一种制备α-淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白的制作方法【技术领域】，尤其涉及一种制备a -淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白。[0002]a -淀粉酶[EC.3.2.1.1]属于糖苷水解酶类第13家族，作用于淀粉分子内部切开a-l，4_糖苷键，生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子为a构型，故称为a-淀粉酶。a -淀粉酶是一种重要的工业用酶制剂，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，已广泛应用食品、饲料、发酵以及纺织等工业中(张志国等，2005)。a-淀粉酶广泛存在于细菌、真菌、植物以及动物等各种生物体中，自1956年首次分离a-淀粉酶的报道以来，目前已经有120多种a-淀粉酶得到了分离和鉴定。a-淀粉酶的生产主要以微生物发酵为主，生产菌株主要有不同种属的细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等，以及真菌如黑曲霉、米曲霉和根霉等。迄今，已有大量的细菌发酵生产a-淀粉酶的研究报道，然而，真菌发酵产a-淀粉酶的研究较少(Ashok et al，2000)。[0003]随着a-淀粉酶研究的不断深入，已发现部分a-淀粉酶能同时水解多种葡聚糖及葡寡糖当中的a-l，4和a-l，6糖苷键，即同时具有麦芽糖淀粉酶、普鲁兰酶以及环糊精酶等多功能淀粉酶活性(Shimura et al, 2001; Yang et al, 2004; Yun et al，2004;Takeuchi et al,2006;Champreda et al，2007;Kato et al，2007;Hostinova et al，2010)，其中有少数a-淀粉酶还具有葡萄糖基转移酶功能(Kim et al, 1992; Shimura et al, 2001; Yun et al，2004)。目前已发现和报道的多功能a -淀粉酶多数属于耐热酶， 因此应用于淀粉加工时也较传统淀粉酶稳定，它们可以水解淀粉生成异麦芽低聚糖、麦芽低聚糖以及少量的葡萄糖。近来，多功能a-淀粉酶以其独特的催化功能多样性引起了人们的很大关注。应用多功能a-淀粉酶可以实现单酶生产，即以简单的一步催化水解淀粉生成异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖，而且产品中副产物较少，产品质量较高，有些产品甚至不需要纯化而直接应用。因此，多功能a-淀粉酶在现代食品工业以及医药工业等领域中占有重要的地位，具有广阔的应用前景。[0004]目前，世界各国都在致力于开发多功能淀粉酶，以期待降低生产麦芽低聚糖的成本。我国淀粉资源非常丰富，而且具有分布广、产量大、价格低等 特点。以淀粉为原料生产高质量的麦芽低聚糖有望成为我国主要的功能性、健康性糖原，但是其生产的前提是要开发出理想的多功能淀粉酶。
[0005]本发明的一个目的是提供樟域枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168。[0006]本发明提供的樟域枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168，其保藏号为CGMCC N0.6022。
[0007]上述的棒域枝霉(Malbrancheacinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 在制备 ct -淀粉酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种制备a-淀粉酶的方法。
[0009]本发明提供的方法，包括如下步骤:发酵上述的樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022，收集发酵产物，即得到a-淀粉酶。
[0010]上述方法中，所述发酵温度为30-45° C，所述发酵时间为3-5天，所述发酵为 180-220rpm震荡培养。
[0011]上述发酵培养基的配方如下:糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物 24.0g, KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g, FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g, MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 IL0
[0012]本发明的第三个目的是提供一种蛋白。
[0013]本发明提供的蛋白，来源于樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168,是如下(a) 或(b):
[0014](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0015](b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
[0016]上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 。
[0017]编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。
[0018]上述基因是如下(I)- (4)中任一所示的DNA分子:
[0019](I)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0020](2)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0021 ] (3)在严格条件下与(I)或(2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的 DNA分子；
[0022](4)与(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0023]上述严格条件为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 I X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。
[0024]含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
[0025]上述蛋白在作为a-淀粉酶中的应用也是本发明保护的范围。
[0026]菌株樟绒枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为N0.6022,分类命名为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)。
[0027]本发明的实验证明，本发明提供的菌株具有高产a-淀粉酶的能力，通过硫酸铵沉淀及弱阴离子层析得到55.4%回收率的高纯度a-淀粉酶，水解特性分析表明此a-淀粉酶具有广泛的底物特异性，可以用于水解淀粉高效生产低聚麦芽糖，具有较好的工业应用前景，本发明还提供了该a-淀粉酶的编码基因及其对应的氨基酸序列，为基因重组表达a-淀粉酶奠定了基础。


Y-环糊精及麦芽寡糖的水解进程图
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]下述实施例所述引物的合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司(北京公司)完成。
