专利名称：使用腈酶从相应的α-羟基腈生产α-羟基酸、乙醇酸、2-羟基异丁酸的方法已知有各种制备α-羟基酸的方法，使用相应的α-羟基腈作为原料，并且使用微生物作为催化剂。所生产的α-羟基酸的实例包括乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-羟基苯基丙酸、扁桃酸、2-羟基-3，3-二甲基-4-丁内酯和4-甲硫基丁酸。这些产物是利用微生物合成的，所述微生物例如属于诺卡氏菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、金杆菌属、假单胞菌属、乳酪杆菌属、产碱菌属、不动杆菌属、肠杆菌属、节杆菌属、埃希氏菌属、微球菌属、链霉菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、枝动菌属、纤维单胞菌属、欧文氏菌属、念珠菌属、Bacteridium、曲霉属、青霉属、旋孢菌属、镰刀菌属、红假单胞菌属、红球菌属、棒杆菌属、微杆菌属、肥杆菌属和戈登氏菌属的那些(JP-A-4-99495，JP-A-4-99496和JP-A-4-218385，相应于美国专利No.5,223,416；JP-A-4-99497，相应于美国专利No.5,234,826；JP-A-5-95795，相应于美国专利No.5,296,373；JP-A-5-21987；JP-A-5-192189，相应于美国专利No.5,326,702；JP-A-6-237789，相应于EP-A-0610048；JP-A-6-284899，相应于EP-A-0610049；JP-A-7-213296，相应于美国专利No.5,508,181)。不过，上述从相应的α-羟基腈制备α-羟基酸的大多数已知方法不能生产和蓄积产物达到足够高的浓度，以满足商业需求。这经常是酶在反应早期阶段就失活的结果。US 5,756,306教导了“在使用腈酶或腈水合酶水解或水合α-羟基腈来生产α-羟基酸或α-羟基酰胺时，存在酶在短时间内失活的问题。因此难以得到高浓度和高收率的α-羟基酸或α-羟基酰胺”(第1栏第49-54行)。US 5,508,181致力于解决涉及酶迅速失活的困难。具体而言，US5,508,181提到按照离解平衡，α-羟基腈化合物部分地离解为相应的醛。这些醛通过与蛋白质结合使酶在短时间内失活，因而难以从α-羟基腈得到高浓度和高产率的α-羟基酸或α-羟基酰胺(第2栏第16-29行)。作为防止酶因醛的蓄积而失活的解决方案，向反应混合物加入磷酸盐或次磷酸盐离子。US 5,326,702与US 5,508,181相似，但是使用亚硫酸盐、亚硫酸氢盐或连二亚硫酸盐离子来螯合醛，防止酶失活。不过，即使使用上述这类添加剂，所生产和蓄积的α-羟基酸的浓度也不高。US 6,037,155也教导了α-羟基酸产物的低蓄积与酶因所离解的醛的蓄积而在短时间内失活有关。这些发明人提出酶的活性受氰化氢存在的抑制(Agricultural Biological Chemistry，Vol.46，p.1165(1982))，后者是在α-羟基腈以及相应的醛或酮在水中的部分离解作用中生成的(Chemical Reviews，Vol.42，p.189(1948))。这些发明人使用微生物解决了醛诱发的酶失活问题，通过向反应混合物加入一种氰化物，能够提高这些微生物的酶活性。氰化物的加入限制了α-羟基腈向醛和氰化氢的离解作用。将反应混合物中的醛浓度(由α-羟基腈向醛和氰化氢的离解作用生成)和/或α-羟基腈浓度保持在指定的范围内，是一种避免该问题的方法。乙醇酸(HOCH2COOH；CAS登记号79-14-1)是羧酸的α-羟基酸家族中最简单的成员。它的独特性质使它得到用户和工业上的广泛应用，包括在井修复、皮革工业、油气工业、洗衣与纺织工业中的用途，以及作为个人护理产品例如皮肤霜膏中的组分。乙醇酸还是多种工业清洁剂(乳品与食品加工设备清洁剂、家用与公共清洁剂、工业清洁剂(用于运输设备、砖石建筑、印刷电路板、不锈钢锅炉与加工设备和冷却塔/热交换器)和金属加工(用于金属酸洗、铜增亮、蚀刻、电镀、电抛光))的主要成分。商业化生产乙醇酸的新技术将是工业热衷接受的。关于乙醇酸的生产，已知乙醇腈可逆地离解为氰化氢和甲醛，二者都能使酶活性失活。US 3,940,316描述了使用具有“腈酶”活性的细菌从相应的腈制备有机酸的方法，列举了作为底物的乙醇腈。