专利名称：百万星的组织培养与快速繁殖方法满天星是世界最流行的鲜切花配花之一，也是欧洲十大切花之一。我国主要在云 南省种植，种植面积近4000亩，每年需种苗350多万株。满天星新品种“百万星Million Stars”，枝条细、叶片少、花多且小，除可作花艺配材外，还是生产干花的好材料。该品种 2002年从荷兰引进以来，云南省农科院花卉研究所经过多年的试种和试销，已被市场接受。 目前，“百万星”切花除在国内销售外，还出口到东南亚多个国家，价格是‘仙女’、‘完美’、 ‘钻石’等传统大、中花型满天星品种的1倍左右，因其价格高质量优而成为种植者的新宠。 百万星常规的繁殖方法有种子繁殖和嫩枝扦插，前者存在百万星种子较难收获且性状不稳 定的的问题，后者存在嫩枝扦插繁殖系数低的问题，因此两种方法均难以进行规模化生产 和优良品种的大面积推广。目前百万星的组培研究，尤其是百万星大规模无性繁殖的研究 尚无报导。在实际操作中，百万星组培生产的技术难度比传统的大、中花满天星难度大，特 别在生根阶段生长激素及生根剂选择、过渡环境调控等等都需要加以解决。
本发明的目的在于提供一种百万星组培快繁的方法，以便建立无菌快繁体系，并 在无菌体系中提高增殖率及生根率，实现大规模生产优质种苗。为实现上述目的，本发明提供这样一种百万星的组织培养与快速繁殖方法，其特 征在于经过以下工艺步骤A、外植体的选择与灭菌在已开花的百万星植株中选出花多、重瓣成团、色白，且 枝条硬，无病虫害，无畸型的植株，再选取基部健壮且未形成花芽的茎尖或/和腋芽为外植 体，剥去外层叶片，切成1. 5 2cm的茎段，用常规的加有适量洗涤剂的水清洗后，在质量浓 度为0. 的升汞溶液中消毒15 25分钟，再在质量浓度为0. 2%的次氯酸钠溶液中消毒 15 20分钟，用无菌水漂洗3 4次；B、不定芽诱导培养将经过A步骤消毒灭菌后的营养芽在超净工作台上接种于下 列诱导培养基中进行诱导培养MS培养基6-苄胺基嘌呤6-BA1. 0 j 1. 5mg/L萘乙酸NAA0. 05 -一 0.lmg/L琼脂6. 5 7. Og/L白糖30g/L5. 8 6. 0
在培养温度为22 25°C，光照强度为2000
2500Lx，日光照时间为10 12 /J时的条件下，培养10 13天，即在茎尖或/和腋芽处萌发生长出3 5个不定芽，继续培 养至25 30天，使不定芽长至1 1. 5cm切下；C、不定芽继代增殖培养将B步骤切下的不定芽置于下列增殖培养基中进行增殖
培养MS培养基
一·0. 5 1. Omg/L
0. 1 0. 3mg/L 6. O 6. 5g/L 30g/L 5· 8 6· O
24°C，光照强度为2500 3000Lx，日光照时间为10 12小 时条件下培养20 25天，每个不定芽可增殖成3 9个芽，芽体高度约为2 3cm ；D、继代培养将C步骤所增殖的不定芽在无菌条件下按节切成2 3cm茎段，接种 在与C步骤相同的增殖培养基中，并在与C步骤相同的培养条件下进行继代培养，继代周期 为18 22d，继代5 7代，得大量的无根不定芽——植株高度为2 3cm的组培苗；E、生根培养切割D步骤所得组培苗，再切下0. 5 Icm长的苗尖后，余下的基部 返回接种到C步骤的增殖培养基中，再次进行继代培养；而切下的苗尖转接至下列生根培
6-苄胺基嘌呤6-BA 萘乙酸NAA 琼脂 白糖 PH值
在培养温度为20
养基中
MS培养基
萘乙酸NAA0. 3 0. 5mg/L
吲哚乙酸IAA0. 2 0. 3mg/L
琼脂6. 0 -一 6. 5g/L
白糖30 40g/L
PH值5. 8 6· 0
在培养温度为20 --24°C，光照强度为2000
2500Lx，日光照时间为10 12小
