一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物的制作方法[0002]干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。[0003]迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为三个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前，干扰素Υ和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。III型干扰素是最近发现的一类细胞因子家族，包括干扰素 λ 1、λ 2 和 λ 3，也称为 IL-28A、IL-28B 和 IL-29[0004]IL-28A、IL-28B和IL-29包含最近发现的新蛋白家族，所述蛋白质家族与I型干扰素有序列同源性，并与IL-10有基因序列的同源性。该新家族在共同所有的PCT申请W002/086087 和 Sh印pard 等，Nature Immunol.4:63-68，2003 (全文都纳入本文参考)中有详细的描述。从功能上说，IL-28和IL-29类似于I型干扰素，均能诱导细胞中的抗病毒状态，与I型干扰素不同的是，它们不显示出抗某些B细胞系的抗增殖活性。[0005]野生型IL_29(干扰素λ 1)基因编码200个氨基酸多肽，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1中，编码本文所述的IL-29多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID Ν0:2中。IL-29的螺旋预测如下:螺旋A有氨基酸残基30 (Ser)至44 (Leu)所定义；螺旋B由氨基酸残基57 (Asn)至65 (Val)所定义；螺旋C有氨基酸残基70 (Val)至85 (Ala)所定义；螺旋D由氨基酸残基92 (Lys)至Ill(Gln)所定义；螺旋E由氨基酸残基118 (Thr)至139 (Lys)所定义；而螺旋F由氨基酸残基144 (Gly)至170 (Leu)所定义。[0006]已知IL-29分子具有5个半胱氨酸残基(PCT申请W002/086087W002/02627)，基于多重比对进行的IL-29的进一步分析预测，氨基酸残基第49和145位，及第112和171位的半胱氨酸将形成分子内二硫键，第15位的半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键。[0007]无论是I型干扰素、II型干扰素还是III型干扰素，作为蛋白质药物，由于稳定性差、血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗体等，在临床治疗中很大的限制。基因工程技术使大规模合成人重组蛋白成为可能，工程蛋白通过改变野生蛋白序列中的某个或某几个氨基酸，以获得相对更为稳定、比活性更高的重组蛋白，并降低其免疫原性，这在一定程度上解决了异源蛋白引起的不稳定或免疫原性问题。[0008]尽管这样，还无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点，这些缺点造成的结果是:需频繁注射干扰素才能达到有效血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值和谷值。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。因此，人们试图采用各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效。[0009]蛋白药物的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍在临床治疗上的应用聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇分子(PEG)键合到蛋白质分子表面上，从而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如:化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解能力提高，免疫原性和毒性降低消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等等。
[0010]发明概述
