专利名称：一种引导组织再生膜及其制备方法引导组织再生膜(guidedtissue regeneration membrane, GTRM)是指应用膜屏障技术阻止结缔组织和上皮细胞长入骨缺损区，引导成骨细胞占据成骨空间，促进骨缺损的修复。GTRM通过外科手术将其置于骨缺损上方，与软组织接触的一面能将上皮细胞和成维细胞阻挡于缺损外，与骨组织接触的一面能引导来源自骨膜骨髓的骨生成细胞在其表面贴附，进而增值分化其分化为成骨细胞。GTRM为新生骨组织提供一个相对封闭的组织环 境，起到选择性组织再生的作用。根据在体内被吸收降解性能，GTRM可分为不可吸收性膜和可吸收性膜。常用的不可吸收性膜有膨体聚四氟乙烯膜、钛膜等等。在临床应用中显示了比较好的引导组织再生作用。但是该类材料不可降解，需要二次手术取出，这不但增加了患者的痛苦和感染的风险，延长了治疗时间，增加了花费，也可能引起组织的再次损伤，且不可吸收膜使用后常有伤口裂开和膜暴露的并发症，限制了不可吸收GTRM应用，这为可吸收材GTRM材料的发展提供了广阔的空间。GTRM材料最大优点是不需二次手术去除。可吸收GTRM被应用和研究最多是胶原材料，如Bio-Gide 就是非交联的纯I型和III型猪胶原构建的。国内外采用胶原成分构建引导膜也有一些报道，如国内专利公开第CN1586637A号张其清等采用I型胶原为主要原料，制备出一种双层复合引导组织再生膜，其中致密层由胶原经压制而成、疏松层由胶原和透明质酸或其钠盐组成，该双层复合膜通过交联剂交联、清洗冻干处理制备成成品，但是该方法制备引导膜还需要机械加压成型，不是直接工艺成型，而且仅采用化学交联。美国专利公开第US 2004/0214991A1号通过胶原膜在I型胶原和糖胺聚糖混合溶液浸溃、冷冻、真空冷冻干燥、挤压和交联，形成胶原和糖胺聚糖的复合物用于引导组织再生。Liu Sung-Tsuen等PCT申请国际公开号WO 01/15711A1还通过磷酸I丐在胶原上的矿化制备出一种均匀的矿化胶原膜，来用于引导组织再生。Matsuda等欧洲专利号第EP1022031B1制备出由胶原纤维的非织层、胶原海绵层、明胶或透明质酸的涂层构成的引导再生膜膜，其中胶原纤维是由胶原交联制备得到的，该引导再生膜具备足够的缝合强度和良好的生物相容性。Geistlic公司的专利国际公开号第WO 99/19005构建了一种基质层和隔离层组成的引导膜，其中基质层主要是由II型胶原构成，并具有海绵状质地结构，隔离层主要由I型和III胶原组成，是一层致密的质地结构，该引导膜特别适用于骨和软骨的再生修复。Geistlic公司专利国际公开号第WO 2010/082138 A2以胶原为主要原料，制备一种由光滑面、纤维面以及与附着纤维面的胶原海绵层构成的一种多层结构的膜，其中胶原海绵层还含有壳聚糖、弹性蛋白或透明质酸成分。同时该膜还可载入生长因子缓释微球。总体来讲，胶原材料具有无抗原性，生物相容性好，可参与组织愈合过程，降解速率可根据需要调节等优点，在阻止上皮迁移和促进新的结缔组织形成过程中同样有效，在肌腱、韧带、牙周组织及腹膜的修复等方面有重要的应用价值。胶原膜作为引导组织再生膜的研究还有一些问题亟待改进首先是体内降解速度过快；其次是相对于引导组织再生膜的要求，胶原膜的抗张强度较小，在应用过程中容易发生塌陷和移位而失去空间维持能力，再次由于材料制备工程中要通常冷冻干燥的方法，由于液体结冰时候体积的膨胀，制备质地均匀、大尺寸的的胶原膜的工艺还需要进一步改进。
