专利名称：一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法梨(Pyrus spp.)是世界性的重要落叶果树，我国梨树栽培面积与产量仅次于苹果和柑桔，为第三大果树，在20多个省(区、市)均有分布。采用传统育种手段，梨的许多性状已经得到了改良，但现有的梨品种在遗传上对来自生物的和非生物的胁迫以及对影响果实品质的生理病害存在着许多弱点。这些问题可通过栽培管理来缓解，但要从根本上解决问题必须依靠选配优异亲本的常规育种和分子设计育种的改良途径。与其他木本果树一样， 由于梨的高度杂合性以及童期较长等特点，使常规育种周期较长。随着转基因技术的不断进展，缩短育种周期，定向引入有经济价值的外源基因已经成为可能。近年来，组织培养技术在果树快速育苗和培养无病毒苗方面均有广泛的应用。目前，在梨组织培养方面主要存在着繁殖系数低、生根率低、叶片再生困难等问题。采用茎尖培养可以在短期内大大提高繁殖系数，还可用茎尖培养先期获得试管梢，再取其叶片作为转基因的受体材料。茎尖培养的主要目的是脱病毒和快速繁殖。梨树病毒有20余种，如苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒等，普遍危害梨树，导致产量和果实品质下降，甚至引起树体急剧衰退，提早梏死而致绝收。国外虽然有许多关于西洋梨组织培养的文献资料，但西洋梨与我国主栽的白梨、砂梨不同，他们之间的遗传背景差异很大，无论是培养条件、对生长调节物质的需求还是植株再生的频率等均有很大区别，所以对西洋梨的研究结果并不能直接应用到我国的主栽品种中。探索适宜我国特定种类直至主栽梨品种的组培条件，并进一步完善高效、稳定的快繁及再生体系是当前急待解决的关键问题，同时也是梨树遗传转化的重要基础。梨树茎尖培养主要通过直接分化途径完成分化，并获得了完整植株，赵惠祥用‘锦丰’和‘早酥’实生苗的茎尖培养获得植株。先后有锦丰、早酥、锦香、鸭梨、秋水梨、幸水、丰水、巴梨、秋子和金花等品种培养成功。但是，存在繁殖系数低，曾云英以‘金花’梨为试材增殖倍数只能达到5.68，张玉娇以‘黄冠’梨为试材增殖倍数也只能达到5. 1，这种情况下无法进行离体快繁，为了解决以上问题，完善组织培养技术体系和扩大转化品种和转化方法，我们以‘翠冠’、‘黄花’和‘早香脆’三个主要栽培品种为试材，通过梨组织培养的研究表明，三个品种在最适宜的培养条件下，增殖率均可达到100%，增值系数最高可以达到12. 8，为梨大规模扩繁提供理论依据，同时建立了梨离体快繁技术体系。
本发明所解决的技术问题在于提供一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法。本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤I)外植体的准备取带芽枝条剪成单芽茎段，消毒后去除鳞片，切取裸芽接种于诱导培养基上；所述诱导培养基成分为1/2MS+6-BA 0. 8 I. 2mg/L+IBA 0. 05 0. 3mg/L+GA1. 0 3. 0mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 琼脂，培养基 pH 值为 5. 8-6. 0 ；2)丛生芽的诱导在诱导培养基培养l(T20d待芽长到0. 5^3cm,切取新梢转接到新的诱导培养基上，30-40d新芽形成并生长，每3周在相同的培养基上继代I次，5(T70d获得大量丛生芽；培养过程中，光照强度1500-20001x，光照15 18h/d，温度25_28°C ；3)继代培养采用继代培养基进行丛生芽继代培养，每30-40d继代增殖I次；培养条件为光照强度1500-20001X，光照16h/d，温度25-28°C ;所述丛生芽继代培养基为 1/2MS+6-BA1. 5mg/L+IBA 0. 05 0. 3mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 琼脂，培养基 pH 值为5. 8~6. 0 4)生根培养切取1-1. 5cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上，暗处理5d后再转光下培养，培养50-60d得到生根苗；培养条件为光照强度1500-20001X，光照16h/d，温度25-28°C ;所述生根培养基为1/2MS+IBA0. 3 I. 0mg/L+50^70g/L蔗糖+3 10g/L琼脂，培养基PH值为5. 8-6.0。I)外植体的准备优选将带芽枝条剪成单芽茎段，用洗衣粉漂洗，再用自来水冲洗30min，而后在超净工作台上用75%的酒精消毒20s，再用0. 1%的升汞溶液消毒8_10min，最后用无菌水冲洗4-5次。