控制诱导体细胞突变的方法及其在蛋白质组学中的应用制作方法

克洛德-阿涅丝·雷诺, 让-克洛德·魏尔

2006年11月15日

2002年12月17日

2001年12月18日

耐克尔研究院

C12N15/90GK1863911SQ02828181

体细胞 诱导 突变 控制

1.在活体外诱导体细胞突变的方法，其特征在于它包括(1)在适合于待突变细胞的培养条件与培养基中，往所述细胞中添加至少一种抗体组合，该组合包括选自抗IgM和抗CD19抗体组合、抗IgM和抗CD21抗体组合、以及抗IgM、抗CD19和抗CD21抗体组合的抗IgM抗体，而(2)所述的抗IgM抗体进行生物素处理，并且使用与载体偶合的链霉亲和素进行特异性聚集2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的载体是全部或部分地由磁珠组成的3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于使用Burkitt BL2淋巴瘤为待突变细胞4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于通过添加一定比率的DNA聚合酶pol iota控制所述的体细胞突变5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其特征在于通过转染载体pIRES，使得在CMV启动子控制下达到pol iota的cDNA表达由此修复预先失活的DNA聚合酶pol iota6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法在实施蛋白质和/或基因水平超诱变性活体外试验中的应用7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于它应用于B淋巴瘤，特别是应用于人的B淋巴瘤8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于它用于在Burkitt BL2淋巴瘤上诱导突变9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于它用于在G0/G1期的Burkitt BL2淋巴瘤上诱导突变10.根据权利要求6-9中任一权利要求所述的应用，其特征在于它还包括DNA聚合酶pol iota应用于调节在蛋白质和/或基因水平的超诱变性活体外试验中的超诱变性，特别是B淋巴瘤，尤其Burkitt BL2淋巴瘤上的超诱变性11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于使用经改进的DNA聚合酶pol iota，即在更换至少其中一种天然氨基酸后修复的DNA聚合酶pol iota12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于通过随机诱变形成环状II区进行所述的pol iota改进，以便更换其中至少一种氨基酸13.诱导体细胞突变的试剂盒，其特征在于它包括诱导体细胞突变的工具，其中包括至少一种抗体组合，这种组合包括选自抗IgM和抗CD19抗体组合、抗IgM和抗CD21抗体组合、以及抗IgM、抗CD19和抗CD21抗体组合的抗IgM抗体14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于所述的抗IgM抗体被生物素化，并且通过与载体偶合，特别是与磁珠偶合的链霉亲和素进行特异性聚集15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其特征在于它还包括用于pol iota基因失活和/或通过pol iota的cDNA表达修复其基因的工具16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于它包括经改进的DNA聚合酶pol iota，即在更换其中至少一种天然氨基酸后修复的DNA聚合酶pol iota17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于所述的DNA聚合酶pol iota是一种通过随机诱变形成环状II区以便更换其中至少一种氨基酸而被改进的pol iota酶18.