具体而言，该专利描述了为此使用芽孢杆菌属、Bacteridium、微球菌属和短杆菌属。尽管被描述为具有腈酶活性，不过短杆菌R312是唯一用在US 3,940,316所有实施例中的菌株。已知短杆菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但是没有腈酶活性(Tourneix等，Antonie vanLeeuwenhoek，1986，52173-182)。JP 09028390公开了通过红球菌属或戈登氏菌属水解酶的作用从乙醇腈制造高纯度乙醇酸的方法。乙醇酸的选择性据报道是几乎100％的，没有乙醇酸酰胺的生成。2-羟基异丁酸(CAS登记号594-61-6)在多种工业原料包括粘合剂和涂料的生产中用作中间体。
使用属于棒杆菌属的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法公开在日本专利申请No.昭61-56086中。已经使用属于红球菌属、假单胞菌属、节杆菌或短杆菌(JP 04040897 A2)和无色杆菌属(JP06237776 A2)的微生物从丙酮合氰化氢生产2-羟基异丁酸。在使用红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(ATCC 19140)时，向反应混合物加入浓度0.5-50wt％的丙酮可提高2-羟基异丁酸生产的效率(JP05219969 A2)，这大概是氰化氢的螯合作用所致。
US 6,037,155也提供了从α-羟基腈生产α-羟基酸包括乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法实例。该文承认，由于上述问题，不是所有的微生物催化剂都能够生产高浓度的乙醇酸，并指出为了发现工业上有利的微生物，必须进行筛选研究。US 6,037,155具体鉴别了属于贪噬菌属和节杆菌属的微生物，它们耐受α-羟基腈或α-羟基酸的抑制效果，具有持久的活性，能够生产高浓度的所需产物。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)是以脂族腈酶(EC 3.5.5.7)活性以及腈水合酶(EC 4.2.1.84)与酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的组合为特征的。US 5,858,736描述了在水性反应混合物中利用这种微生物的腈酶活性催化脂族α，ω-二腈水解为对应的ω-氰基羧酸和氨。已发现腈酶是高度区域选择性的，α-烷基-α，ω-二腈的水解作用仅生成ω-氰基羧酸，这是由ω-腈基的水解作用所致。US 5,814,508公开了将敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)在适当缓冲液中的悬浮液在35-70℃下加热短时使全细胞催化剂不合意的腈水合酶和酰胺酶活性失活，不会显著减少所需的腈酶活性。
如上所述，开发使用腈酶催化剂高效制造α-羟基酸的工业方法已经证实是困难的。在产物的浓度很低时，对本领域技术人员而言熟知的是方法趋于复杂化，特别是为了从未反应的原料中分离产物，或者从大体积产物混合物中分离少量所需产物。所要解决的问题仍然是缺乏温和的酶催化剂，以转化α-羟基腈为对应的酸，该方法应当以高收率、高浓度和高选择性为特征，并且附加了低温要求和低废料产出的优点。
发明概述本发明提供从相应的α-羟基腈制备α-羟基酸的方法，选择性高，转化率高。本发明具有下列步骤(a)使α-羟基腈在适合的水性反应混合物中与以来自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性为特征的催化剂接触；和(b)分离在(a)中所生成的α-羟基酸。
本发明更具体地提供从乙醇腈制备乙醇酸的方法，选择性高，转化率高。本发明具有下列步骤(a)使乙醇腈在适合的水性反应混合物中与以来自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性为特征的催化剂接触；和(b)分离在(a)中所生成的乙醇酸。另外，本发明涉及使用具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化剂从丙酮合氰化氢生产2-羟基异丁酸。