用解剖刀去除鳞片，切取裸芽接种于诱导培养基上；所述诱导培养基成分为 1/2MS+6-BA I. Omg/L+IBA 0. 2mg/L+GA 2. 0mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂，培养基pH 值为 5. 8-6. O。3)继代培养优选采用继代培养基进行丛生芽继代培养，每30-40d继代增殖I次；培养条件为光照强度1500-20001X，光照16h/d，温度25-28°C ;所述丛生芽继代培养基为1/2MS+6-BA I. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂，培养基 pH 值为 5. 8-6. 0 ；4)生根培养优选切取1-1. 5cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上，暗处理5d后再转光下培养，培养50-60d得到生根苗；培养条件为光照强度1500-20001X，光照16h/d，温度25-28°C;所述生根培养基为1/2MS+IBA 0. 6mg/L+60g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基PH值为 5. 8-6.0。有益效果本发明应用组织培养的手段，克服梨苗常规育种周期长，扦插繁殖系数低等特点，通过丛生芽的途径进行梨组织培养能够获得大量遗传性状稳定的试管苗，保持良好的亲本特性，而且取材容易，变异率低、增殖系数高，生根率达90%，大大提高了繁殖速度，且繁殖方法性能稳定，试验重复性好，试管苗分化良好，投入少，周期短，60天就可以获得大量的丛生芽。图I为‘早香脆’梨组织培养繁殖的试管苗；图2为‘早香脆’梨组织培养繁殖的试管苗生根状况。
从田间选取生长健壮、无病虫害的枝条，剪取幼嫩枝条做外植体。外植体用洗衣粉仔细漂洗，再用自来水冲洗30min，备用。2.外植体的消毒在超净工作台上将处理好的外植体用75%的酒精灭菌20s，再用0. 1%的升汞溶液灭菌8-10min，最后用无菌水冲洗4-5次。用解剖刀去除鳞片，切取裸芽接种于诱导培养基上，每瓶接种3个外植体。培养室温度为25°C，光照时间16h/d，光照强度1500-20001x ;期间注意观察，随时剔除污染的材料，以免交叉感染。诱导培养基成分为1/2MS+6-BA I. Omg/L+IBAO. 2mg/L+GA 2. 0mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 琼脂，培养基 pH 值为 5. 8-6. O。3.丛生芽的诱导采用诱导培养基培养15d左右待芽长到Icm左右，切取新梢转接到新的诱导培养 基上，30-40d新芽形成并生长，每3周在相同的培养基上继代I次，60d获得大量丛生芽。培养过程中，光照强度1500-20001x，光照16h/d，温度25-28°C。4.继代培养采用继代培养基进行继代培养；培养条件为光照强度1500-20001x，光照 16h/d，温度 25-28°C。继代培养基为 1/2MS+6-BA I. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基pH值为5. 8-6. O。三个品种的无菌苗按照上述方法每3周继代I次，共继代4次。翠冠的增殖率为100%，平均增殖系数为12. 8 ;早香脆增殖率为100%，平均增殖系数为9. 8 ;黄花增殖率为100%，平均增殖系数为7.4 (增殖系数(％)=培养基中> Icm丛芽总数/接种芽总数；增殖率(％)=(增殖芽数接种芽总数)X 100%)。5.生根培养切取1-1. 5cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上，暗处理5d后再转光下培养，培养50-60d得到生根苗；培养条件为光照强度1500-20001X，光照16h/d，温度25-28°C。生根培养基为1/2MS+IBA 0. 6mg/L+60g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基PH值为
5.8~6. O0三个品种的无菌苗在生根培养基中生根率最高，可达到90%，平均根数最高为7. 9(生根率(％)=(生根外植体数/接种外植体数)X 100)。以上实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。


本发明属于植物细胞工程技术领域，公开了一种梨茎尖组织培养快速繁殖方法。本发明采用1/2MS为基本培养基，在对外植体消毒之后，依次经过芽的诱导、丛生芽的增殖培养与继代、以及生根培养，获得再生植株。本发明的方法操作简单，取材方便，成本低，可以在短时间内获得大量遗传性状一致的无性系繁殖苗，有效地解决梨自根苗快繁的技术问题，同时也为梨遗传转化奠定了基础，具有重大的实用价值。