诱导体细胞突变的试剂盒，其特征在于它包括实施如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法的工具19.根据权利要求13-18中任一权利要求所述的试剂盒在定性和/或定量鉴定，特别是采用蛋白质分析鉴定mutasome组分中的应用20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于它包括鉴定所诱导的翻译后修饰，特别是通过鉴定、分离和分析mutasome组分，尤其在所述诱导时出现的蛋白质组分21.根据权利要求19所述的应用，其特征在于它包括提供至少一种基因，特别是希望在其上诱导突变的蛋白质编码基因，而试剂盒中包括所述的基因，该试剂盒装有IgG重链或轻链编码基因的启动子和增强子，并且所述基因转染到淋巴瘤细胞中，特别是BL2 Burkitt淋巴瘤细胞中22.根据权利要求19-21中任一权利要求所述的应用，其特征在于为了使任何序列突变，优选在突变试剂盒中，用Ig的启动子和增强子环绕待突变序列23.根据权利要求19-21中任一权利要求所述的应用，其特征在于为了使任何序列突变，采用同源重组把所述序列插入免疫球蛋白的位点上，更换两个重排位点的全部或部分V基因

本发明涉及生物学，更特别地涉及采用对生物界特异定向突变的调整领域更具体地，本发明涉及活体外诱导体细胞突变，以及这样一种技术在今后有可能获得改进而得到的应用对于一种特别实施方式，本发明涉及对BL2 Burkitt淋巴瘤的诱导突变本发明的技术背景为了简化起见，下文涉及BL2 Burkitt淋巴瘤但应强调这只是便于公开所涉及的技术和要求保护的发明构思，并不因此而限制本发明BL2I型Burkitt淋巴瘤细胞系具有中心母细胞(centroblastiques)的B细胞特性这种细胞系是生发中心中心母细胞的最接近永生相应物已通过在Burkitt淋巴瘤免疫球蛋白VH基因中存在的体细胞突变证实了其生发中心源着重指出了在适当培养物中BL2细胞的同质性和稳定性(Denépoux S.等人，《免疫(immunity)》，第6卷，第35-46页，1997年)曾提出，按照中心母细胞表型应认为，BL12是由经受多个体细胞突变段的生发中心中心母细胞转变得到的另外，估计B细胞在中心母细胞段经受超突变(Pascual V.等人，《J.Exp.Med.》，180，329-339(1994))用T-相关抗原刺激B细胞后，在生发中心发生免疫球蛋白的过突变现象特别地，Denépoux S.等人(同前述)确定了，淋巴瘤细胞，尤其是BL2细胞在其表面受体聚集和与T-辅助细胞或扩增细胞共培养后，在培养一星期后可能启动超突变过程由这篇文章可得出，正是通过重复激活BL2细胞，可以增加这种细胞的突变频率这些作者还强调指出，在活体外内诱导BL2突变不影响IgM的不变区，没有显示出由抗原定向的选择性Yélamos J等人在《自然(Nature)》，第376卷，第225-229页(1995)中也描述了一些实验，这些实验易于证明免疫球蛋白的V基因片段对于超突变不是必不可少的，还证明构建人工突变底物应加以简化尽管有这些发展，但直到今天还没有提出有效的办法研究这些现象，还未获得这些现象的实际结果，特别是在令人满意的快速实施条件下在肿瘤病变过程的诊断和/或跟踪以及治疗后也未获得这些现象的实际结果因此需要一些能够实施快速可信的体细胞超突变试验方法更具体地需要一些能够提出诱导体细胞突变模型的方法，这些方法可应用于V基因，还可应用于在肿瘤病变过程中，特别是人体内可能涉及的其它基因，例如像Bcl-6和Fas