[0011]IFN- λ I上有多处氨基酸可供进行突变，但这些氨基酸序列的改变应当考虑IFN-λ I的折叠及空间结构不受影响、并至少得到可以保持相当于野生型IFN-λ I活性的突变体。本发明的目的是提供一种在第62位氨基酸进行突变得到的一种新型的突变体IFN- λ 1，将第62位的Leu突变为Ser，该突变体相对于野生型IFN- λ 1，活性更强、稳定性更好。
[0012]本发明提供制备可溶性IFN- λ I突变体的方法，该方法通过先构建设计IFN- λ I突变体引物，构建获得突变体基因，将所得基因插入到表达载体，将所得的载体转入到宿主大肠杆菌中，得到相应的表达工程菌，再进行发酵和诱导表达、包涵体变性和复性，得到可溶性IFN-λ I突变体。
[0013]所需的蛋白质从可溶性细胞质部分，可溶性周质部分、培养基的可溶性部分以及包涵体中回收和纯化，可使用从培养基、细胞质、周质部分以及包涵体中回收和纯化蛋白质的任何方法，这些回收和纯化方法是已知的或本领域的技术人员容易确定的，包括，但不限于，离心，过滤，透析，层析(包括分子排阻层析)等方法。回收和纯化所需蛋白质的合适方法部分取决于蛋白质的特性和目的用途。
[0014]为实现此目的所采取的技术方案是利用蛋白工程技术，对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行定点突变，将62位的Leu突变为Ser,具体方法是:
[0015]I)利用体外定点突变技术获得编码目的蛋白的重组基因；
[0016]2)将此重组基因插入到表达载体中获得可编码重组蛋白的重组质粒，所述表达载体包括但不限于pET-23b ；
[0017]3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞获得可稳定表达目的蛋白的工程菌，所述大肠杆菌感受态细胞包括但不限于BL21(DE3)；
[0018]4)发酵工程菌并分离纯化以包含体形式表达的目的蛋白。表达产物已包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的40%以上，重组蛋白的纯化依次采用Blue染料亲和层析、铜离子亲和层析、CM弱阳离子交换层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的重组目的蛋白IFN-λ I突变体。
[0019]本发明的个目的是提供如上所述的IFN-λ I突变体的聚乙二醇衍生物及其制备方法，通过硫醇反应使聚乙二醇(PEG)试剂与IFN-λ I中的游离半胱氨酸残基反应获得特异性偶联物，所得产物中，PEG实现在游离半胱氨酸定点修饰，得到的PEG-1FN-λ I突变体。较未PEG化的IFN-λ I相比，所得的PEG-1FN-λ I具有稳定性提高、免疫原性减弱。
[0020]一般来说，PEG化蛋白质方法类似W09412219 (Cox和McDermott)和 W09422466 (Cox和Russell)中所述的方法，并略加改良，本文引用这两篇文献以供参考。将含游离半胱氨酸的多肽或蛋白质与过量的“巯基化PEG”相接触(一般PEG:蛋白质或多肽的摩尔比为1: 1、5:1、10:1、和50:1)搅拌进行反应，反应条件中优选的温度是4°C到37°C;优选的pH范围可以从6.5到9.5，但更优选为7.5到8.5。使用SDS-PAGE测定分子量的改变可检测蛋白质的PEG化，一般认为产生大量单PEG化产物而不产生二 PEG化产物的PEG的最低量是最佳的(一般认为80%转变成单PEG化产物是较好的)。
[0021]本发明半胱氨酸以形成“PEG化”蛋白质的“PEG部分”包括任何合适的多聚体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是环氧乙烷单元组成的合成多聚体，可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围大约为3，000-70, OOODa的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期。因此，可通过改变PEG部分的大小或结构来加工具有不同循环半衰期的蛋白变异体使之用于具体治疗应用或优选的剂量方案。
[0022]如本申请所用的“巯基化反应性PEG化剂”指任何与半胱氨酸残基的巯醇基团反应的PEG衍生物，这些用于半胱氨酸残基修饰的反应性PEG末端基团，其包括但不限于二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰胺。PEG末端基团应对游离巯基具有特异性，实现单PEG化。但在不损伤蛋白质的条件下发生反应。以其单-甲氧基化形式使用的PEG化剂，其中仅一个末端能被偶联。
