肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用的制作方法【技术领域】，特别涉及肺炎链球菌溶血素突变体及其作为粘膜免疫佐剂的应用。[0002]目前，肺炎是引起儿童死亡的最主要原因，超过了HIV/AIDS，疟疾和麻疹。根据现有的病因学调查结果显示，肺炎链球菌是导致儿童致死性肺炎感染的主要细菌。市场上现有的针对肺炎链球菌的疫苗主要是针对肺炎链球菌的23价多糖疫苗和多糖结合疫苗(7价、11价、13价等)，但是它们都存在:覆盖血清型有限，可能发生荚膜血清型转换等缺点，而且由于结合疫苗价格比较昂贵，难以在发展中国家纳入国家计划免疫。因此，研制新的保护效果好、免疫原性强、持续时间长、血清型覆盖广、价格廉价的肺炎链球菌蛋白疫苗已成为预防其肺炎感染的一项重要课题。[0003]蛋白疫苗免疫原性强、在各个血清型的菌株中高度保守，可以诱导T细胞免疫反应，产生免疫记忆，且制备简便，易于规模化生产，是一类有发展潜力的疫苗。Intercell公司开发的肺炎链球菌蛋白疫苗IC47开始一期临床研究已完成；赛诺菲-巴斯德公司的PspA蛋白疫苗也已完成一期临床研究，说明蛋白疫苗是一个很有前景的研究方向。[0004]肺炎链球菌溶血素Pneumolysin (Ply)是肺炎链球菌保守表达的一个53KDa的表面溶血活性蛋白，大量的文献和实验证明，减毒的Ply蛋白是一种比较有效的疫苗候选蛋白，经粘膜免疫实验动物可以对多种血清型的肺炎链球菌在宿主鼻咽部及肺部的定植提供显著的保护作用。同时也有报道提示Ply具有潜在的粘膜佐剂的功能，Ply与目的蛋白融合表达后通过粘膜途径免疫可以诱导宿主产生较高水平的特异性IgG和IgA，但是未表现出对感染肺炎链球菌小鼠的保护效果。[0005]肺炎链球菌的定植部位为人类上呼吸道，鼻粘膜免疫接种疫苗既可有效抑制其鼻腔定植，又能对其侵袭性感染产生保护作用，因此鼻粘膜免疫接种疫苗是WHO推荐的疫苗免疫途径。CT(霍乱毒素)佐剂作为经典的黏膜佐剂，效果显著，但由于其毒性较大，无法应用于人体。无毒且有效的粘膜佐剂的研发与应用显得迫在眉睫。
[0006]本发明的目的是提供一种有效的粘膜免疫佐剂及预防肺炎链球菌感染的融合蛋白质疫苗的制备方法。[0007]本发明采用基因工程的手段分别克隆表达APly、DnaJ, DnaJ-APly及Δ Ply-DnaJ抗原，利用基因克隆技术分别将DnaJ及Λ Ply基因片段连接到表达载体，转化入工程菌表达目的蛋白，实现DnaJ及Λ Ply蛋白的融合表达，具有高效、安全、便于分离纯化等优点。
[0008]本发明一方面涉及一种肺炎链球菌溶血素突变体，其特征在于所述的突变体的基因包括核苷酸序列为SEQ ID N0.2的Λ Ply。[0009]本发明另一方面涉及上述的肺炎链球菌溶血素突变体作为粘膜免疫佐剂的应用。
[0010]本发明另一方面还涉及Λ Ply和DnaJ的融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID N0.5 或 SEQ ID N0.6。
[0011 ] 在本发明的另一方面还涉及Λ Ply和DnaJ的融合蛋白的基因，其特征在于所述的基因核苷酸序列为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4.[0012]本发明另一方面还涉及含有SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4序列的质粒载体。
[0013]本发明另一方面还涉及上述质粒载体在制备融合蛋白中的应用，所述的融合蛋白的分子量为93KDa。
[0014]本发明另一方面还涉及一种肺炎链球菌感染预防用的融合蛋白质疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0015](I)用引物修饰法分别从S.pn基因组中扩增DnaJ及Ply基因片段；
[0016](2)用引物修饰法获得Ply第146位氨基酸缺失的突变体基因；
[0017](3)分别构建含有 Λ Ply、DnaJ, DnaJ-APly 及 Λ Ply-DnaJ 基因的 pET28a(+)重组质粒；
[0018](4)将重组质粒分别转化到BL21 (DE3)工程菌中，IPTG诱导可高效表达Λ Ply、DnaJ、DnaJ-Δ Ply及APly-DnaJ蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌BL21-pET28a(+)-APl y、BL2l-pET28a (+)-DnaJ, BL21-pET28a (+) -DnaJ- Δ Ply 和BL21-pET28a(+)-ΔPly-DnaJ ；