Ligand(FasL)基因然而，人们现在发现，淋巴瘤细胞，特别是BL2细胞，可以启动加速超突变过程，现有技术的数据则相反，按照这些数据，可比过程很长，实施也令人厌倦更确切地，现在出乎意料地发现，对于使用BL2细胞模型，在适合于待突变细胞的培养条件与培养基中，往所述细胞中添加至少一种抗CD19、抗CD21和抗IgM抗体的三元组合，可以在异常快速有效的条件下，在合适细胞中活体外实施诱导体细胞突变因此，本发明的目的是一种在试管中或在活体外诱导体细胞突变的方法，该方法包括(1)在适合于待突变细胞的培养条件与培养基中，往所述细胞中添加至少一种抗CD19、抗CD21和抗IgM抗体的三元组合，而(2)所述的抗IgM抗体进行生物素化(biotinylés)，并且使用与载体，有利地与全部或部分地由磁珠组成的载体偶合的链霉亲和素进行特异性聚集根据一个特征，本发明的诱导体细胞突变是在短时间内，实际上在约1小时30分钟时间内进行的根据有利的特征，本发明的方法不包括与其它类型细胞，尤其是与T细胞进行共培养事实上，人们观察到，根据本发明推荐的方法，其中使用与载体，例如优选地磁珠偶合的链霉亲和素进行生物素处理的抗IgM抗体进行特异性聚集，以及至少抗CD19、抗CD21和抗IgM三种抗体的组合，在这些抗体存在下，培养细胞在活体外在非常短的时间内达到快速突变，这个时间与根据现有技术活体外达到突变所指出的时间是无法比拟的根据一种实施方案，本发明的方法可以包括一种选自抗IgM和抗CD19抗体组合、抗IgM和抗CD21抗体组合，以及它们的任何比例混合物的抗IgM抗体组合根据另外一个特征，BL2 Burkitt淋巴瘤进行诱导突变可以使用本发明的方法本发明还有一个目的是这种诱导体细胞突变方法应用于在蛋白质和/或基因上进行活体外超诱变性试验根据一种实施方式，这种应用可用于B淋巴瘤，特别是人的B淋巴瘤，更具体地用于诱导BL2 Burkitt淋巴瘤突变根据一种特别优选的实施方式，本发明的系统可用于诱导G0/G1期的BL2 Burkitt淋巴瘤突变本发明还有一个目的是一种诱导体细胞突变试剂盒，其特征在于它包括一种如前面定义的体细胞突变诱导系统本发明的另外一个目的是这种试剂盒在定性和/或定量鉴定mutasome组分，特别地通过分析蛋白质定性和/或定量鉴定mutasome组分中的应用在一种实施方式中，本发明试剂盒的应用包括鉴定翻译后诱导修饰，特别地通过鉴定、分离和分析mutasome组分，尤其在所述诱导时出现的蛋白质组分鉴定翻译后诱导修饰根据一种优选的实施特征，这种应用包括提供至少一种基因，特别是希望诱导突变的有益蛋白质编码基因，而试剂盒中包括所述的基因，该试剂盒装有IgG重链或轻链编码基因的启动子和增强子，并且所述基因转染到淋巴瘤细胞中，特别是BL2 Burkitt淋巴瘤细胞中根据一种有利的实施方式，为了使任何序列突变，优选地在突变试剂盒中用Ig的启动子和增强子环绕待突变序列下面参看一个实施例描述本发明，该实施例是纯说明性的，并且目的在于使本技术领域的技术人员获得能实施本发明的实际指示基于这些指示和专门知识，本技术领域的技术人员能构想类似或等效的试验系统而不超出本发明的范围，还能构想与这里描述的相同或不同的各种不同的具体应用为了在BL2细胞上在活体外诱导体细胞突变，可按如下进行-BL2细胞培养条件提供BL2细胞，并按照每ml为105个细胞在完全培养基中在37℃与5％CO2条件下保持24h这种培养基是RPMI 1640培养基，用10％FCS以及100U/ml(单位/ml)青霉素和100μg/ml链霉亲和素补足-刺激用RPMI培养基洗涤这些细胞，在温度4-10℃下，以约1500转/分离心7分钟除去所有微量血清再按照每500μl为106个细胞将这些BL2细胞溶于RPMI培养基中在15ml瓶中，把106个细胞加入冰中，再添加·20μl与FITC偶合的抗CD19(由Immunotech提供)，·20μl与PE偶合的抗CD21(由Becton Dickinson提供)和·4μl与生物素偶合的抗IgM(由Immunotech提供)搅拌直至得到均匀混合物后，将该混合物放到冰上，放置约20分钟然后，用10ml RPMI培养基(在4℃)洗涤这种混合物中的细胞，再在1500转/分条件下离心7分钟然后将如此洗涤细胞溶于装在Eppendorf管(1.5ml)中的500μl