花色也较少产生变异；并且植物组织培养作为一种无性繁殖方式，可保证幼苗整齐，既便于后期统一的移栽和种植管理，也能保证所长出的产品植株和盆栽在各个性状上的一致。相对于以往的繁殖方式，所用培养基培养诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，易于操作，可进行大规模生产。附图I为本发明朱砂兰组织培养方法的流程图。6-BA0. 8-1. 2mg/L+l-3%蔗糖。所述的壮苗培养基包括MS+10-15%香蕉+萘乙酸NAA l-2mg/L+l_3%蔗糖。所述的生根培养基包括MS+10-15%香蕉+萘乙酸NAA I. 5_2. 5mg/L+吲哚丁酸 IBA O. 8-1. 2mg/L+l-3%蔗糖。所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素和有机成分组成。所述种子萌发培养基成分优选包括MS+苄基腺嘌呤6-BA O. lmg/L+2%蔗糖。所述增殖分化培养基成分优选包括MS+萘乙酸NAA O. 2mg/L+苄基腺嘌呤6-BA lmg/L+2% 鹿糖。所述壮苗培养基成分优选包括MS+10%香蕉+萘乙酸NAA I. 5mg/L+2%蔗糖。所述生根培养基成分优选包括MS+10%香蕉+萘乙酸NAA 2mg/L+吲哚丁酸IBA lmg/L+2% 鹿糖。所述的朱砂兰的各培养基PH值为5. 5-6. 0，培养温度为23_25°C (度)，光照强度 1600-2000LX(勒克斯)，光照时间9-12h/d (小时/天)。实施例I(I)外植体采集10-11月是朱砂兰蒴果成熟时期，当蒴果外表转为褐色，达到形态成熟而尚未开裂CN 102577973 A
书
明
说
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时采收。时间过早，种子胚发育不全影响发芽率；时间太迟，蒴果破裂，会造成不必要的损失;(2)消毒灭菌取朱砂兰未开裂的蒴果，流水冲洗25min，在超净工作台上用75%酒精处理25s后再用O. I %升汞液浸泡lOmin，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗4次，每次不少于4min，后用无菌纸吸干果实表面水分；(3)播种MS培养基对种子的萌发和生长最好，蔗糖浓度1%，PH值为5. 5，6_BA(苄基腺嘌呤)浓度O. lmg/L (毫克/升)适合种子萌发和生长。在无菌条件下，将灭菌过的朱砂兰种子播种在人工配制的播种培养基上。培养温度为23°C，光照强度1600LX (勒克斯)，光照时间9h/d (小时/天)，培养30天，待培养物膨大形成原球体时，即开始下一阶段；(4)增殖朱砂兰原球体增殖分化培养阶段的最适培养基为MS+NAA O. lmg/L+6-BA(6苄基腺嘌呤)0. 8mg/L+l%蔗糖，PH值为5. 5。将上一步所得培养物在无菌条件下转接到人工配制的增殖培养基上。培养温度为23°C，光照强度1600LX，光照时间9h/d，经过培养30天左右，膨大的原球体开始出现幼嫩的朱砂兰小苗，待小苗长到常规壮苗程序所需高度时可将苗转接到壮苗培养基上；(5)壮苗朱砂兰壮苗阶段的最适宜培养基为MS+10%香蕉+NAA lmg/L+1 %蔗糖，PH值为 5. 5 ;将上一步所得的朱砂兰小苗在无菌条件下转接到人工配制的壮苗培养基上。培养温度为23°C，光照强度1800LX，光照时间9h/d，经过25天培养的小苗开始出现2_3片叶子，形成独立的植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上。(6)生根朱砂兰生根阶段的培养基为MS+10%香蕉+NAA I. 5mg/L+IBA (卩引哚丁酸)0. 8mg/ L+1%蔗糖，PH值为5. 5。将上一步所得的朱砂兰壮苗在无菌条件下转接到生根培养基上； 培养温度为23°C，光照强度1800LX，10h/d,经过培养30天植株开始出现长高和5_6片叶子，在苗的基部长出多条肉质、绿色气生根，最后形成完整的植株。最终生根率为86.3%。实施例2(I)外植体采集10-11月是朱砂兰蒴果成熟时期，当蒴果外表转为褐色，达到形态成熟而尚未开裂时采收。时间过早，种子胚发育不全影响发芽率；时间太迟，蒴果破裂，会造成不必要的损失;(2)消毒灭菌取朱砂兰未开裂的蒴果，流水冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精处理30s后再用O. I %升汞液浸泡15min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗5次,每次不少于5min，后用无菌纸吸干果实表面水分。(3)播种MS培养基对种子的萌发和生长最好，蔗糖浓度2%，PH值为6. 0，6_BA(苄基腺嘌呤)浓度O. lmg/L (毫克/升)适合种子萌发和生长。在无菌条件下，将灭菌过的朱砂兰种子播种在人工配制的播种培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX(勒克斯)，光照时间10h/d(小时/天)，培养40天，待培养物膨大形成原球体时，即开始下一阶段。⑷增殖朱砂兰原球体增殖分化培养阶段的最适培养基为MS+NAA O. 2mg/L+6_BA(6苄基腺嘌呤)lmg/L+2%蔗糖，PH值为6. O。将上一步所得培养物在无菌条件下转接到人工配制的增殖培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间10h/d，经过培养40天左右， 膨大的原球体开始出现幼嫩的朱砂兰小苗，待小苗长到常规壮苗程序所需高度时可将苗转接到壮苗培养基上。(5)壮苗朱砂兰壮苗阶段的最适宜培养基为MS+10%香蕉+NAA I. 5mg/L+2%蔗糖，PH值为 6.0。