[0023]术语“单PEG化”定义为通过单个PEG部分共价附着到蛋白质的特定位点而修饰的蛋白质。“单PEG化”方法可使用本领域的技术人员已知的任何方法，包括，但不限于，本发明实施例中所列举的方法。 [0024]在本发明中，优选的巯基化剂为mPEG- 二硫对吡啶(mPEG_0PSS)或mPEG-马来酰亚胺(mPEG-MAL)。值得注意的是，上述两个PEG化剂与IFN-λ的反应是位点特异性的，分别是在IFN-λ I的游离的15Cys而其他天然存在的Cys残基位点由于易形成分子内二硫键，不和硫醇反应性PEG化剂反应。
[0025]在本发明中，还提供了一种纯化本发明所得的PEG-1FN-λ I偶联物的方法，一般来说，经过诸如透析、超滤、分子排阻色谱、离子交换层析、亲和层析、反相色谱或疏水层析，从未PEG化蛋白质和未反应的PEG中纯化PEG化蛋白质缀合物，也可使用其它的纯化方法，如两相有机提取或盐沉淀法。
[0026]可以进行实验以证实PEG部分在正确的位点附着到蛋白质上，经过化学裂解或蛋白水解消化该蛋白质，以分子排阻、离子交换或反相层析纯化PEG多肽(它具有较大的分子量)，随后进行氨基酸测序可完成。在氨基酸测序过程中，PEG偶联的氨基酸以空白出现。
[0027]术语“层析方法”或“层析法”指任何用来分离混合物组分的技术，通过将混合物施加于溶剂(流动相)流过填充物(固定相)，进行分离层析法的分离原理是基于固定相和流动相的不同物理特性。
[0028]本发明的又一目的在于提供一种本发明所述IFN-λ I突变体及其聚乙二醇偶联物在制备具有治疗或预防病毒性疾病方面或肿瘤方面的应用，病毒指的是IFN所能抗的任何病毒，例如肝炎病毒、乳头状病毒、单纯性疱疫病毒、HIV、EB病毒、冠状病毒和/或流感病毒等，优选是肝炎病毒，如HBV或HCV ;细菌感染以及癌症(例如，骨髓瘤，淋巴癌、肝癌、乳腺癌、黑素瘤、白血病等)。如本发明的实施例中给出了本发明PEG-1FN-λ偶联物对肝癌细胞H印G2、心肌炎病毒EMCV
[0029]对于治疗用途，技术人员可容易地确定合适的剂量、给药频率和给药途径。做出这些决定的因素包括，但不限于，所用的蛋白质的特性，所需治疗的病症，潜在的病人应变性，病人的年龄、体重以及个体反应等。
[0030]本发明PEG-1FN- λ I偶联物或含多元醇-1FN- λ I偶联物的组合物，结合适合的药用载体或赋形剂，以用于治疗各种病症，在这些药物组合物中所用的特定载体可以采取各种形式，其取决于所希望的给药类型。适当的给药途径包括，但不限于，肠道(例如，口服)、局部、栓剂、吸入、以及非胃肠道，优选为非胃肠道给药，如皮下、肌肉、或静脉注射。
[0031]在制备口服液体剂型(例如，混悬剂、酊剂、胶体或溶液)的组合物时，可以采用典型的药物介质，如水、乙二醇、丙三醇、油、乙醇、增味剂、防腐剂、着色剂等。类似地，当制备口服固体剂型(如片剂、胶囊剂等)时，可采用诸如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
[0032]用于非胃肠道给药的药物组成可以制备成包括有效成分和适当载体的注射剂型。为了非胃肠道给药，载体通常包括无菌注射水，也可包括一些其它可用的助溶剂或防腐剂组分，此外也可制备注射型混悬剂，在这种情况下，将采用合适的液体载体、悬浮剂等。用于非胃肠道给药的载体在本【技术领域】是熟知的并且包括，水、盐溶液、林格氏液、和/或葡萄糖，该载体可以包含少量的赋形剂以便保持药剂的稳定性和等渗性，这些溶液可以按照通常的方法制备。
[0033]为了局部给药，本发明的PEG-1FN-λ I偶联物可用温和的含水基质进行配制，如软膏或乳膏，适用软膏基质的如凡士林、羊毛脂、以及油包水乳剂如Eucerin?，其可获自 Beiersdorf(Cincinnati, Ohio)；冷霜(USP) ；Purpose Cream?,可获自Johnson&Johnson(New Brunswick, New Jersey)等。
[0034]本发明的PEG-1FN-λ I偶联物一般以单位剂量的形式给药，本发明的化合物通常以每日、每周、以及每月剂量给药，从约0.01 μ g/kg体重至约50mg/kg体重，优选为从约0.1 μ g/kg体重至约25mg/kg体重，更优选为从约I μ g/kg体重至约5mg/kg体重。对于75kg的平均体重，剂量可以在每日IOyg和Img之间，更优选为20yg到200yg之间。对经修饰的PEG-1FN-λ，其给药周期可延长，例如，每周、或每两周给药方案。例如，每人每周剂量可以是10 μ g至约500 μ g，在某些具体的实施例中，每人每周剂量可以是约50 μ g至约250 μ g，在某些其它的实施例中，每人每周剂量可以是约100至约200 μ g。如本领域技术人员所明了的，根据本发明的药物组成的特定量取决于若干因素，包括但不限于所希望的生物活性、患者的状态、以及对药物的耐受性等。