RPMI里，添加20μl以商品名Dynal销售的偶合链霉亲和素的磁珠让其管在轮上在约4℃下转动15分钟用约4μl完全培养基处理这些细胞和固定这些细胞的珠，该培养基添加了ADCM(由法国，le Centre de transfusion de Lyron提供)，然后把这些处理的细胞分配到有24孔的测定板上进行细胞培养(按照每个孔约2×105个细胞)让这些细胞在37℃下培育约1小时30分钟然后将整个孔的内容物再放到1.5ml Eppendorf管中，再在2000转/分条件下离心10分钟取出离心产物，除去上清液，将离心管座浸入液氮中采用本技术领域技术人员已知的通常使用的经典分子技术，进行DNA突变试验对所得到的结果与对VH不同基因和/或使用除BL2之外的其它细胞进行平行研究结果进行分析表明，于是可以在活体外在BL2细胞中对通过刺激表面受体基团而重排的VH基因诱导突变变通地，可以例如用原核生物序列，例如抗新霉素基因置换Ig序列，并且可以使用BL2达到类似突变于是，根据本发明可以确定-在没有与T细胞共培养的情况下，用抗原受体和一组共受体刺激后，在约1小时30分钟可以诱导突变；-平均约三分之一细胞经受超突变机制；-在放线菌素D存在下进行本发明的诱导突变，该放线菌素D完全抑制了转录；-用羟基脲将这些细胞保持在G0/G1期时，则诱导这些突变；-采用淘洗制备G0/G1期细胞时，在约30分钟内也诱导这些突变这些结果与现有技术的说明背道而弛，这些结果表明可以在没有转录和姊妹染色单体的情况下进行超突变过程实际上，于是可以用两种尺寸凝胶研究蛋白质缺失和出现，但也可以研究它们的翻译后修饰另外，在适当细胞，例如BL2 Burkitt淋巴瘤中，通过刺激表面受体，可以预诱导根据本发明如此实施的体细胞突变还非常很可能地在活体内产生这类的刺激本发明的方法与手段能根本性达到更优良的条件，并且能够可靠地研究与试验确定基因，特别是免疫球蛋白基因的超突变现象通过实施本发明的手段可以达到的某些发展和某些应用汇集如下很清楚的是，这种列举不是限制性的，并且还可以考虑其它的应用作为实例，重要的是在直到现在还未能实现的条件下，根据本发明可以确定在生发中心中B细胞恶性转变时体细胞超突变的作用与重要性是什么样的本发明通过提供一种诱导体细胞突变的简单快速独特模型，能够证明在没有转录和姊妹染色单体的情况下可以进行超突变过程本发明以能安排一个特别应用于人的B淋巴瘤的简单试验作为目的，可以提供获得蛋白质和基因水平的超突变信号的手段直到今天其它还未解决的问题尤其是超突变和可能存在的高诱变聚合酶的分子机制问题，以及存在的辅助因子问题事实上应该提及，这些辅助因子，即能将超突变过程对准在确定免疫反应阶段重排VH和VL基因的mutasome组分，这些因子是人们不知道的本发明的试验系统可获得跟踪这样一种超突变过程动力学的快速可信手段，并且对于本技术领域的技术人员来说，基于本说明书所阐明的专门知识，该系统能够实现特别可应用于人的B淋巴瘤的经济的快速试验本发明另外一个目的因此是诱导超突变并能进行相关试验的试剂盒或所有工具，其中诱导快速超突变的工具包括一组如前面描述的抗体更一般地，本发明提供的工具能研究和跟踪在DNA和蛋白质水平体细胞突变过程的最前面的分子段简言之，借助本发明的实施工具，例如在BL2细胞中，可以通过同源染色体重组修饰基因或使其基因失活因此本发明的技术因此能在细胞，特别地在BL2细胞中实施，这样能够改善这些细胞的诱变性能，而且还试验了这样的分子在B细胞和Burkitt淋巴瘤生理学中可能起的作用使用本发明的工具，作为非限制性实例，因此可以达到某些基因在BL2中的过表达，并由此改善了该细胞的诱变细胞性能，而在该过程中似乎牵涉的分子的转染可能特别是涉及AID、MSH2、MSH6或RAD30A和/或RAD30B类酶在细胞周期G1期可诱导这些突变，并且在重排VH基因的DNA股上产生这些突变，在其中一个子细胞中通过复制而可能固定本发明另外还能确定在免疫球蛋白基因的这样一种体细胞超突变(SHM)过程中pol iota的决定性作用，pol