本发明解决的技术问题是提供一种引导组织再生膜(以下简称为引导膜)，以解决现有技术中引导组织再生膜降解速度过快、强度较低、操作不方便的问题，同时解决了大尺寸、胶原膜的工业化生产时材料的均匀性的问题。本发明采用如下技术方案一种引导组织再生膜，包括致密层和疏松层，所述致密层由I型胶原，或I型胶原复合一定量的透明质酸组成；疏松层是由I型胶原，或I型胶原复合一定量的钙盐组成。 优选地，致密层由I型胶原复合透明质酸组成时，I型胶原与透明质酸的质量份数分别为0.1-1以及0. 01-1 ;所述疏松层由I型胶原复合钙盐组成时，I型胶原和钙盐质量份数分别为0. 1-1以及0. 1-2。疏松层呈海绵状、平均的孔径为100-250微米，厚度为1-2毫米；致密层相对致密，无微孔的存在，光滑呈半透明，厚度为0. 3-1毫米。所述的再生膜，其制备方法包括以下步骤 1)用醋酸溶剂来配制胶原溶液，或胶原与透明质酸混合溶液； 2)将步骤I所得的溶液通过展开器注入到自行设计的模具中，模具进行适当控温加热，在空气中干燥，制备致密层； 3)待致密层制备好后，通过另外一个展开器在其上面注入步骤I制备的胶原溶液，或注入步骤I制备的胶原溶液并加入钙盐的混合液，然后将其铺展开，放置约1-5小时； 4)然后把模具进行冷冻，冷冻干燥，制备出有致密层和疏松层结构引导膜；
5)将步骤4制备的引导膜进行真空高温交联和化学交联；
6)进行清洗，预冷冻、然后冷冻干燥从而制备得到由致密层和疏松层构成的引导再生膜；引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌等工艺制备出引导膜产品。所用模具是针对本发明专利工艺自行设计加工而成，实质包括一大面积的长方形平板，具备自动控温加热和烘干的功能，温度控制范围为0-80°C。溶液在致密层上均匀展开使用的展开器具也是自行加工设计的，模具和展开器一起使用时，可一次性制备大尺寸的(长宽大于I米)均匀膜。展开器是一个内装有溶液的微孔滚轴，微孔孔径为150，溶液从进料管流入滚轴内，并在一定压力下从微孔中缓慢流出，并随自动控制的滚轴不断来回滚动，这样均匀把溶液均匀铺展开。优选地,步骤I中所述醋酸的pH=l_3,所述溶液中胶原的质量分数为0. 1-1%,透明质酸的质量分数为0. 01-1%。所述步骤2中进行控温加热到0_80°C。步骤3中，所述混合液中钙盐的质量分数为0. 1_2%，钙盐颗粒度为纳米或微米级，选自羟基磷灰石、3 -磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙等中一种或多种。所述步骤4中，把模具放入超低温冰箱，在零下80-100°C超低温下冷冻两个小时，冷冻后放入冷冻干燥机内，在零下40-60°C条件下冷冻干燥24小时。
所述步骤5中，真空高温交联是在80_130°C下交联反应8-30小时；进行化学交联时，是在交联剂中浸泡6-24小时，交联剂的浓度为0. 1-1. 2%，交联剂选自戊二醛、京尼平、碳化二亚胺中的一种或多种。所述步骤6中，还进一步包括把清洗完的样品在零下20-40°C冷冻，然后在零下40-60°C条件下冷冻干燥，再将引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌的工艺从而制备出由致密层和疏松层构成的引导再生膜；所述清洗是待引导膜化学交联完后，向模具中加入生理盐水，并不断清洗，然后浸泡三天，除去样品中残留的交联剂，并将样品中的低分子物水洗掉。本发明的有益效果是
本发明制备的引导组织再生膜具备良好的组织相容性，抗原性低、良好的力学强度、易于操作，引导组织再生能力强。该引导组织再生膜在体内降解的速度为3-8个月。采用GB/T 528来测试，本发明的引导膜比现有引导膜产品具有更好的力学性能，断裂拉伸强度大于 IOMPa0采用GB/T16886. 5和GB/T16886. 12中规定的试验方法，实验测试结果表明引导膜的细胞毒性为0级。动物实验结合扫描电镜图显示成纤维细胞在致密层上生长状态良好，成骨细胞在疏松层上生长状态良好。该引导膜适合用于牙种植体周围骨缺损修复，牙周骨缺损修复、延期种植骨增高术、牙槽嵴的扩展和重建治疗、上颌窦提升术、截根术、囊肿切除和根尖切除术后的骨缺损充填、填充新鲜拔牙窝，以保持牙槽嵴顶的形态、牙槽突裂等症状。该引导再生膜更适合与自体骨、各种可注射骨修复材料、或各种颗粒或块体骨修复填充物、各种其他骨修复材料产品相结合引导骨组织损伤和缺损的再生修复。其适用范围广泛。本发明的方法操作简单，同时解决了大尺寸、胶原膜的工业化生产时材料的均匀性的问题。