[0035]图1:表示干扰素lambdalL62S突变体的工程菌体蛋白诱导表达SDS-PAGE图谱。I泳道为蛋白分子量Marker ；2泳道为诱导表达Oh ；3泳道为诱导表达Ih ；4泳道为诱导表达2h ;5泳道为诱导表达3h ；
[0036]图2:表示纯化后的干扰素lambdalL62S突变体的SDS-PAGE图谱。I泳道为蛋白分子量Marker ；2泳道为纯化后的干扰素lambdalL62S突变体蛋白；
[0037]图3:表示纯化后的PEG修饰的干扰素lambdalL62S突变体的SDS-PAGE图谱。I泳道为蛋白分子量Marker ；2泳道为纯化后的PEG修饰的干扰素lambdalL62S突变体蛋白。
[0038]实施例1:1FN_ λ 1L62S突变体的表达工程菌构建及序列确认
[0039]提取IFN- λ I的质粒作为模板，将62位亮氨酸(CTG)突变为丝氨酸(TCT)，首轮PCR包括两个反应体系:
[0040]反应体系I引物为:
[0041]Pl:5，-CCATATGGGTCCGGTGCCGACCTCGAAACCG-3’
[0042]Ρ2:5， -ACGGCCGCGCGGACGCGGGCC-3’
[0043]扩增62位点及其上游DNA序列。
[0044]反应体系2引物为:
[0045]Ρ3:5， -GGC CCG CGT CCG CGC GGC CGT-3，
[0046]Ρ4:5’ -C CT CGAGTTATTATTAGGTCGATTCCGG-3’
[0047]扩增62位点及其下游DNA序列。
[0048]PCR 条件为:94°C预变性 5min，94°C变性 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 lmin，循环30次，最后再72°C延伸5min。
[0049]第二轮PCR以第一轮PCR的产物为模板，以Pl、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53。。退火30s，72。。延伸lmin，循环30次，最后再72°C延伸5min。
[0050]将pET_23b载体与PCR扩增产物分别进行EcoRI/Ndel酶切反应，37 °C反应lh，回收线性化载体与目的片段(约600bp)。T4DNA连接酶对PCR产物和载体的酶切片段进行连接:10XT4DNALigase Buffer5 μ L, PCR双酶切回收产物15 μ L，质粒双酶切回收产物30 μ L, T4DNA Ligase2 μ L, ddH20 加至 50 μ L, 16°C过夜。
[0051]将连接反应液直接转化BL21(DE3)感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37 °C过夜培养。
[0052]挑取单菌落作为模板，用于上述设计的引物P1、P2进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，阳性克隆在600bp左右出现条带,与预期情况相符,初步说明重组质粒构建成功。为进一步确认其序列，以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
[0053]实施例2 =IFN- λ 1L62S突变体的表达和纯化
[0054]将工程菌以1:100的比例接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡培养至菌液0D600为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，继续培养4h后收集菌体(菌体的SDS-PAGE图谱见图1)。大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主时的表达的IFN-λ I约占菌体总蛋白的30-50 %，主要以包涵体形式存在。
[0055]将发酵菌体以TE溶液(m:V= 1:10)洗涤菌体3次，然后进行高压匀浆破碎，破碎条件为:35Mpa高压匀浆。匀浆后，镜检破菌率。当菌体破碎率约95%时(约破菌2~3次)，8000rpm离心15min，收集破碎菌体沉淀。取破碎菌体沉淀置于烧杯中，加入包涵体洗涤液(10mMTris-HCl+lmM EDTA+0.5% Triton-XlOO, pH6.5, m:V = 1:10)，于磁力搅拌机上搅拌30min，洗涤3~5次。包涵体用包涵体裂解液裂解(7M盐酸胍+50mM Tris-HCl+10mMDTT，pH6.5，m:V= 1:10)，室温搅拌，过夜。裂解的蛋白慢速加入复性液(IOOmM Tris-HCl,0.5M Arginine, 0.5% PEG3350 (m: V), 2mM GSH:0.5mM GSSG, ρΗ8.5)中，使蛋白终浓度为