[0039]下述实施例的主要原料及试剂:葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、潘糖、普鲁兰糖、环糊精、直链淀粉和可溶性淀粉(底物)均购自Sigma公司；酵母提取物和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司；琼脂和可溶性淀粉(培养基)购自北京康明威培养基技术有限责任公司； KH2PO4, MgSO4.7H20、CaCl2, NaOH、苯酚、MnSO4, CuSO4.5H20以及酒石酸钾钠等购自北京化工厂；3，5- 二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。
[0040]实施例1、菌株的分离和鉴定
[0041]一、菌株的分离
[0042]本发明提供的樟绒枝霉S168是从陕西西安树林土壤中筛选得到的。
[0043]初筛培养基:淀粉高渗培养基(YpSs):可溶性淀粉15g，酵母提取物4g，K2HPO4Ig, MgSO4 ? 7H20 0.5g，琼脂 20g，定容至 1L，调节 pH 至 7.0。I X IO5Pa 下湿热灭菌 20min。
[0044]发酵培养基:糯米粉(中山市小榄永宁粮油综合加工厂，Q/WG 0002 S-2010) 15.0g，蛋白胨 8.0g，酵母提取物 8.0g，KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g，FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g，MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 1L。I X IO5Pa 下湿热灭菌 20min。
[0045]取新鲜土样稀释后涂布于分离培养基平板上，在50° C恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基中，凡在菌落周围能使培养基形成透明圈的菌株，接种到发酵培养基中培养。培养条件为:50° C，200rpm，培养36h。发酵结束后取ImL发酵液于1.5mL离心管中，离心(10000Xg, IOmin),取上清测定a_淀粉酶酶活力。 选取酶活力较高的菌株S168作为出发菌株进行后续研究。
[0046]酶活力测定方法:a -淀粉酶酶活力测定为100 U L适当稀释的酶液(上清)加入到
100u L浓度为lOgL—1的可溶性淀粉溶液(用50mM pH 6.5MES缓冲液配置)中，65° C水浴反应10min后米用 DNS法(Miller GL(1959)Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.Anal Chem 31:426-428)测定产生的还原糖量，以葡萄糖为标准。酶活力单位(U)定义为在以上条件下，每分钟反应生成I y mol葡萄糖所需要的酶量。
[0047]二、菌株的鉴定
[0048]1、形态学观察
[0049]将上述菌株S168在淀粉高渗平板培养基上培育，观察菌株生长情况如下:生长良好，最适生长温度为45° C。菌落铺展生长，初黄色，渐变粉红色与桔黄色交替环生，后中央深赭棕色，边缘亮硫磺色，粉状(图W。采用显微镜观察，发现菌丝初无色后变黄，粗壮菌丝近隔膜基部有明显隆起，从顶端到基部依次形成紧密、规则的隔膜，无分化的分生孢子梗；产孢菌丝体生式产孢，厚壁分生(节)孢子和薄壁细胞(腰)相互间插链生；薄壁细胞易萎焉、衰退，分生孢子链断裂，形成黄色粉状孢子堆，分生孢子淡黄至黄色，脱落后两端有明显的菌丝外壁残留物，短圆柱状，常轻微弯曲(图1B)。
[0050]2、18SrDNA 的鉴定
[0051]使用18S rDNA 通用引物 NSl:GTAGTCATATGCTTGTCTC, NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA,以樟绒枝霉S168的总DNA为模板，PCR扩增18SrDNA序列。目标片段经凝胶回收后测序。测序获得可靠序列1745bp (序列I)。将测序获得的基因序列再 NCBI数据库中进行比对，依据相似度高低并结合菌株形态对其进行初步鉴定综合以上特征，结合该真菌18S rDNA测序结果，证实本发明得到的菌株S168为樟绒枝霉。
[0052]菌株樟绒枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为N0.6022,分类命名为樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)。
[0053]实施例2、棒续枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 在制备 a-淀粉酶中的应用
[0054]一、a-淀粉酶的获得
[0055]1、发酵
[0056]将由实施例1 得到的樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 进行液体发酵培养，并对发酵培养基做了单因素优化，具体如下:
[0057]最优的发酵培养基:糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物24.0g，KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g, FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g, MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 IL0 I X IO5Pa 下湿热灭菌 20min, pH 6.5。
[0058]在上述最优的发酵培养基中在35° C、200rpm震荡培养5d，收集发酵产物，将发酵产物1000OXg冷冻离心lOmin，收集上清液进行a -淀粉酶的酶活力检测(检测方法同实施例I的一中的酶活力测定方法)，结果为上清液的a-淀粉酶的酶活力最高达到308.3U ml/ 1 (DNS 法)(图 2)。
[0059]将发酵3d的发酵产物10000 X g冷冻离心IOmin,收集上清液做进一步纯化用。
[0060]2、a-淀粉酶的纯化与鉴定
[0061]I) a-淀粉酶的纯化
[0062](I)硫酸铵沉淀
[0063]向上述I得到的上清液中缓慢加入60%饱和度的硫酸粉末，冰水浴中搅拌lh，然后 10000 X g冷冻离心lOmin，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液达到80%硫酸铵饱和度，冰水浴中搅拌lh，1000OXg冷冻离心lOmin，收集沉淀，将沉淀用少量20mMpH 8.0 Tris-HCl 缓冲液溶解，得到硫酸铵沉淀产物。
[0064](2)DEAE52 柱纯化
[0065]将上述得到的硫酸铵沉淀产物用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液透析，过DEAE52 弱阴离子交换柱(Whatman)，流速为l.0mL mirT1 (前后均一致)，用200mM NaCl溶液梯度洗脱杂蛋白，用300mM NaCl溶液梯度洗脱，收集5个柱体积的洗脱液为a -淀粉酶组分， 得到纯化产物。检测纯化产物的酶活，酶活力测定方法同实施例1，采用Lowry法(Lowery OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ(1951)Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265-275)测定蛋白质含量。
[0066]结果如表1所示:(表中的比酶活=总酶活/总蛋白)
[0067]表1 a -淀粉酶的纯化过程
[0068]