将上一步所得的朱砂兰小苗在无菌条件下转接到人工配制的壮苗培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间10h/d，经过30天培养的小苗开始出现2_3片叶子， 形成独立的植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上。(6)生根朱砂兰生根阶段的培养基为MS+10%香蕉+NAA 2mg/L+IBA (吲哚丁酸)lmg/L+2% 蔗糖，PH值为6. O。将上一步所得的朱砂兰壮苗在无菌条件下转接到生根培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间10h/d，经过培养50天植株开始出现长高和5_6片叶子，在苗的基部长出多条肉质、绿色气生根，最后形成完整的植株。最终生根率为95%。实施例3(I)外植体采集10-11月是朱砂兰蒴果成熟时期，当蒴果外表转为褐色，达到形态成熟而尚未开裂时采收。时间过早，种子胚发育不全影响发芽率；时间太迟，蒴果破裂，会造成不必要的损失;(2)消毒灭菌取朱砂兰未开裂的蒴果，流水冲洗35min，在超净工作台上用75%酒精处理35s后再用O. 2%升汞液浸泡15min，倒去升汞溶液，用无菌水冲洗5次,每次不少于5min，后用无菌纸吸干果实表面水分。(3)播种MS培养基对种子的萌发和生长最好，蔗糖浓度3%，PH值为6.0，6-BA(苄基腺嘌呤)浓度O. 5mg/L (毫克/升)适合种子萌发和生长。在无菌条件下，将灭菌过的朱砂兰种子播种在人工配制的播种培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX (勒克斯)，光照时间llh/d(小时/天)，培养40天，待培养物膨大形成原球体时，即开始下一阶段。(4)增殖朱砂兰原球体增殖分化培养阶段的最适培养基为MS+NAA O. 3mg/L+6_BA(6苄基腺嘌呤)I. 2mg/L+3%蔗糖，PH值为6. O。将上一步所得培养物在无菌条件下转接到人工配制的增殖培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间llh/d，经过培养40天左右，膨大的原球体开始出现幼嫩的朱砂兰小苗，待小苗长到常规壮苗程序所需高度时可将苗转接到壮苗培养基上。(5)壮苗
朱砂兰壮苗阶段的最适宜培养基为MS+15%香蕉+NAA 2mg/L+3 %蔗糖，PH值为 6.0。将上一步所得的朱砂兰小苗在无菌条件下转接到人工配制的壮苗培养基上。培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间llh/d，经过30天培养的小苗开始出现2_3片叶子， 形成独立的植株，待植株长到常规生根程序所需高度时可将其转接到生根培养基上。(6)生根朱砂兰生根阶段的培养基为MS+15%香蕉+NAA 2. 5mg/L+IBA (吲哚丁酸)I. 2mg/ L+3%蔗糖，PH值为6. O。将上一步所得的朱砂兰壮苗在无菌条件下转接到生根培养基上。 培养温度为25°C，光照强度2000LX，光照时间llh/d，经过培养50天植株开始出现长高和 5-6片叶子，在苗的基部长出多条肉质、绿色气生根，最后形成完整的植株。最终生根率为 83.5%。试验结果与分析表I不同浓度的6-BA对朱砂兰诱导形成的影响
浓度mg/I」 转绿时间/d原球茎形成时间/d增殖率/%O. I253191. 3%
O. 3273579. 15%O. 5354253. 4%
观察MS培养基中，添加浓度分别为O. 1、0. 3、0. 5mg/L的激素6-BA时朱砂兰诱导表现。朱砂兰种子在O. lmg/L的水平上最先转绿，形成原球茎的时间最短，增值率也比其余两个水平的高出很多。所以朱砂兰诱导最适合的6-BA水平为O. lmg/LO
表2不同浓度的6-BA对朱砂兰增殖的影响浓度mg/L- 平均苗高/cm平均叶长/cm茎粗壮度O. 8O. 8O. 05较好
II. 3O. 2最好I. 2O. 9O. I一般观察MS培养基中，添加浓度分别为O. 8、I、I. 2mg/L的激素6_BA时原球茎增殖表现。朱砂兰原球茎在O. lmg/L的水平上平均植株高度最高，平均叶长最长，茎粗壮度也比其余两个水平的好。所以朱砂兰增殖最适合的6-BA水平为lmg/L。表3不同浓度的NAA对朱砂兰壮苗的影响
浓度mg/L平均根长/cm平均根数/条叶长/cm生根率/%I1.43. O3. I83. 2%I. 52. O5. O5. 287. 85%2I. II. O2. 371. 6%观察MS培养基中，添加浓度分别为1、1. 5、2mg/L的激素NAA时朱砂兰壮苗表现。
I.5mg/L水平上根长最长，根数最多，叶长最长，生根率也比其余两个水平的高出很多。激素
9lmg/L的NAA生根率虽然比2mg/L的高一点，但其植株的质量不是很好，叶片有发黄的情况出现不利于后期的培养。2mg/L的NAA在生根率上，相比其它两个的综合水平都要低很多。表4不同浓度的NAA对朱砂兰生根的影响


本发明涉及一种植物的组织培养方法，尤其是涉及朱砂兰的组织培养方法，属农业种植技术领域。本发明朱砂兰的组织培养方法包括外植体采集、消毒灭菌、播种、增殖、壮苗、生根培养六个步骤。本发明通过组培技术，利用植物组织培养对朱砂兰进行繁殖时，可发挥快繁的优势，短期内获得大量种苗；相对扦插而言，后期培养中植株花色也较少产生变异；并且植物组织培养作为一种无性繁殖方式，可保证幼苗整齐，既便于后期统一的移栽和种植管理，也能保证所长出的产品植株和盆栽在各个性状上的一致。相对于以往的繁殖方式，所用培养基培养诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，易于操作，可进行大规模生产。