图I是用于制备本发明引导膜组织再生膜的模具和展开器示意图。图2是本发明实施例的引导组织再生膜的疏松层的扫描电镜图。图3是本发明实施例的引导组织再生膜的致密层的扫描电镜图。图4是本发明引导膜的致密层在创伤修复早期形态扫描电镜图。图5是本发明引导膜的致密层开始出现降解的形态扫描电镜图。图6是本发明又一实施例的引导组织再生膜的疏松层的扫描电镜图。图7是本发明又一实施例的引导组织再生膜的致密层的扫描电镜图。图8是本发明实施例3T3成纤维细胞在致密层上的生长形貌的扫描电镜图。图9是本发明实施例MC3T3-E1成骨细胞在致密层上的生长形貌的扫描电镜图。具体实施实例
本发明是以I型胶原为主要原料，制备出一种由致密层和疏松层构成的引导再生膜，其中致密层由I型胶原，或I型胶原复合一定量的透明质酸组成；疏松层主要是由I型胶原，或I型胶原复合一定量的钙盐组成。其中疏松层呈海绵状、平均的孔径为100-250微米(如图2和6)，厚度为1_2毫米；致密层相对致密，无微孔的存在，比较光滑(如图3和7)，呈半透明，厚度为0. 3-1毫米。
该引导膜适合用于多种骨修复或与其他骨修复材料产品相结合引导骨组织损伤和缺损的再生修复。利用本发明的引导膜进行骨缺损修复时，通过外科手术将其置于骨缺损上方，与软组织接触的致密层能将上皮细胞和成维细胞阻挡于缺损外，与骨缺损组织接触的疏松层能引导来源自骨膜和骨髓的骨生成细胞在其表面贴附，进而增值分化其分化为成骨细胞。本发明制备的引导膜在临床上修复骨缺损时，当遇到较小缺损时，可以直接将引导膜置于缺损部位上方进行使用；当遇到较大骨缺损时，可以先采用自体骨、各种可注射骨修复材料、或各种颗粒或块体骨修复填充材料、以及其他的骨修复材料等产品对骨缺损进行填充或塑性，然后再将引导膜置于缺损部位上方，来阻碍软组织的长入，引导骨组织的正常生长，促进骨修复。本引导组织再生膜具备良好的组织相容性，抗原性低、良好的力学强度、易于操作，引导组织再生能力强。本发明制备的引导膜的拉伸强度采用GB/T 528来测试断裂拉伸 强度大于lOMPa。体外细胞毒性采用GBT16886. 5和GBT16886. 12中规定的试验方法，实验测试结果表明引导膜的细胞毒性为0级。本发明制备的引导膜在体内降解的速度为3-8个月，降解速度取决于产品制备工艺和手术植入的部位，如该引导膜在牙种植体周围骨缺损修复，牙周骨缺损修复、延期种植骨增高术、牙槽嵴的扩展和重建治疗、上颌窦提升术、截根术、囊肿切除和根尖切除术后的骨缺损充填、填充新鲜拔牙窝，以保持牙槽嵴顶的形态、牙槽突裂等临床应用时，最快降解周期为3个月，最慢为8个月。与骨修复的周期对应。为制备出上述引导再生膜，请同时参照图1，本发明采用如下技术方案利用自行设计的模具和展开器先制备出致密层，然后在致密层上制备疏松层，最后进行交联。本发明的模具I有较大尺寸，底部为平板，优选大致呈长方形，也可根据引导再生膜的形状要求设计成不同形状。模具I具有自动控温加热和烘干的功能，温度控制范围为0-200°C，一般在0-80°C;可通过现有技术的实施方式进行配置，以利于保证再生膜的质量均匀性。模具I内配套设置有展开器2，模具和展开器一起使用时，可一次性制备大尺寸(长宽大于I米)的均匀膜。展开器2是一个内部可盛装溶液的微孔滚轴，微孔3的尺寸为150微米(但不限于150微米)，滚轴内的溶液在一定压力下从微孔中缓慢流出，并随自动控制的滚轴不断来回滚动，这样便可均匀地将溶液在模具I内铺展开。溶液通过连续进料管4注入展开器2的滚轴内。具体制备方法包括以下步骤
