专利名称：一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法sativum L.)为百合科葱属植物,起源于中亚地区,4000多年前就已经开始种植，具有药食两用的功效，长期以来在我国广泛栽培种植。但近年来，随着大蒜种植面积和产业化发展迅速，病虫害也日益严重，成为限制其进一步发展的主要因素，其中大蒜叶枯病对大蒜蒜薹、蒜头产量为害严重。大蒜叶枯病(Garlic leaf blight)属于真菌病害，其病原菌的无性阶段为半知菌类的匍柄霉，有性阶段为子囊菌门的格孢腔菌。两个阶段的病菌均可侵染大蒜，但以无性阶 段的病菌侵染为主。该病主要危害大蒜的叶和花梗，严重时造成蒜叶枯死、大蒜不抽薹等症状，此病的发生造成严重损失，影响大蒜的稳产高产；目前，虽然有一些化学药物可用来防治叶枯病，但效果不明显，而且大量用药还会引起产品农药残留增加，降低食用安全性，因此，要从根本上解决叶枯病，必须选育抗病品种，然而到目前为止，国内外对大蒜抗病突变体筛选方法的报道很少，仅张林青(2008)报道了大蒜抗白腐病细胞无性系变异，但是仅获得少于的抗性鳞茎，且未利用分子手段进行鉴定。因此目前急需开发出能成功地筛选大蒜抗病突变体的方法。
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，本发明提供一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，本方法操作简便，易于掌握。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)以大蒜茎盘为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为0%、10%、20%、30%、40%的筛选培养基上，确定筛选压；(2)以大蒜茎盘为外植体，在MS+B5有机+2，4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +5%毒素的培养基上培养30天，诱导出抗性胚性愈伤组织；(3)将诱导出的抗性胚性愈伤组织逐次接种到粗毒素体积分数分别为5 %，10%, 15%，20%, 25%的愈伤组织增殖培养基MS+B5有机+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. Omg/L上，以利用多步法筛选抗性胚性愈伤；(4)将步骤3中所得到的抗性胚性愈伤接种至不含毒素的增殖培养基中，使筛选到的抗性胚性愈伤恢复生长；(5)将步骤4中抗性胚性愈伤组织接种到含25%粗毒素的芽分化培养基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，获得抗性芽；(6)将得到的抗性芽接种至无毒素的芽分化培养基上，使抗性芽恢复生长；(7)将得到的抗性芽接种至无激素的MS基本培养基上诱导生根，使其继续长成具有根、茎、叶的完整再生植株；(8)用SSR和SRAP标记对抗性植株进行分子标记鉴定。所述步骤(I)中的大蒜选择健康饱满的蒜瓣，去皮，在自来水下冲洗lh，后在无菌条件下用75%酒精浸lmin，再用O. 5%次氯酸钠消毒20 25min，无菌水冲洗4 5次待用，在超净工作台上切去蒜瓣上部的贮藏叶，剩下约5mm厚带发芽叶基的茎盘，十字切成4块为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为O %、10 %、20 %、30 %、40 %的筛选培养基上，接种时使外植体伤口与培养基表面充分接触，培养条件为温度20 25°C，光照2000Lx, 14h光照/IOh黑暗条件下培养30天后，根据各处理愈伤组织诱导率及发育状况，确定适宜的抗性筛选压为25%。所述步骤(2)的具体方法为以大蒜带发芽叶基的茎盘为外植体，接种在含粗毒素为5%的MS+B5有机+2，4-D 2. O mg/L +KT O. 5 mg/L的培养基上，培养30天，得到抗性胚性愈伤组织。所述步骤(3)的具体方法为配置附加不同体积分数的粗毒素增殖培养基MS+B5有机+2，4-D 0.5 mg/L+KTl. O mg/L，粗毒素按每5%为一个梯度，直至粗度素体积分数为25%,分别将抗性愈伤组织接种到上述粗毒素的增殖培养基上，使胚性愈伤组织增殖，每30天为一个培养周期。所述步骤(5)的具体方法为将所得到的抗性愈伤组织接种至粗毒素分数为25% 的MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培养上，培养30天，获得抗性芽。所述步骤(8)的具体方法为对所得到部分再生植株利用SSR和SRAP标记手段进行分子鉴定。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下(1)操作简便，易于掌握；(2)适应范围广本发明多用于多个大蒜品种，如在大蒜品种G025、G064等中均获得抗病突变体；(3)结果可信利用了分子手段进行鉴定。 图I为大葱叶枯病病原菌孢子； 图2为大蒜茎盘在无毒素的愈伤组织诱导培养基上的初期状态；