0.2mg/ml,室温搅拌，过夜。[0056]复性液8000rpm离心5min,收集上清。利用超滤杯，超滤膜孔径为30kDa,用A液(20mMPB pH7.0)平衡超滤膜，然后将IL上清液浓缩10倍。浓缩液加入2倍缓冲液继续超滤，最终收集样品溶液50ml。将浓缩液上样到用A液充分平衡的Blue Sepharose FF层析柱，用两个柱体积的A液冲洗，然后用B液(20mM PB+2M NaCl pH7.0)进行洗脱，收集洗脱峰组分；Chelating Sepharose Fast Flow 填料装柱,0.1mol CuS04 上柱，BufferA (50mmol/L Tris (pH0.5)+50mmol/LNaCL+0.lmmol/L CuS04)平衡，直到检测器基线平稳。过Blue Sepharose FF层析得到的滤液用Buffer A稀释5倍后上样。分别用Buffer A、Buffer B (50mmol/L Tris (pH7.5)+0.5mol/L NaCL)平衡 5 个柱体积，至基线平稳。BufferC(50mmol/L Gly (pH3.0)+0.3mol/L NaCL)洗脱。BufferD(50mmoI/L EDTA(pH8.0)对柱子进行再生。将Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析的洗脱峰组分上样到用C液(25mmol/L醋酸钠缓冲液pH4.5)充分平衡好的CM Sepharose FF阳离子交换层析柱，用D液(25mmol/L醋酸钠缓冲液+0.3mol/L NaCl pH4.5)冲洗，收集洗脱峰组分。经以上纯化流程后，最后得到的IFN-λ I纯度在95%以上(SDS-PAGE图见图2)。
[0057]实施例3 =IFN- λ 1L62S突变体的PEG偶联
[0058]将纯化的蛋白IFN- λ I与分子量20kDa的mPEG_MAL按摩尔比1/10-1/5的比例混合，在25mM Tris-HCl缓冲液中，置4°C反应IOh后，用醋酸溶液调节反应体系pH至5.0以下以终止反应。SDS-PAGE检测反应的偶联程度。
[0059]实施例4IFN- λ 1L62S突变体衍生物的纯化
[0060]将修饰产物进行SP Sepharose HP纯化，平衡液为25mM乙酸钠缓冲液(ρΗ5.5)洗脱液25mM乙酸钠缓冲液，含IM NaCl,pH5.5，从0-100% Buffer B (参见实施例2中)进行线性洗脱。本步层析目的是除去多修饰蛋白及未修饰蛋白，最后得到的单PEG修饰的IFN-λ I突变体的纯度在95%以上(见图3)。
[0061]实施例5:采用报告基因法测定干扰素IFN-λ 1，突变体IFN-λ I及突变体IFN- λ I聚乙二醇衍生物的体外细胞生物学活性。
[0062]使ΗΕΚ293-ΙSRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。按1: 4传代，每周2~3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗I次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5 X IO5~4.5 X IO5个细胞的细胞悬液。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪读数的96孔板中，每孔加入100μ 1，然后将上述细胞悬液接种于同一 96孔板中，每孔100μ I。于37°C、5%二氧化碳条件下培养19~23小时。小心吸净96孔板中的上清液，按荧光素酶检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪进行测定，记录其ED50值，记录测定结果。
[0063]实施例6:IFN- λ 1、IFN- λ I 突变体和 IFN- λ ImPEG-MAL 修饰产物、IFN- λ I 突变体mPEG-MAL修饰产物的25 °C稳定性试验结果。
[0064]将IFN- λ 1、IFN- λ I 突变体和 IFN- λ ImPEG-MAL 修饰产物、IFN- λ I 突变体mPEG-MAL修饰产物透析至25mM pH5.0醋酸缓冲溶液含2mM ZnCl2和IOOmM NaCl中。用SDS-PAGE电泳和分子排阻HPLC法分别检测上述蛋白纯度，IFN- λ I突变体的稳定性明显增强，聚乙二醇干扰素Lambda突变体的纯度结果均在97%以上，活性变化不大。
[0065]表1IFN- λ 125 °C稳定性试验结果
[0066]