专利名称：一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法糖尿病是一种重大多发性疾病，在世界范围内普遍存在。由于生活方式的巨大转变以及人们保健意识的不足，目前我国糖尿病患者已达9240万人，其中男性5020万人，女性4220万人，超过印度，成为世界糖尿病患者最多的国家，发病率(9. 7%)仅次于美国(11%)，其中II型糖尿病患者占93. 7%。目前常用的治疗II型糖尿病药物有增加胰岛素 敏感性的双胍类一甲福明；促胰岛素分泌的磺酰脲类一格列齐特(Gliclazide，商品名唐并康);a -糖苷酶抑制剂一阿卡波糖、米格列醇(Miglitol，商品名奥恬苹)、伏格列波糖(Voglibose，商品名倍欣)。其中由于a-糖苷酶抑制剂具有作用温和持久、毒副作用小甚至无毒的优点，得到越来越多国内外研究者的青睐。在中国，人们膳食结构中以谷类为主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制剂可以很好的缓解II型糖尿病患者的症状。因此，糖尿病患者对糖苷酶抑制剂类治疗药物有着巨大的需求。a-淀粉酶抑制剂作为这一类物质的代表，备受关注。a -淀粉酶(a-amylase)为1，4_ a-D-匍聚糖水解酶,能够水解淀粉、糖原以及相关多糖为寡糖片段。在消化、吸收过程中，食物中的碳水化合物先经唾液a-淀粉酶、胰a -淀粉酶作用分解为寡糖，然后在小肠中经a -葡萄糖苷酶分解为单糖，最后被小肠上皮细胞吸收进入血液循环。a -淀粉酶抑制剂作为一种糖苷水解酶抑制剂，能有效抑制唾液a -淀粉酶和胰a -淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少葡萄糖的产生和摄取，降低血糖和血脂含量水平。在临床上淀粉酶抑制剂可有效预防与治疗糖尿病和高脂血症。既可单独使用，也可以与其他降糖药或降血脂药联合使用。临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等症，如阿卡波糖已成为糖尿病治疗的首选药物。根据文献和专利报道，a -淀粉酶抑制剂的筛选是以淀粉酶活性抑制为基础，测定方法主要包括碘比色法(US3876766)和3，5-二硝基水杨酸(DNS)法(Bernfeld法)。其中碘显色法属半定量方法，灵敏度低。3，5-二硝基水杨酸法筛选a-淀粉酶抑制剂基于以下原理淀粉在胰a -淀粉酶作用下水解产生的还原基团，将3，5- 二硝基水杨酸与还原为硝基氨基水杨酸，从而产生颜色变化。通过在波长546nm处测定吸光度(Abs546)可以判断上述反应的进行。由于a-淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率。测定时，一般通过调整待测溶液及a-淀粉酶溶液的浓度或用量，使Abs546的值在0.4 0.7范围内为宜。但该反应中可溶性淀粉与a -淀粉酶对测定系统本底Abs546值的影响接近0. 2，对测定区间0. 4-0. 7而言本底影响较大，而且难以测定抑制剂浓度与酶活的关系。同时该反应显色需经沸水浴，无法实现在96孔板上进行，不能利用酶标仪等进行高通量筛选。目前，还没有高效、灵敏、快速的微生物源a-淀粉酶抑制剂筛选方法报道。
本发明目的在于提供一种快速、灵敏的a -淀粉酶抑制剂筛方法。为达到发明目的本发明采用以下技术方案a -淀粉酶抑制剂产生菌，即游动放线菌Actinoplanes sp. ZJB-08196,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO :M209022，保藏日期2009年2月16日，所述a -淀粉酶抑制剂为阿卡波糖。本发明所述的a -淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为 (I)待筛选菌株接种到平皿培养基上，2(T37°C (优选28°C)培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，2(T37°C (优选28°C)培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为蔗糖5-30g/L，蛋白胨l_5g/L，酪氨酸0. 5-2g/L，K2HPO4 3H200. 5-2g/L, KCl 0. 5-2g/L, MgSO4 7H20 0. 5_2g/L，FeSO4 7H20 0. 1-lg/L，琼脂 15_20g/L，溶剂为水，初始pH6. 0-7. 5 ；(2)挑选步骤(I)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25 37°C (优选280C )，摇床转速15(T200rpm，培养I 7天，收集得到发酵液，取发酵液于400(Tl2000rpm离心，取上清液备用。所述发酵培养基的组成为麦芽糖10-120g/L，葡萄糖10-50g/L，黄豆饼粉5-25g/L，碳酸钙2-10g/L，甘油2-10g/L，谷氨酸钠2-lOg/L，溶剂为水，初始pH6. 0-7. 5 ；(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的浓度为0. lU/ml,每分钟生成I微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麦芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)40 yl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90 ill (50mmol/l, pH6. 0)，40 待测样品。对照组为所述唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的浓度为0. lU/ml,5mmol 1^2-氯-4-硝基苯-a-半乳糖-麦芽糖苷40 yl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130 u I (50mmol/l,pH6.0),用酶标仪于405nm处检测Abs4tl5,每5秒钟读一次数，直至Abs4tl5不再增加，通常需要读数5min，将Abs4tl5相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。步骤(3)所得阳性菌株可按照步骤(2)进行进一步培养，并按照步骤(3)进行复筛、验证。这是本领域人员公知的复筛验证方法。本发明方法相对于高效液相(HPLC)分析方法，可以节约大量的分析时间，以及可以节省HPLC中大量作为流动相使用的色谱纯有机试剂，这些试剂一般比较昂贵并且对人体有害。因此本方法可以直接用于产a-淀粉酶抑制剂诱变育种时高产突变株的筛选，也可以用于筛选土壤中产a-淀粉酶抑制剂的微生物，还可应用于其它来源的淀粉酶抑制剂的筛选。本发明所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得水中加入琼脂条，边加热边搅拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K2HPO4 3H20, KCl, MgSO4 7H20，FeSO4 7H20,搅拌至完全溶解，配制得到终浓度为蔗糖5-30g/l，蛋白胨l_5g/l，酪氨酸0. 