图3为大蒜在粗毒素分数为5%的毒素培养基上的生长状态；
图4为大蒜茎盘在粗毒素分数为30%的培养基上的生长状态；
图5为在无毒素的培养基上诱导的胚性愈伤组织；
图6为抗性胚性愈伤组织在无毒素的增殖培养基上生长状态；
图7为非抗性胚性愈伤分化芽的初期状态；
图8为在粗毒素分数为25%的芽分化培养基上得到的抗性芽；
图9为所得到抗性丛生芽；
图10为分离得到单棵抗性植株；
图11为在无植株的MS培养基上根的形成；
图12为试管小鳞茎的形成初期；
图13为得到的抗性鳞茎；
图14为栽植鳞茎后得到的抗性植株；
图15为G025的SSR电泳图。

(I)筛选适宜的筛选压。选择G064、G025、正月早三个大蒜品种，选择健康饱满的蒜瓣，去皮，在自来水下冲洗I h，后在无菌条件下用75%酒精浸I min，再用O. 5%次氯酸钠消毒20 25 min，无菌水冲洗4 5次待用，在超净工作台上切去上部的贮藏叶，剩下约5 mm厚带发芽叶基的茎盘，十字切成4块为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为O %、10 %、20%,30%、40%的筛选培养基上，接种时外植体伤口与培养基表面充分接触，培养条件为温度20 25°C，光照20001x，14h光照/IOh黑暗，培养30天后，统计各处理愈伤组织诱导·率及发育状况，筛选出适宜的抗病筛选压为25% ；
为了提高筛选效果，所述步骤(I)中，首先以大蒜茎盘为外植体，在愈伤组织形成的培养基中加入不同体积分数的粗毒素，统计组织的成活率，因粗毒素浓度为30%时，外置体几乎不能适应，以至死亡，所得选择最适宜的筛选压为25%，并以5%为一个梯度，进行抗性胚性愈伤的多步法筛选。(2)以大蒜外植体为外植体，接种在粗毒素分数为5%的MS+B5有机+2，4-D 2.0mg/L +KT 0.5 mg/L的培养基上，培养30天，诱导出抗性胚性愈伤组织。(3)将所得到的抗性胚性愈伤组织逐次接种至粗毒素体积分数逐级增加(5%，10%，15%，20%)的愈伤组织增殖培养基上直至粗毒素分数为25%，每个培养周期为30天，使抗性胚性愈伤组织增殖，经过多次的继代培养除去非抗性的胎性愈伤组织，增殖培养基为MS+B5 有机+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. O mg/L，每 5%为一个梯度。配置附加不同体积分数的粗毒素增殖培养基MS+B5有机+2，4-D O. 5 mg/L+KT I. Omg/L，粗毒素按每5%为一个梯度，直至粗度素分数为25%，分别将抗性愈伤组织接种到上述粗毒素的增殖培养基上，使胚性愈伤组织增殖，每30天为一个培养周期。(4)将所得到的抗性胚性愈伤组织接种至无毒素的愈伤组织增殖培养上，使筛选到的抗性胚性愈伤恢复生长。(5)将所得到的抗性胚性愈伤组织接种至粗毒素体积分数为25%的MS+KT 0.5mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培养基上，培养30天，促使芽分化，得到抗性芽。(6)将所得的抗性芽接种至无毒素的芽分化培养基上，使抗性芽恢复生长。(7)将得到的抗性芽接种至无激素的MS基本培养基上诱导生根，使其继续生长具有根、茎、叶完整的再生抗性植株。(8)对所得到部分抗性植株利用SSP和SRAP标记进行鉴定，进一步在分子水平上确定体细胞突变的植株。其中MS基本培养基的组成如表1，B5培养基的有机成分见表2，


本发明涉及一种大蒜抗叶枯病体细胞突变体筛选方法。该方法包括(1)以大蒜茎盘为外植体，以叶枯病粗毒素不同的体积分数为培养基，确定筛选压；(2)以大蒜茎盘为外植体，接种附加粗毒素体积分数为5％的培养基上诱导出抗性愈伤组织；(3)配置附加不同体积分数的粗毒素增殖培养基，将抗性愈伤组织接种上；(4)将得到的愈伤组织接种到不含毒素的愈伤组织增殖培养基中，淘汰掉非抗性的愈伤组织或细胞；(5)将抗性愈伤组织或细胞接种至粗毒素体积分数为25％的芽分化培养基中诱导芽的分化；(6)将诱导得到的抗性芽接种到不含毒素的芽分化培养基中；(7)将得到的抗性芽接种至MS基本培养基上，再生植株；(8)对再生植株进行分子水平的鉴定。