在发明进一步的实施方案使用具有腈酶活性的催化剂，它是全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分和部分纯化的酶或纯化的酶的形式。以腈酶活性为特征并且可用在该方法中的微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)及其突变体、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC55745)。另外，含有敏捷食酸菌腈酶活性的转化微生物细胞也包括在本发明中。大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大肠杆菌SW91(ATCCPTA-1175)是这样的转化微生物细胞催化剂的实例。
本发明的进一步的实施方案使用以(1)腈酶活性和(2)腈水合酶与酰胺酶活性为特征的全微生物细胞作为酶催化剂，用于转化乙醇腈为乙醇酸或者转化丙酮合氰化氢为2-羟基异丁酸。优选的全细胞是A.facilis 72W菌株。不过，在用作催化剂之前，将A.facilis 72W全微生物细胞加热至约35℃至70℃的温度达10至120分钟，由此破坏腈水合酶和酰胺酶活性，保存腈酶活性。这种处理避免了所不想要的副产物(分别为乙醇酰胺或2-羟基异丁酰胺)的生成。若突变体和转化全微生物细胞缺乏腈水合酶和酰胺酶活性，无需热处理步骤。大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大肠杆菌SW91(ATCC PTA-1175)是缺乏腈水合酶和酰胺酶活性的转化微生物细胞催化剂的实例。
以任意方式和可选地，酶催化剂可以被固定在可溶性或不溶性载体之中或之上。
生物保藏的简要说明出于专利程序的目的，申请人已经根据关于国际微生物保藏的布达佩斯条约进行了下列生物保藏保藏物名称 国际保藏命名 保藏日期敏捷食酸菌72-PF-17 ATCC 55745 1996年3月8日敏捷食酸菌72WATCC 55746 1996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-15 ATCC 55747 1996年3月8日大肠杆菌SS1001 ATCC PTA-1177 2000年1月11日大肠杆菌SW91 ATCC PTA-1175 2000年1月11日本文所用的“ATCC”表示American Type Culture CollectionInternational Depository Authority，位于ATCC，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA。“国际保藏命名”是对保藏在ATCC的培养物的入藏号。
所列举的保藏物将在所示国际保藏单位保存至少三十(30)年，在公开它的专利授权后，将可为公众所利用。保藏物的可利用性并不构成实施本发明而侵犯由政府行为授予的专利权的许可。
发明的详细说明申请人已经通过提供利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性从对应的α-羟基腈以高收率和高浓度制备α-羟基酸的方法，解决了所述问题。申请人通过提供利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性从对应的乙醇腈以高收率和高浓度制备乙醇酸的方法，已经更具体地解决了所述问题。另外，本发明还涉及使用具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化剂从丙酮合氰化氢生产2-羟基异丁酸。以高选择性和高转化率生产产物。
由本发明生产的乙醇酸、2-羟基异丁酸或α-羟基酸在多种工业中具有有用的应用。例如，2-羟基异丁酸用作中间体生产异丁烯酸。本发明提供可取的方法，其优点在于低温要求和低废料产出，相对于以前已知的方法而言。
本发明包括下列步骤(a)使α-羟基腈在适合的水性反应混合物中与以腈酶(EC 3.5.5.7)活性或者以腈水合酶(EC 4.2.1.84)与酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性为特征的催化剂接触；和(b)分离以酸或相应的盐形式的在(a)中所生成的相应的α-羟基酸。腈酶直接转化脂族腈为相应的羧酸，不生成相应的酰胺作为中间体(反应式1)。
反应式1 定义本文使用多个术语和缩写。除非有具体的相反规定，适用下列定义。