时条件下，进行生根培养8 12天，得部分苗尖长出根，其余的形成根原基的生根苗和无根 苗，出瓶；F、过渡移栽a、将D步骤出瓶的生根苗和无根苗取出后在质量浓度为0. 的多菌灵溶液中浸 泡1 2分钟，将无根苗基部沾300ppm的根太阳溶液后，与有根苗一同扦插到以珍珠岩为 基质的苗床上或育苗盘中，基质厚度为2. 5 3. Ocm,扦插密度为1. 5cmX 1. 5cm,前期按常 规遮阴、保湿，7天后开始长根，35天后移出，完成一级过渡移栽；b、将a步骤移出的苗栽到质量比为红土腐叶土 = 1 1的营养基质中，浇透定 根水，无须遮阴，每天浇水1 2次，10天后每7 10天喷施一次复合肥，30 35天后移 栽于大田，完成二级过渡移栽，大田中的成活率在95 %以上。本发明具有下列优点和效果采用上述方案，即利用组织培养技术对百万星开花 性状优良的枝条上的嫩茎或茎尖进行快速增殖后，不仅能保持和固定百万星花多色白、叶 片少、枝硬等优良种性，而且能有效缩短生产周期，实现了优质种苗的规模化、标准化和工 厂化生产，解决了常规种子繁育体系很难将百万星种苗发生的具有优良性状的芽变固定或保持下来的难题。同时还解决了常规繁育体系生产的种苗亲本来源复杂，种苗质量不稳定 的又一难题，通过本发明，使种苗来源单一，易于控制，繁殖速度快，20 25d为一个周期， 繁殖倍数达3 5，选取1个嫩茎或茎尖进行快速繁殖，年生产量可达几十万株，同时易于 标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量。本发明利用组织培养技术在培养室内实现周 年生产，节约了土地资源，提高了经济效益，克服了种苗无法周年进行生产的难点。本发明 对百万星种苗生产技术流程中的关键环节进行优化整合，采用低激素配比的培养基进行生 产，避免变异株的产生，由于满天星喜欢冷凉的环境和较高的光强，在培养温度为22士2°C， 光照强度2500 3000Lx的环境条件下，所生产的增殖苗和生根苗，苗株健壮、节间短而粗 壮、叶色浓绿，质量优，移栽成活率高达95 %以上。

培养基中
MS基本培养液 6-苄胺基嘌呤(6-BA)
萘乙酸(NAA) 蔗糖 琼脂 PH
1. Omg/L 0. lmg/L 40000mg/L 6500mg/L 5. 8
在培养温度为22°C，光照时间10h/d，光照强度2500Lx的环境条件下，培养IOd 后，有80%的茎尖无污染，并在茎尖的顶芽直接生成不定芽，每个茎段可生成3 5个不定 芽，继续培养至25天，使不定芽长至1. 5cm，在无菌条件下切下；4.增殖培养在无菌条件下，将上述3步骤切下的不定芽转入下列增殖培养基中 进行增殖培养MS基本培养液6-苄胺基嘌呤(6-BA)0. 5mg/L萘乙酸(NAA)0. 3mg/L蔗糖40000mg/L琼脂6500mg/LpH5. 8
在培养温度为24°C，光照时间10h/d，光照强度2500LX的环境条件下，培养20d，每 个不定芽可增殖出3 9个芽，芽体高度约为3cm ；为保证种苗质量，百万星增殖倍数应控 制在3 5倍；5.继代培养将4步骤所增殖的不定芽在无菌条件下按节切成3cm茎段，接种在 与4步骤相同的增殖培养基中，并在与4步骤相同的培养条件下培养，使每个不定芽又可增 殖出3 9个芽，芽体高度为2 3cm ；如此继代5代，继代周期为18d，得到大量的无根不 定芽——植株高度为2 3cm的组培苗；6.生根培养增殖继代基数达到繁殖基数时，即可进行生根培养，将5步骤的组培 苗切下，再将组培苗上部1. 5cm长的苗尖切下后，余下的基部返回接种到4步骤的增殖培养 基中，再次进行继代培养；而切下的苗尖则插入到下列生根培养基中1/2MS基本培养液(大量元素减半)萘乙酸(NAA)0. 3mg/L吲哚乙酸(IAA)0. 2mg/L蔗糖40000mg/L琼脂6000mg/LpH5. 8在培养温度为24°C，光照强度为2500LX，日光照时间为10小时条件下，培养10 天，切口稍膨大并出现白色突起，形成根原基，15天后有白色根系形成，出瓶移栽；7、过渡移栽a、将6步骤出瓶的生根苗和无根的根原基苗取出后在质量浓度为0. 的多 菌灵溶液中浸泡2分钟，将无根的根原基苗的根原基部沾300ppm的根太阳溶液后，与有 根苗一同扦插到以珍珠岩为基质的苗床上或育苗盘中，基质厚度为2. 5cm，扦插密度为 1. 5cmX 1. 5cm,前期按常规遮阴、保湿，7天后开始长根，35天后移出，完成一级过渡移栽；b、将a步骤移出的苗栽到质量比为红土腐叶土 = 1 1的营养基质中，浇透定 根水，无须遮阴，每天浇水1 2次，10天后每7天喷施一次复合肥，30天后移栽于大田，完 成二级过渡移栽，大田中的成活率在95 %以上。实施例21、外植体的选择在已开花的百万星植株中选出花多、重瓣成团、色白，且枝条硬， 无病虫害，无畸型的植株，再选取基部健壮且未形成花芽的茎尖和腋芽为外植体，剥去外层 叶片；2.外植体灭菌将1步骤选取的外植体切成2cm的茎段，在常规洗衣粉水中浸 泡3min，用自来水冲洗干净后，置于超净工作台内，用质量浓度为0. 1 %的Hgcl2溶液灭菌 15min，再转用质量浓度为2%的次氯酸钠溶液(其中加入适量吐温)消毒20min，最后取出 在无菌水中漂洗4次；3.诱导培养将经过上述消毒灭菌处理后的茎尖和腋芽在无菌条件下接种于下 列诱导培养基中MS基本培养液6-苄胺基嘌呤(6-BA)1. 5mg/L萘乙酸(NAA)0. 05mg/L