iota是一种Y组DNA聚合酶为了产生缺少pol iota的BL2的克隆(它是RAD30酵母中两种人的同源染色体中的一种，该酵母具有极易产生错误的聚合酶的活性，具有填满DNA不足缺失的活性)，采用了与曾研制使AID(采用激活诱导的胞苷脱氨基酶)的基因失活方法类似的基因失活方法曾描述过AID分子，具体地Muramatsu，M等人，类别转换重组和超突变需要激活诱导的胞苷脱氨基酶(AID)，可能的RNA编辑酶，《细胞(cell)》，102，553-63(2000)；和Revy，P等人，激活诱导的胞苷脱氨基酶(AID)缺失引起Hyper-IgM综合症(HIGM2)的常染色体隐性形态，《细胞(cell)》，102，565-75(2000)由pol iota的杂合性克隆产生了两种pol iota克隆-/-(54和267)使用适当的结构可使两种等位基因失活两种iota克隆-/-具有与原始BL2细胞系相同的增殖速度，并且有类似的有丝分裂指数和细胞周期分布图(profil)，还没有染色体畸变或易位使用对人的pol iota高多克隆兔抗体时，在iota克隆-/-54和267的细胞提取物Western斑点中未检测到任何的pol iota的表达pol iota表达可通过pIRES载体转染再饱和，这种转染在CMV启动子控制下可引起完全人pol iota的DNAc表达在进行的这些实验中，在采用Western斑点定量分析的固有变化限内，这些表达百分率可与对正常BL2细胞系观测的表达百分率相比在多次尝试后，无论在正常基底(背景)上还是在缺失pol iota的基底上都不可能达到过表达pol iota的克隆接下的分析选择了每种靶细胞的两种修复克隆可以采用两种不同的方法诱导BL2细胞系中重排VH基因的超突变第一种方法涉及在共培养基中抗IgM与辅助T克隆或辅助T细胞系的杂交键或交联，在这种情况下如果产生突变，则在培养3天后观察到这些突变(见Denépoux，S等人，同上；Poltoratsky，V等人，Ig体细胞超突变时在激活BL2细胞中易于出错聚合酶的表达，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》98，7676-81(2001))在本试验中，CB15细胞系是一种在共培养基中用Saimiri疱疹病毒转化的T细胞，应用这种CB15细胞系和IgM杂交键合，接着用链霉亲和素珠进行生物素处理的抗IgM抗体聚集，可以改变这种SHM诱导系统第二种方法只涉及表面三种受体IgM、CD19和CD21，或IgM+CD19和/或IgM+CD21组合的交联或杂交键合，接着用链霉亲和素珠进行生物素处理的抗IgM抗体同样聚集，在这种情况下，在仅仅培育90分钟后观察到突变根据这两种方法，仅一个诱变循环达到的突变频率是类似的，即每对碱基为4-6×10-4(见下面表1)BL2细胞系在其保持培养基中时也具有重排VH基因非常低的连续突变频率，实际上在培养基中2-3个月后每对碱基不超过10-4次突变无论在T细胞培养中，还是在有上述三种抗体的试验中，超突变时诱导缺失pol-iota 54或267的克隆时，未观察到突变频率的任何可检测的增加在刺激前对222个序列中的5个序列刺激后，在298个V序列中只显示7次突变相反地，在与正常BL2具有的可比水平下，在这些克隆中通过pol iota的cDNA再表达可修复诱导突变在刺激前对547个V序列中的6个V序列刺激后，在547个V序列中产生83次突变另外，在表达pol iota的这些克隆中修复的突变示意图是与BL2突变示意图相似的，并且有高的GC碱基对导向和转换倾向(见表2)如正常BL2一样，pol iota的修复克隆Cμ基因在诱导后显示未突变表1在缺失pol iota和pol iota完全的BL2亚-克隆中V基因突变频率 注突变频率以每个核苷酸的突变表示，括号中表示每个序列化V基因的总突变数(416pb)表2对于pol iota表达，修复BL2的pol iota细胞系-/-V4-39-JH5基因中产生突变中核苷酸取代百分数 