术语“催化剂”、“酶催化剂”或“全微生物细胞催化剂”表示以腈酶活性为特征的催化剂。该酶催化剂可以是全微生物细胞、透化微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式。
术语“敏捷食酸菌”和“A.facilis”是可互换使用的。
术语“大肠杆菌”和“E.coli”是可互换使用的。
术语“乙醇腈”与羟基乙腈、2-羟基乙腈、羟甲基腈和CAS登记号107-16-4的所有其他同义词是同义的。
术语“乙醇酸”与羟基乙酸、羟基醋酸和CAS登记号79-14-1的所有其他同义词是同义的。
术语“丙酮合氰化氢”与2-羟基-2-甲基-丙腈、2-甲基-乳腈、α-羟基异丁腈、2-氰基-2-羟基丙烷、2-氰基-2-丙醇、2-羟基-2-氰基丙烷、2-羟基-2-甲基丙腈、2-羟基异丁腈、2-甲基-2-羟基丙腈、2-甲基乳腈、2-丙酮合氰化氢、二甲酮合氰化氢和CAS登记号75-86-5的所有其他同义词是同义的。
术语“2-羟基异丁酸”与2-羟基-2-甲基-丙酸、2-甲基-乳酸、α-HIB、α-羟基-α-甲基丙酸、α-羟基异丁酸、2-羟基-2-甲基丙酸、2-甲基乳酸、醋酮酸、羟基二甲基乙酸和CAS登记号594-61-6的所有其他同义词是同义的。
术语“适合的水性反应混合物”指材料与水，在其中α-羟基腈(例如乙醇腈或丙酮合氰化氢)与酶催化剂接触。本文提供了描述适合的水性反应混合物的组分的表格，本领域技术人员可以领会到适合于该方法的组分变化范围。
说明书中的缩写对应于测量、工艺、性质或化合物的单位如下sec表示秒，min表示分钟，h表示小时，d表示天，mL表示毫升，L表示升，mM表示毫摩尔，M表示摩尔，mmol表示毫摩尔，wt表示重量，HPLC表示高效液相色谱，ca表示大约，O.D.表示在指定波长下的光密度，IU表示国际单位。
优选实施方式的说明方法和材料以腈酶活性为特征并且可用在该方法中的微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)。以(1)腈酶活性和(2)腈水合酶与酰胺酶活性为特征的全微生物细胞可以用作酶催化剂。优选的全细胞是A.facilis 72W菌株。不过，在用作催化剂之前，将A.facilis 72W全微生物细胞加热至约35℃至70℃的温度达10至120分钟，由此破坏腈水合酶和酰胺酶活性，保存腈酶活性(US.5,814,508)。这种热处理所得催化剂避免了当相应的α-羟基腈的转化不完全时，生成所不想要的副产物(分别为乙醇酰胺或2-羟基异丁酰胺)。若突变体和转化全微生物细胞缺乏不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性，无需热处理步骤。
已经制备了敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)菌株的两种突变体(US5,858,736)，仅产生非常低水平的不希望有的腈水合酶活性，后者负责脂族二腈的非区域选择性腈水解作用。这些突变菌株，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)在用作本发明催化剂之前不需要细胞的热处理。
含有A.facilis腈酶活性并且缺乏腈水合酶和酰胺酶活性的转化微生物细胞也包括在本发明中。大肠杆菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大肠杆菌SW91(ATCC PTA-1175)是这样的转化微生物细胞催化剂的实例。
敏捷食酸菌菌株72W(ATCC 55746)的生长融化一小瓶冷冻的敏捷食酸菌菌株72W(ATCC 55746)菌种，将1mL内容物置于500mL无菌接种培养基上(组分列在下表1和2中)。在2L烧瓶内，使接种物在30℃下生长24-30h，同时在250rpm下摇动。