[0019](5)分离纯化 Δ Ply、DnaJ、DnaJ-APly 及 APly-DnaJ 目的蛋白；
[0020](6)将APly及DnaJ两种蛋白抗原按融合蛋白中的分子比例制成特定的蛋白混合物。
[0021]本发明所述的融合蛋白质疫苗通过克隆表达肺炎链球菌毒力基因制备。将DnaJ及APly蛋白融合表达及按相应比例进行混合，本发明一较佳实施例中，在不同抗原组合实验中，证实DnaJ- Δ Ply该融合蛋白疫苗能够显著增强抵抗肺炎链球菌感染的能力,在减少肺炎链球菌定植保护实验中，与其它单一成分蛋白疫苗的效果相比具有统计学意义。在另一较佳的实例中，采用不同的抗原组合实验，结果表明DnaJ-Λ Ply免疫可以显著提高抵抗肺炎链球菌感染的免疫保护效果，进一步证实了上述的肺炎链球菌多价联合蛋白质疫苗具有良好的保护效果。
[0022]综上所述，本发明以肺炎链球菌溶血素突变体(APly)为粘膜免疫佐剂，制备肺炎链球菌融合蛋白质疫苗，用于肺炎链球菌感染免疫预防，安全有效。



[0023]图1:重组质粒pET28a(+)-DnaJ-ΛPly的PCR鉴定，其中左为DnaJ，右为 APly ；Μ为 DNA Marker。
[0024]图2:纯化的两种融合蛋白(分子量都是93KDa)，泳道I为纯化的DnaJ- Δ Ply,泳道2为纯化的DnaJ- Δ Ply0泳道3为纯化的DnaJ (38KDa)，泳道4为纯化的Λ Ply (50KDa)。
[0025]图3:DnaJ与Δ Ply抗血清分别对DnaJ- Δ Ply和DnaJ- Δ Ply的识别反应。
[0026]图4:DnaJ-APly蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的识别反应。
[0027]图5: Λ Ply作为粘膜免疫佐剂对抗体的促进作用。[0028]图6: APly作为粘膜免疫佐剂对细胞因子的促进作用
[0029]图7:小鼠抗原主动免疫定植保护实验图。上图A，B为19F，下图C，D为6B。
[0030]图8:小鼠抗原主动免疫保护实验半数生存时间的统计学分析。上图A为D39，下图B为3型(436)。

[0031]实施例1
[0032]重组表达质粒pET28a (+) - Δ Ply、pET28a (+) -DnaJ、pET28a (+) -DnaJ- Δ Ply 和pET28a (+) - Δ Ply-DnaJ表达载体的构建
[0033](一 )材料:
[0034]质粒pET28a(+)购自 Novagen 公司，PCR 用 Prime Star 高保真酶、dNTPs、Buffer、MgCl2购自大连宝生物技术公司，PTC - 200PCR仪为Perkin Elmer产品，RG 一 3000为Corbett Research 产品。
[0035](二)引物的设计合成:
[0036]以肺炎链球菌TIGR4基因组DNA为模板，参照其全序列(GeneBank编号AE005672)，使用premier5.0设计引物，由上海生工公司合成。
[0037]pET28a (+) - Δ Ply 重组质粒的构建参照(Lea-Ann S.Kirkham, Infect.Tmmun.2006, 74 (I): 586.) > pET28a (+) -DnaJ 重组质粒的构建参照(Mohd.NadeemKhan, Vaccine24(2006)6225 - 6231.)
[0038]DnaJ:上游引物:5 ’ -GGAATTCCATATGAACAATACTGAATTT-3，，含 Nde I 位点；
[0039]下游引物:5’ -CGAGCTCTTATTCTCCATCAAAGG-3，，含 Sac I 位点；
[0040]Ply:上游引物:5’ -CG GCGGCCGCATGGCAAATAAAGCAGTAAAT G-3’，含 NotI 位点；
[0041]下游引物:5’-CCCTCGAGTTACTAGTCATTTTCTACCTTATCCTCT-3’，含 XhoI 位点；
[0042]构建Ply 146位氨基酸突变引物:
[0043]上游引物:
[0044]5， -GGTCAGGTCAATAATGTCCCAAGAATGCAGTATGAAAAAATAAC-3，；
[0045]下游引物:
[0046]5’ -GTTATTTTTTCATACTGCATTCTTGGGACATTATTGACCTGACC-3’。
[0047]DnaJ-APly与Λ Ply-DnaJ引物:前者是DnaJ的C端与Λ Ply的N端相连，后者是Δ Ply的C端与DnaJ的N端相连。
[0048]DnaJ-APly: F/R-DnaJ-N, F/R-APly-C
[0049]Δ PI y-DnaJ: F/R-Dna J_C, F/R- APly-N
[0050]