注对含有9个插入子的总计83次突变(表1列出的)，分析出在416pb的VDJ序列中有七十四个靶碱基取代物由V片段碱基组成校正取代物百分数黑体字的数字涉及在修复pol iota克隆中诱导的突变，而括号中是诱导正常BL2的相对值本发明的另一个目的是DNA聚合酶pol iota应用于特别在B淋巴瘤上，尤其在Burkitt BL2淋巴瘤上蛋白质和/或基因水平的超诱变性活体外试验中的超诱变性调节本发明还有一个目的是改进的DNA聚合酶pol iota，特别是根据本技术领域技术人员已知的技术在更换其中至少一种天然氨基酸后修复的DNA聚合酶pol iota，应用于提高这样一些试验中的超诱变性根据本发明，有利地，可以随机地诱变环状II区可进行这种pol iota改进，以便更换其中的至少一个氨基酸，然后修复酶的功能本发明还有一个目的是如前面描述的诱导体细胞突变试剂盒，该试剂盒还装有使pol iota基因失活和/或通过pol iota的cDNA表达修复它们的工具在下面实验部分会更详细地说明鉴定这种pol iota作用在BL2细胞系中诱导V基因超突变按照两种不同的操作方式诱导了V基因超突变采用第一种操作方式时，根据前面描述的方案进行表面受体IgM、CD19和CD21的杂交键合第二种激活方式基于与CB15细胞系共培养，该细胞系是用Saimiri疱疹病毒转化的辅助T细胞系CB15在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养，该培养基补充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素/链霉素(Invitrogen)和50单位/ml IL2(Sigma)CB 15用4000拉德辐照，在加2％Caryoser(CTS，里昂)的完全培养液中制成悬浮液，然后按照每个孔500000个细胞放到24孔板或凹槽中，它们用抗CD3覆盖一夜(OKT3，Janseen-Cilag，2.5μg/孔)2×106BL2细胞与生物素处理的抗IgM抗体(0.6mg/ml，Caltag Laboratories)在0.5ml RPML中在冰上培养20分钟，然后与链霉亲和素共轭的磁珠(Dynabeads M280，Dynal)在转动盘上在低的温度下交联20分钟BL2按照100000个细胞/ml在加2％Caryoser的RPMI培养液中制成悬浮液，然后按照每个孔0.5ml放到24孔中，孔中装有辐照的CB15和抗CD3(BL2∶CB15比为1∶10)在37℃培养3天后取出这些细胞，使用称之DNeasy tissue kit(Qiagen)的合适试剂盒提取DNA，在V4-39-JH5基因扩增后分析这些突变通过电泳图的多次校准，并使用AutoAssembler软件鉴定这些突变BL2中的pol iota基因去激活作用使用含有所有编码外显子的180kb AC021325的HTGS克隆回收人的pol iota染色体组序列使用BL2的染色体组DNA使产生靶结构所使用的DNA片段扩增，并且首先用ACP TOPO-XL(Invitrogen)的克隆选择盒进行克隆，如果SaII和Xhol的位点添加到ACP引物，则使用它们切割，如果不包括限制位点，则呈MluI-NotI片段形式，以及在pBSK载体(Stratagene)的相应位点中进行克隆，载体中在polylieur的SacI位点添加SfiI和MluI位点新霉素和潮霉素抗性基因插入在5′和3′环绕片段之间下面的ACP引物用于其扩增第一等位基因5′，5′-iota-5′片段，CACTCGAGTACCAGCCGTCTGGTGTTTG， 和5′-iota-3′，CAGTCGACTACAGFCTCCAGTCGCTC(3.1kb)；3′，3′-iota-5′片段，CACTCGAGCTCAAATCCAGAGCTAAAAG，和3′-iota-3′，CAGTCGACATAGTTGCAGGTAACCACC(2.5kb)；第二等位基因5′，5′-iota2-5′片段，CACTCGAGAGAGCGACTGGAGACTGTAG，和5′-iota2-3′，ACGTCGACAGGAAGAATGCAGAGTGACG(1.8kb)；3′，3′-iota2-5′片段，CTCAGTCGACGGTGGTTACCTGCAACTATG，和3′-iota2-3′，CCAAGTCTCTCAACAACTGG(3.8kb)使用Pfu