专利名称：一种耐氧化性淀粉酶突变体及其制备方法和应用的制作方法α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 1)是一种降解淀粉的重要的工业用酶，主要应用在食品、 纺织、医药、洗涤剂等领域。耐氧化性淀粉酶可用于纺织品退浆、洗涤剂添加剂以及以淀粉作粘结剂的粘度调节剂等。Horikoshi在1971年首先报道了产自嗜碱菌A-40-2的碱性淀粉酶。2007年Mxena等人筛选到一株可以产碱性淀粉酶的菌株。2010年Pancha φ (Pancha I， Jain D, ShrivastavA, Mishra S, Shethia B, Mishra S, VP Μ, Jha B. A thermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp. isolated from CSMCRI saltfarm. International Journal of Biological Macromolecules, 2010,47 (2) :288-291.)筛选出一株产耐温淀粉酶菌株。目前，国内的前处理酶制剂市场基本被丹麦诺维信公司和美国杰能科公司所垄断。诺维信公司介绍了一种淀粉酶，有较宽的PH及温度范围。具有耐化学氧化性的淀粉酶主要应用于洗涤剂添加剂和纺织退浆一浴法等工业中。但耐氧化性淀粉酶的工业化生产并没有报道。耐氧化性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选、诱变和酶分子改造获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。诱变包括自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。酶分子改造目的性强， 针对酶分子具体结构分析进行改造，达到耐氧化性的目的。
本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧化性淀粉酶突变体，在SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中催化区域进行蛋氨酸的突变。所述氨基酸的取代位点为淀粉酶催化区域周围暴露在酶表面的第307个氨基酸蛋氨酸位点。所述氨基酸的取代位点为催化区域内四个蛋氨酸位点，分别为第135位，第204 位，第219位，第237位。能表达生产权利要求1-3任一所述淀粉酶突变体的载体也属于本发明要保护的范围。能表达生产权利要求1-3任一所述淀粉酶突变体的细胞系或基因工程菌也属于本发明要保护的范围。本发明要保护的另一个技术问题是提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，其技术方案如下1)根据嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶序列(SEQ ID N0. 1)， 采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAAQ (图1)；2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；3)通过对淀粉酶空间结构进行分析，确定催化区域内4个蛋氨酸残基(M135， M204，M219，M237)及催化区域附近酶分子表面一个蛋氨酸残基(Met307)(图2)；4)针对已分析序列中不耐氧化的蛋氨酸位点(Met)设计引物，在引物中利用丝氨酸(Ser)的编码碱基序列替代蛋氨酸(Met)编码碱基，获得用于突变的引物(表1)；5)利用设计的突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；6)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得突变株。7)测定突变株表达淀粉酶的耐氧化性。本发明提供的淀粉酶突变体耐氧化性强，在500mM H2O2条件下40°C处理30min，酶活性残留由原来的18%提高至92% ；相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该耐氧化淀粉酶突变体应用于纺织退浆、洗涤剂添加等领域，可以在强氧化环境下高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。图1 :pAAQ的质粒图谱。图2 淀粉酶3D空间结构。图3 不同浓度H2A处理对淀粉酶稳定性的影响。_:M135S ；K2:M204S ;_:M219S ； ES3 M237S ；隱:M307S ;Γ · WT (突变前)。图4 :500mM H2O2环境下，不同处理时间对淀粉酶稳定性的影响。■ :M135S ；· M204S ;▲ :M219S ；T:M237S ; :M307S ；〇WT(突变前)。M135SCCATCGTTCGGGTGCGG
M204STATCTGTCGGGTGAAGACGTTGAC T
M219SAGGAGTCGAAGGCGTGGG
M237STTTCGTTCGGACGCGATTGC
M307SCGGAGATTCGCGTTGGTGCGG实施例2 淀粉酶在不同浓度H2A条件下处理后残留酶活力测定DNS法测定碱性淀粉酶酶活1)DNS试剂的配置称取2. 5g 3，5_ 二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0. 5g苯酚， 再溶解0. 075g亚硫酸钠、2. 5g氢氧化钠、50g酒石酸钾钠，将其转入500mL容量瓶中摇勻定容，储存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。2)麦芽糖标准曲线的制作配制0. 2g/L-l. Og/L不同浓度的麦芽糖溶液。取ImL 不同浓度的麦芽糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴lOmin。用冷水冷却，定容至10mL，A54tl测定吸光值。以麦芽糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。3)将2mL 1 %的可溶性淀粉加入到试管中，加入ImL的缓冲液，混勻，55°C预热 5min,加入0. 4mL稀释好的酶液，反应5min。取Iml反应液与同体积的DNS试剂混勻，沸水浴煮沸lOmin，用冷水冷却，定容至10ml，混勻后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。淀粉酶在不同H2A条件下处理后残留酶活力测定采用不同浓度H2A(IOOmM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM)在 40°C处理 30min。利用过氧化氢酶(1200U/mL)进行降解残存H202。采用pH 10. O甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，将缓冲液与可溶性淀粉混勻，采用幻的方法测定淀粉酶处理后残存酶活力(见图:3)。M135，M204， M219, M237, M307 突变成 Ser 后，不同浓度 H2R (IOOmM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM)在 40°C 处理30min。在最高浓度条件500mM H2O2环境下处理后，酶活力残留分别为处理前的88%， 92%，81 %，74%，60%。该淀粉酶耐氧化性获得极大提高，在强氧化环境下可以高效降解淀粉。酶活力单位定义在pH 10. 0，温度55°C，在Imin降解可溶性淀粉产生1 μ g还原物质(以麦芽糖计算)所需要的酶量，为1个酶活单位(U)。实施例3 淀粉酶在500mM H2O2条件下处理不同时间残留酶活力测定将耐氧化定点突变后的重组淀粉酶在500mM H2O2条件下40°C处理不同时间。采用过氧化氢酶(1200U/mL)进行降解残存H202。采用pH 10. O甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，将缓冲液与可溶性淀粉混勻，采用幻的方法测定淀粉酶处理后残存酶活力(见图4)。M135， M204, M219, M237, M307 突变成 Ser 后，500mM 浓度 H2A 在 40°C处理 30min。处理 5h 后，酶活力残留分别为处理前的63^,70^,54%,46%，56%。该淀粉酶耐氧化性获得极大提高， 在强氧化环境下可以高效降解淀粉。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。


本发明公开了一种耐氧化性淀粉酶突变体及其制备方法，属于遗传工程领域。本发明以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)JN21(CCTCC NOM 2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶在500mM H2O2环境下40℃处理30min，酶活性残留由对照(突变前)例的18％变为92％.利用此策略可以大大提高淀粉酶的耐氧化性，为其在纺织退浆、洗涤剂添加剂等工业生产领域提供了基础。此策略对淀粉酶及其它酶的耐氧化性质改造具有重要的指导意义。