5-2g/l, K2HPO4 0. 5-2g/l, KCl 0. 5_2g/l，MgSO4 7H20 0. 5_2g/l，FeSO4 0. 1-lg/l，琼脂15-20g/l的培养基，通常按照每支5ml的量倒入体积为20ml的试管中，121°C灭菌20min，摆放斜面，冷却得到斜面培养基；同时，将灭过菌的培养基冷却至60°C左右，在无菌条件下倒入已灭菌的平皿中，冷却得到平皿培养基。所述平皿培养基或斜面培养基的组成优选为蔗糖25 30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸 lg/1, K2HPO4 3H20 0. 5 lg/1，KCl 0. 5g/l, MgSO4 7H20 0. 5g/l, FeSO4 7H20 0. lg/1,琼脂20g/l，溶剂为水，初始pH7. 0。所述发酵培养基的组成优选为麦芽糖40_80g/L，葡萄糖20_40g/L，黄豆饼粉10-15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH7. O。更进一步，本发明所述的a -淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法按以下步骤进行(I)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，28°C培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，28°C培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为蔗糖 25 30g/l，蛋白胨 2g/l，酪氨酸 lg/1，K2HPO4 3H20 0. 5 lg/1，KCl 0. 5g/l，MgSO4 7H200. 5g/l，FeSO4 7H20 0. lg/1，琼脂 20g/l，溶剂为水，初始 pH7. 0 ； (2)挑选步骤(I)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度28°C，摇床转速15(T200rpm，培养7天，得到发酵液，取发酵液于10000 12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为麦芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黄豆饼粉10_15g/L，碳酸钙5g/L，甘油5g/L，谷氨酸钠5g/L，溶剂为水，初始pH7. 0 ；(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30 u 1，所述唾液淀粉酶的浓度为0. lU/ml,每I分钟生成I微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为lU，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麦芽糖苷40 yl，pH6. 0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90 iU，40 待测样品；对照组为所述唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的浓度为0. lU/ml, 5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麦芽糖苷40 ii I, pH6. 0>50mmol/l磷酸氢二钠-朽1檬酸缓冲液130 U I,用酶标仪于405nm处检测Abs4tl5,每5秒读一次数，直至Abs4tl5不再增加，将Abs4tl5相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。本发明以上步骤中所用的唾液淀粉酶购自美国Lee BioSolutions公司。a-淀粉酶的浓度为0. lU/ml，其中，每I分钟生成I微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为IU。本发明所用的底物2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麦芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)，购自日本T0Y0B0公司，使用时用水配成5mmol/l标准液,避光,冷藏。由于本底物见光易分解，故保存在棕色瓶中，最多存放两周。若405nm处吸光值大于0. 05则需重新配制。所用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液按照常用方法配制，浓度50mM，pH 6. O。之所以选pH 6. 0是由于经过反复实验，发现在该条件下，酶表现出最大活力，并且发现该酶表现出良好的酸碱耐受(PH4. 0-8. 0)和温度耐受。本发明的原理为底物2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麦芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)在a -淀粉酶的作用下会生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，该产物在405nm处有特征吸收峰，其浓度可以通过酶标仪在405nm处测定得到。如果待筛选的样品中有a -淀粉酶抑制剂存在，可以相应的抑制a -淀粉酶的活力，水解反应被抑制，导致生成的CNP产量降低，通过与对照组对比，可以确定样品中是否存在a-淀粉酶抑制剂，以及其含量的相对高低。正是基于本原理，发明了此快速、高通量的筛选方法。实践表明，该模型在筛选a-淀粉酶抑制剂产生菌的试验中效果良好。通过这个模型，筛选得到了产a-淀粉酶抑制剂的菌株。本发明的有益效果为操作简单、快速，结果可靠，可同时筛选大量样品，包括微生物发酵液、以及其它来源的淀粉酶抑制剂，实现高通量筛选，减少劳动量。反应式如下式所示本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，所述方法为待筛选菌株依次接种到平皿培养基、斜面培养基、发酵培养基中培养，收集得到发酵液，取发酵液离心，取上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入0.1U/ml的唾液淀粉酶30 μl， 5 mmol/l 的Gal-G2-α-CNP 40 μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90 μl(50 mmol/l，pH 6.0)，40 μl待测样品。对照组为用等体积的缓冲溶液代替待测样品。用酶标仪于405 nm处检测Abs405，每5秒钟读一次数，直至Abs405不再增加。将Abs405相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。本发明提供的筛选方法简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，灵敏度高，提高了检测效率。