(I)用一定酸度的醋酸溶液作为溶剂来配制胶原溶液，或胶原与透明质酸混合溶液；其中醋酸溶液的pH为1-3,胶原溶液的质量分数为0. 1-1%,透明质酸的溶液的质量分数为0. 01-1%。I型胶原选自提取于牛跟腱、猪跟腱天然I型胶原、重组人类I型胶原中一种或多种，透明质酸采用药用注射级透明质酸或其钠盐(透明质酸钠)。胶原、或胶原与透明质酸溶解后，离心，取胶原溶液或胶原与透明质酸混合溶液的上清液待用。(2)将离心的胶原溶液或胶原与透明质酸混合溶液通过展开器2注入到模具I中，并展开，模具进行控温加热，温度控制在0-80°C下，更优选地控制在0_45°C下，在空气中干燥两天，制备致密层；其中致密层可通过控制注入溶液的量来控制厚度的制备得到不同厚度。
(3)待致密层制备好后，通过展开器2在其上面注入步骤I制备的胶原溶液，或注入步骤I制备的胶原溶液并加入钙盐的混合液，然后将其铺展开，并优选放置约I小时；其中混合液中钙盐的质量分数为0. 1-2%;钙盐颗粒度为纳米或微米级，选自羟基磷灰石、3 -磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、硫酸钙等中一种或多种。(4)然后把模具放入超低温冰箱，在零下80-100°C超低温下冷冻两个小时，冷冻后放入冷冻干燥机内，在零下40-60°C条件下冷冻干燥24小时，制备出有致密层和疏松层结构引导膜。(5)把装有引导膜的模具放入真空干燥机内，在抽真空的状态下，高温交联8-30小时；高温交联的温度为80-130°C。然后向模具内加入交联剂，交联剂是一次性加入，将高温交联后的引导膜浸泡一段时间以进行化学交联。交联剂的浓度为0. 1-1. 2%，选自戊二醛、京尼平、碳化二亚胺等交联剂中的一种或多种。(6)把化学交联完的引导膜用生理盐水不断清洗，然后浸泡三天，除去样品中残留 的交联剂，并将样品中的低分子物以水清洗，以除去如醋酸及剩余的盐等。把清洗完的样品在零下20-40°C冷冻，然后在零下40-60°C条件下冷冻干燥，制备得到由致密层和疏松层构成的引导再生膜。引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌等工艺制备出引导膜产品。设置一卷轴将引导膜从模具内取出，重复步骤1-6进行新的生产，这样便可实现引导再生膜的全自动化连续规模化生产和成型工艺。下面通过具体实例并参照附图对本发明进行更详细的说明。应该理解的是，以下所述的实例仅是用于说明而不是限制本发明。例I
本发明制备的引导膜的具体制备方法如下
1)用0.5%的醋酸溶液PH=2-3范围内，配制浓度为0. 6%的胶原溶液；
2)待胶原溶解后，以转速为4400rp/min离心；
3)把一定量离心好的胶原通过展开器2注入到模具I中，模具加热到45°C，在空气中干燥两天，制备致密层；
4)待致密层制备好后，通过展开器2在其上面注入一定量的离心好的胶原溶液并均匀展开，放置I小时；
5)在放置后把模具放入_86°C的超低温冰箱冷冻两个小时，冷冻后放入冷冻干燥机内冷干24小时，制备得到双层结构的引导膜；
6)把制备的引导膜放入真空干燥机内，在抽真空的状态下，90°C交联24小时；
7)待引导膜高温交联后，向模具中一次性加入0.5%戊二醛溶液进行化学交联，浸泡交联8小时；
8)待化学交联完后，向模具中加入生理盐水并不断清洗，然后浸泡三天，置换样品中残留的戊二醛，并用水进一步清洗；
