新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法

D·沃伊斯特－博茨, M·布劳恩, A·艾格纳, B·孙, C·坎特佐, S·布莱施, D·巴孔伊, W·胡梅尔

2014年1月8日

2011年12月16日

2010年12月16日

细胞制药有限公司

C12N9/04GK103502442SQ201180067680

突变体 脱氢酶 类固醇 羟基

1.7 β -羟基类固醇脱氢酶(7 β -HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中突变体较之非突变的酶，具有特别是对7-酮类固醇底物的降低的底物抑制，和/或改变的辅因子利用2.如权利要求1中要求保护的突变体，其中所述突变体在根据SEQID NO2的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变3.7 β -羟基类固醇脱氢酶(7 β -HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中所述突变体在根据SEQ ID NO2的第36至42位的序列基序VMVGRRE中或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应的序列基序中有至少一个突变4.如权利要求2或3中要求保护的突变体，所述突变体选自 a)单突变体GSgX1和R40X2 b)双突变体(G39X!，R40X2)，(R40X2,R41X3)和(G39X!，R41X3)或 c)三突变体(G39X1；R40X2, R41X3)， d)或从SEQID NO2衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应的单、双或三突变体； 其中在每种情况下X1, X2和X3彼此独立地代表突变的氨基酸残基5.重组微生物，其携带编码如前述权利要求之一中要求保护的突变体的至少一种核酸序列或至少一种对应的表达盒或至少一种对应的载体并另外任选地携带另一种酶的编码序列，所述另一种酶选自羟基类固醇脱氢酶，例如3 α -羟基类固醇脱氢酶(3 a -HSDH)，和适于辅因子再生的脱氢酶6.用于7β -羟基类固醇的酶促或微生物合成的方法，其中在存在根据权利要求1至4之一中定义的7 β -HSDH突变体时或在存在表达此突变体的重组微生物时，使对应的7-酮类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离形成的至少一种还原产物7.如权利要求6中要求保护的方法，其中所述还原在存在和特别是消耗NADPH和/或NADH时进行8.如权利要求7中要求保护的方法，其中通过与NADPH再生酶偶联再生用过的NADPH，其中所述NADPH再生酶特别选自NADPH脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、和NADPH再生甲酸脱氢酶(FDH)和NADPH再生葡萄糖脱氢酶(⑶H)，其中所述NADPH再生酶任选地通过重组微生物表达；和/或其中通过与NADH再生酶偶联再生用过的NADH，其中所述NADH再生酶特别选自NADH脱氢酶、NADH再生甲酸脱氢酶(FDH)、NADH再生醇脱氢酶(ADH)、NADH再生葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6TOH)、NADH再生亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)和NADH再生葡萄糖脱氢酶(⑶H)，其中所述NADH再生酶任选地在重组微生物中表达9.如权利要求8中要求保护的方法，其中所述NADPH再生酶选自NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)(其至少催化甲酸酶促氧化至CO2)的突变体，其中所述突变体较之非突变的酶，额外地接受NADP+作为辅因子10.如权利要求9中要求保护的方法，其中所述NADP+接受FDH突变体在根据SEQIDNO36的来自母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)N10的FDH的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变11.如权利要求9和10之一中要求保护的方法，其中所述NADP+接受突变体在根据SEQID NO36的第221至226位的序列基序TDRHRL中或在从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中有至少一个突变12.核酸序列，其选自以下核酸序列 a洞时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 b)同时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和非突变的7β-HSDH(野生型)和任选地3 a -HSDH ;或 c)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 d)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和非突变的7 β -HSDH和任选地3 a -HSDH ;或 e)同时编码FDH野生型和如权利要求1至4之一中要求保护的7β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 f)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含FDH野生型，如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 g)同时编码⑶Η、7β -HSDH野生型和任选地3 a -HSDH ;或 h)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含⑶Η、7β -HSDH野生型和任选地3 a -HSDH ;或 i)同时编码⑶H、如权利要求1至4之一中要求保护的7P-HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 k)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含⑶H、如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH013.重组微生物，其携带至少一种如权利要求12中要求保护的核酸序列14.重组微生物，其能够同时表达7β -HSDH(野生型),NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3 a -HSDH ;或其能够同时表达7 β _HSDH(野生型)、⑶H和任选地3 a -HSDH15.重组微生物，其能够同时表达7β -HSDH突变体、NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3 a -HSDH ;或其能够同时表达7 β _HSDH突变体、⑶H和任选地3 a -HSDH16.如权利要求14或15中要求保护的重组微生物，其中所述FDH突变体是根据权利要求9至11之一中定义的突变体；且其中所述FDH野生型是根据SEQ ID NO36的来自母牛分枝杆菌NlO的FDH或从其衍生的具有至少60%序列同一性的FDH17.制备式(I)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法 18.如权利要求17中要求保护的方法，其中在存在如权利要求5中要求保护的重组微生物时至少进行步骤b)19.如权利要求17或18中要求保护的方法，其中步骤b)与相同或不同的辅因子再生系统偶联20.如权利要求19中要求保护的方法，其中步骤b)，7β -HSDH部分步骤，与辅因子再生系统偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NADP+接受FDH突变体再生用过的NADPH并消耗甲酸或其盐；或与辅因子再生系统偶联，其中通过ADH再生用过的NADPH并消耗异丙醇；或与辅因子再生系统偶联，其中通过⑶H再生用过的NADPH并消耗葡萄糖；或与辅因子再生系统偶联，其中通过NADH再生⑶H，ADH或FDH再生用过的NADH21.如权利要求19或20中要求保护的方法，其中步骤b)，3a-HSDH部分步骤，与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NADP+接受FDH突变体再生NADPH并消耗甲酸或其盐；或其中步骤b)与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NAD+和NADP+接受FDH突变体或通过非突变的FDH再生NADH并在每种情况下消耗甲酸或其盐，或通过NAD+接受⑶H再生NADH并消耗葡萄糖22.制备式(I)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法 23.如权利要求22中要求保护的方法，其中使用如权利要求14至16之一要求保护的重组微生物,所述微生物同时表达至少一种如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体，至少一种如权利要求9至11之一中要求保护的NADP+接受FDH突变体和至少一种`3 a -HSDH ;或同时表达至少一种如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体，至少一种⑶H和至少一种3 a -HSDH0`

本发明涉及新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，编码这些酶突变体的序列，制备酶突变体的方法及其在胆酸化合物的酶促反应，特别是在制备熊去氧胆酸(UDCS)中的用途；本发明也涉及使用酶突变体合成UDCS的新方法；和使用重组的，经多重修饰的微生物制备UDCS。

新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法