表1接种培养基组分 最终浓度 组分 最终浓度磷酸二氢钾1.5g/L 磷酸一氢钾 3.4g/L硫酸铵1.5g/L 柠檬酸三钠二水合物 1g/L硫酸镁七水合物0.4g/L 痕量金属溶液(见下) 1mL/LAmberex 695(Universal Foods) 1g/L 甘油(单独灭菌) 8g/L表2痕量金属溶液组分 储备液浓度盐酸 10mL/L氯化钙二水合物11.4g/L硫酸锰一水合物1.23g/L硫酸铜五水合物0.63g/L氯化钴六水合物0.16g/L硼酸 0.91g/L硫酸锌七水合物1.77g/L钼酸钠二水合物0.05g/L硫酸氧钒二水合物 0.08g/L硝酸镍六水合物0.04g/L亚硒酸钠 0.04g/L硫酸亚铁七水合物 6.0g/L将摇瓶接种物无菌转移至预先灭菌的Braun Biostat C发酵罐内，其中含有发酵培养基(组分列在下表3中)。在下列条件下生长32℃，pH6.8-7.0，溶解氧的饱和度25％。接种时，发酵罐含有8.5L发酵培养基加218g营养溶液，所得甘油的起始浓度大约7g/L。营养溶液包括下列组分，将它们单独灭菌，冷却后合并磷酸二氢钾19.6g的去离子水(0.25L)溶液；硫酸镁七水合物3.3g加硫酸4mL的去离子水(0.15L)溶液；痕量金属溶液(组分列在上表2中)67mL加400g甘油的去离子水(0.80L)溶液。接种后18h，开始加入营养溶液。最初，营养溶液的加入速率为0.4g/min(0.15g甘油/min)。培养物的OD550为大约8-9。在26h，加入速率增加至0.9g/min(0.3g甘油/min)。OD550为大约16-18。最后在第34h增加加入速率至1.8g/min(0.6g甘油/min)。保持该速率至结束(约42h)。最终的OD550为大约65-75。
表3发酵培养基组分储备液浓度磷酸二氢钾 0.39g/LDifco酵母提取物 5.0g/L磷酸一氢钾 0.39g/L离心回收细胞，为湿细胞糊，冷冻贮存备用。将湿细胞糊冷冻干燥，所得干细胞重量通常为湿细胞重量的24％。为了用作生物催化剂，首先可选地将A.facilis 72W(ATCC 55746)细胞在0.35M磷酸盐缓冲液(pH7.0)中加热至50℃达1h，以使腈水合酶活性失活。
敏捷食酸菌72W的腈酶活性用于生产α-羟基酸除了腈酶以外，A.facilis 72W全细胞还含有腈水合酶和酰胺酶。腈水合酶转化α-羟基腈为α-羟基酰胺(例如转化乙醇腈为乙醇酰胺)，后者是引起收率下降的所不想要的副产物(实施例2)。为了避免这种副产物，可以对A.facilis 72W全细胞催化剂进行热处理，以除去腈水合酶/酰胺酶活性，所得微生物催化剂对乙醇酸具有高选择性，不会产生乙醇酰胺(实施例1)。乙醇酸和2-羟基异丁酸的生产浓度可以达到1mM至5M，优选200mM至2M。酶活性稳定持续长时间。
全微生物细胞可以用作催化剂，无需任何预处理，例如透化。作为替代选择，全细胞可以被本领域技术人员熟悉的方法所透化(例如用甲苯、洗涤剂处理或者冷冻融化)，以提高材料向细胞内外扩散的速率。
酶催化剂可以被固定在聚合物基质(例如藻酸盐、角叉菜胶、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝胶(PAG))中或者固定在可溶性或不溶性载体(例如celite)上，以促进催化剂的回收和再利用。将细胞固定在聚合物基质中或者可溶性或不溶性载体上的方法已有广泛的报道，是本领域技术人员熟知的。还可以从该全细胞中分离腈酶，直接用作催化剂，或者可以将腈酶固定在聚合物基质中或者可溶性或不溶性载体上。这些方法已有广泛的报道，是本领域技术人员熟知的(Methods inBiotechnology，Vol.1Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。
酶催化剂在反应混合物中的浓度取决于酶催化剂的比催化活性，根据所需反应速率加以选择。水解反应中全微生物细胞催化剂的湿细胞重量通常从0.001g至0.100g湿细胞/每mL总反应体积，优选0.002g至0.050g湿细胞/每mL。全微生物细胞催化剂的比活性(IU/克湿细胞wt)是这样测定的，使用已知重量的全微生物细胞催化剂，在25℃下测量0.10M乙醇腈溶液向乙醇酸转化的比率。酶活性的IU被定义为每分钟转化一微摩尔底物为产物所需酶活性的量。
对水解反应的温度加以选择，以优化反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可以从悬浮液的凝固点(ca.0℃)以上至70℃，优选的反应温度范围从5℃至35℃。全微生物细胞催化剂悬浮液可以这样制备，将细胞悬浮在蒸馏水中，或者悬浮在含有缓冲剂(例如磷酸的钠或钾盐)的水性反应混合物中，其中反应的初始pH在5.0与10.0之间，优选在6.0与8.0之间。随着反应的进行，反应混合物的pH可能由于从对应的α-羟基腈的腈官能度生成α-羟基酸的铵盐而改变。反应可以进行至α-羟基腈完全转化而无需pH控制，或者可以在反应过程中加入适合的酸或碱，以保持所需的pH。