9)把清洗完的样品冷冻2小时，然后冷冻干燥24小时，制备得到双层引导膜。引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌等工艺制备出引导膜产品。所制得的引导膜，参照图2和3，其疏松层呈海绵状、平均的孔径为100-250微米(如图2)，厚度为1-2毫米；致密层相对致密，无微孔的存在，比较光滑(如图3)，呈半透明，厚度为0.3-1毫米。本实例制备的引导膜的拉伸强度采用GB/T 528来测试断裂拉伸强度16.7 Mpa0进行体外降解实验，参照图4-5，2个月时，引导膜致密层还能维持良好致密性，如图4所示，在创伤修复早期维持致密层的良好致密性将能隔离软组织的长入骨缺损内，有利于骨组织的修复；致密层3个月时开始出现降解，如图5所示；7个月左右基本完全降解。例2
本发明制备的引导膜的具体制备方法如下
1)用0.5%的醋酸溶液PH=2-3范围内，配置浓度为1%的I胶原溶液；
2)待胶原溶解好，用转速为4400rp/min离心；
3)把一定量离心好的胶原通过展开器2注入到模具I中，模具加热到45°C，在空气中干燥两天，制备致密层；
4)在离心好的胶原溶液中，加入￠-磷酸三钙搅拌均匀，￠-磷酸三钙质量分数为
0.5% ;待步骤3中的致密层制备好后，通过展开器2在其上面注入含0. 5% P -磷酸三钙的胶原溶液，并均匀铺展开，放置I小时；
5)在放置后把模具放入_86°C的超低温冰箱冷冻两个小时，冷冻后放入冷冻干燥机内冷干24小时，制备得到双层结构的引导膜；
6)把制备的引导膜放入真空干燥机内，在抽真空的状态下105°C交联24小时；
7)待引导膜高温交联后，向模具中一次性的加入0.5%京尼平溶液进行化学交联，浸泡8小时；
8)待化学交联完后，向模具中加入生理盐水不断清洗，然后浸泡三天，置换样品中残留的京尼平；
9)把清洗完的样品冷冻2小时，然后冷冻干燥24小时，制备得到双层引导膜；引导膜直接从模具中取出，进行裁剪、包装和灭菌等工艺制备出引导膜产品。本实例制备的引导膜是由致密层和疏松层构成的双层结构，其中疏松层，如图6，呈海绵状、平均的孔径为100-250微米，厚度为1-2毫米。致密层，如图7，其相对致密，无微孔的存在，比较光滑，呈半透明，厚度为0.3-1毫米。本实例制备的引导膜的拉伸强度采用GB/T 528来测试断裂拉伸强度为12. 5MPa。体外细胞毒性采用GB/T16886. 5和GB/T16886. 12中的试验方法，实验测试结果表明引导膜的细胞毒性为0级。将3T3成纤维细胞接种在本实例制备的引导膜的致密层进行培养，请参照图8，图8是3T3成纤维细胞在致密层上的生长形貌的扫描电镜图，成纤维细胞在致密层上生长状态良好，致密层具有很好细胞相容性。将MC3T3-E1成骨细胞接种在疏松层上进行培养，请参照图9，图9是MC3T3-E1成骨细胞在疏松层上的生长形貌的扫描电镜图(如箭头所示)，疏松层能促进成骨细胞在其表面贴附和生长，成骨细胞在疏松层上生长状态良好。例3
将本发明例I和例2制备的引导膜，进行动物实验，用于狗的牙种植体周围骨缺损模型的修复，将引导膜置于缺损部位上方，引导膜的致密层超上放置，与软组织接触，避免软组织长入骨缺损部位；引导膜的疏松层朝下，与骨缺损组织面接触的，引导来源自骨膜和骨髓的骨生成细胞在其表面贴附，进而增值分化其分化为成骨细胞，促进骨缺损的修复。本应用实例中，引导膜在体内降解的周期为6个月。


本发明涉及一种引导组织再生膜，包括致密层和疏松层，致密层由I型胶原，或I型胶原复合透明质酸组成；疏松层由I型胶原，或I型胶原复合钙盐组成。其制备方法为用醋酸配制胶原溶液或胶原与透明质酸混合溶液；将溶液注入自制模具，空气中干燥以制备致密层；在致密层上注入胶原溶液，或胶原溶液与钙盐混合液，并铺展均匀；再对模具进行超低温预冷冻，然后冷冻干燥，制备有致密层和疏松层结构引导膜；并进行真空高温交联和化学交联；最后清洗。本发明再生膜具备良好的组织相容性和力学强度，抗原性低、引导组织再生能力强，体内降解速度为3-8月。该方法易于操作，适于自动化连续规模生产，解决胶原膜大尺寸、工业生产时材料均匀性的问题。