turbo聚合酶(Stratagene)使第一结构的5′片段扩增，使用Herculase(Stratagene)使第二结构的3′片段扩增(94℃30秒，62℃为30秒，68℃为12分钟，40个循环)，第一结构的3′片段使用ACP Expand LongTemplate PCR系统(Roche)的系统(根据供应商的条件40个循环，包括在延长的时间里的增量)，以及第一结构的5′片段使用ACP Advantage 2 PCR试剂盒的试剂盒(94℃30秒，64℃30秒，68℃4分钟)如Bertocci，B等人，《免疫(immunity)》，9，257-65(1998)所描述的那样进行了30μg用NotI或MluI线性化的结构的转染使用下述位于该结构外的和新霉素和潮霉素抗性基因内的引物，在10个克隆库上用ACP进行了该基因靶克隆的筛选第一等位基因，iota-5′-试验，ATGACCCAAGCTCAAGACAGC和néoR在5′中CATAGCGTTGGCTACCCGTG，和3′-iota2-3′和反néoR，在3′中CACGGGTAGCCAACGCTATG；第一等位基因，iota-5′-试验，和hygroR，GCTGTGTAGAAGTACTCGCC(Expand Long Template PCR系统，Roche)对于第一等位基因，在518个转染子上的克隆中得到同源重组对于第二等位基因，535中2个克隆被正确定向人们将这种这种低频率归因于在靶载体结构中一般准确度的ACP酶的应用在鼠的ES细胞中观察到菌株对同源重组的这样一种特定多形性活性，其中序列差0.6％显然是由靶效率除以50得到的另外，使用只是用DNA聚合酶Pfu turbo(Stratagene)扩增的结构此后在BL2上进行的其它基因失活，给出靶频率在1-2％内，而DNA聚合酶Pfu turbo是一种其误差频率在使用的扩增条件下低于每对碱基10-4的酶BL2的缺失pol iota克隆的转染使用pol iota表达载体转染缺失pol iota克隆，通过扩增总长度人poliota的cDNA(McDonald，J.P.等人，《染色体组(Genomics)》，60，20-30(1999))与使用下述引物构成的5′-iota，GCGGATCCACGACGAGGAAGACG，和3′-iota，GCGGATCCTACGCTTTGTGCCAG(下画线的是BamHI位点)如前面所描述的那样，根据本技术领域的技术人员已知的经典技术进行了克隆转染和选择采用RT-ACP和Western blot分析BL2克隆使用对pol iota的多克隆抗体(第15个KLH-共轭肽，在C-端末端)，经典地进行Western blot还证实，根据本技术领域的技术人员已知的技术还可以改善poliota(具体参见Prakash技术)，研制出该酶的pol éta，它如pol iota具有环状II区(《环指》《Ring Finger》)，其中通过所述II区的随机突变形成，可以使这个《环指》区具有的至少一个氨基酸发生突变，其结果是显著增加如此突变酶的活性因此，本发明还有一个目的是如前面描述的诱导体细胞突变的试剂盒，该试剂盒包括通过其环状II区的随机突变形成如此改善的pol iota酶，以便使其中的至少一种氨基酸改变，其结果是改善其性能，然后采用如前面指出的工具修复该酶这种系统在前面公开的各种不同的实施方案中因此能够特别地鉴定为改善有意义蛋白质性能而必需的突变例如，BL2中转染的启动子-增强子表达盒里实施的胰岛素编码基因非限制性说明性的情况下，它可以产生许多分子，其中具有较好性能的分子优选地固定在其底物上然后进行编码这种优选蛋白的突变基因的基因排序，和采用允许这种性能改善的已知修饰氨基酸工具进行鉴定，这样可以采用本发明的方法非常快速地鉴定这些突变，这些突变能够获得性能更优良的胰岛素