蔗糖30000mg/L琼脂 7000mg/LPH 6. 0在培养温度为25°C，光照时间12h/d，光照强度2000LX的环境条件下，培养13d 后，有80%的茎尖无污染，并在茎尖和腋芽的顶芽直接生成不定芽，每个茎段可生成3 5 个不定芽，继续培养至30天，使不定芽长至1. 5cm ；4.增殖培养在无菌条件下，将上述3步骤诱导出的不定芽分切后转入下列增殖 培养基中进行增殖培养MS基本培养液6-苄胺基嘌呤(6-BA)1. Omg/L萘乙酸(NAA)0. lmg/L蔗糖30000mg/L琼脂6000mg/LpH6. O在培养温度为20°C，光照时间12h/d，光照强度3000LX的环境条件下，培养25d，每 个不定芽可增殖成4 9个芽，芽体高度约为3cm ；为保证种苗质量，百万星增殖倍数应控 制在3 5 ；5.继代培养将4步骤所增殖的不定芽在无菌条件下按节切成3cm茎段，接种在 与4步骤相同的增殖培养基中，并在与4步骤相同的培养条件下培养，使每个不定芽又可增 殖出3 9个芽，芽体高度约为3cm ；如此继代7代，继代周期为22d，得到大量的无根不定 芽——植株高度为2 3cm的组培苗；6.生根培养增殖继代基数达到繁殖基数时，即可进行生根培养，将5步骤的组培 苗切下，再将组培苗上部0. 5cm长的苗尖切下后，余下的基部返回接种到4步骤的增殖培养 基中，再次进行继代培养；而切下的苗尖则插入到下列生根培养基中1/2MS基本培养液(大量元素减半)萘乙酸(NAA)0. 5mg/L吲哚乙酸(IAA)0. 3mg/L蔗糖30000mg/L琼脂6500mg/LpH6. O在培养温度为20°C，光照强度为2000LX，日光照时间为12小时条件下，培养12 天，切口稍膨大并出现白色突起，形成根原基，15天后有白色根系形成，出瓶；7、过渡移栽a、将6步骤出瓶的生根苗和无根的根原基苗取出后在质量浓度为0. 的多 菌灵溶液中浸泡2分钟，将无根的根原基苗的根原基部沾300ppm的根太阳溶液后，与有 根苗一同扦插到以珍珠岩为基质的苗床上或育苗盘中，基质厚度为2. 5cm，扦插密度为 1. 5cmX 1. 5cm,前期按常规遮阴、保湿，7天后开始长根，35天后移出，完成一级过渡移栽；b、将a步骤移出的苗栽到质量比为红土腐叶土 = 1 1的营养基质中，浇透定 根水，无须遮阴，每天浇水1 2次，10天后每7天喷施一次复合肥，30天后移栽于大田，完成二级过渡移栽，大田中的成活率在95 %以上。百万星通过组织培养年增殖倍数有50 80万，通过本发明所得到的无性系植株 均能延续其植株的优良种性，其开花整齐，花型特征一致、稳定。本发明经试验研究，其结果报告如下一、外植体的筛选在已开花的百万星植株中选出花多、重瓣成团、色白，且枝条硬，无病虫害，无畸型 的植株，再选取基部健壮且未形成花芽的茎尖和腋芽为外植体。二、快繁技术1.供试材料百万星茎尖和腋芽。2.试验方法同实施例2 ；3.试验结果培养基、培养条件、培养过程等均与实施例2相同，其结果如下表1不同激素配比对外植体的诱导情况


本发明提供一种百万星的组织培养与快速繁殖方法，经过外植体的选择、外植体灭菌、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养、继代培养、生根培养、过渡移栽等工艺步骤，在所对应的各种培养基上进行培养，直到长成生根苗后直接移栽即可，进种率可达90％，移栽成活率在95％以上。该方法解决了百万星无菌体系建立的关键技术，同时通过激素、营养、培养环境的综合调节，到达了进种效率高，增殖速度快，生产技术稳定的目的，实现了百万星规模化、标准化、工厂化生产。