所得乙醇酸可以这样分离，利用普通技术人员熟知的工艺，处理已经除去包括细胞在内的不溶物的反应混合物。这类工艺包括但不限于浓缩、离子交换、电透析、萃取和结晶。产物可以铵盐的形式分离，或者在酸化之后以乙醇酸的形式分离。
已知丙酮合氰化氢在水中可逆地离解为氰化氢和丙酮(Stewart等，J.Am.Chem.Soc.623281-5(1940))，随着反应混合物的pH降低，有利于生成丙酮合氰化氢的平衡。酶催化的丙酮合氰化氢水解的最佳pH是尽可能低的能保留酶活性的pH，通常为，但不限于，pH4.5-6.0。在反应结束时剩余的丙酮可以被回收和用于生产丙酮合氰化氢。使丙酮再循环用作起始反应物，可以提高丙酮合氰化氢向2-羟基异丁酸的总体转化率。
所得2-羟基异丁酸可以这样分离，利用普通技术人员熟知的工艺，处理已经除去包括细胞在内的不溶物的反应混合物。这类工艺包括但不限于浓缩、离子交换、蒸馏、电透析、萃取和结晶。产物可以铵盐的形式分离，或者(在酸化之后)以2-羟基异丁酸的形式分离。
实施例下列实施例进一步详细说明本发明。应当理解，这些实施例显示本发明优选的实施方案，不过仅供例证。本领域技术人员从上述讨论和这些实施例能够确定本发明的必要特征，并且在不背离其精神和范围的前提下能够对发明进行各种改变和修饰，以适应各种用途和条件。
实施例1-4中，乙醇腈向反应产物乙醇酸和乙醇酰胺的转化是用HPLC测定的，其中使用Bio-Rad HPX-87H有机酸分析柱(30cm×7.8mmdia.)，柱前温度50℃，洗脱剂0.010N H2SO4，使用折光率检测器。
实施例5和6中，丙酮合氰化氢的回收百分率和2-羟基异丁酸、2-羟基异丁酰胺与丙酮的百分产率是基于丙酮合氰化氢在反应混合物中的初始浓度的，是用HPLC测定的，其中使用折光率检测器和Bio-Rad HPX-87H有机酸分析柱(30cm×7.8mm dia.)，柱前温度50℃，洗脱剂0.010N H2SO4，流速1mL/min。
实施例1利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性转化乙醇腈为乙醇酸将0.62g(湿细胞糊)敏捷食酸菌72W细胞(ATCC 55746)在9.38mL0.100M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的悬浮液置于15mL聚丙烯离心管内，将细胞悬浮液在50℃下加热1h(使不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性完全失活)，然后在水浴中冷却至25℃。将悬浮液离心，滗出上清液；将细胞粒状沉淀再悬浮在9.48mL 0.020M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中，在25℃下混合15min，然后将悬浮液离心。滗出上清液。将所得细胞粒状沉淀再悬浮在9.38mL 0.020M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中。然后向该管加入0.106mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在悬浮液中的最终浓度为0.10M)，在25℃旋转平台上混合所得悬浮液。先将分析样本(0.200mL)用6N HCl调至pH2.5以终止反应，离心，用0.2微米滤器过滤上清液。用HPLC分析所得滤液的乙醇腈、乙醇酸和乙醇酰胺。2h后，乙醇腈已经完全转化为乙醇酸，没有乙醇酰胺生成。
在初始浓度的乙醇腈完全转化之后，向反应混合物加入另外0.312mL 55wt％乙醇腈水溶液(向反应混合物加入另外0.30M乙醇腈，总计0.40M)，继续反应。14h后，另外的乙醇腈几乎完全转化为乙醇酸，向反应混合物加入另外0.624mL 55wt％乙醇腈水溶液(另外0.60M乙醇腈，总计1.0M)。40h后，观察到1.0M乙醇腈完全转化为乙醇酸，没有乙醇酰胺生成。
实施例2(对比)使用具有腈酶和腈水合酶/酰胺酶活性的敏捷食酸菌72W细胞转化乙醇腈为乙醇酸和乙醇酰胺重复实施例1所述反应，但是在用于反应之前没有将A.facilis72W细胞在磷酸盐缓冲液中的悬浮液在50℃下加热1h以使细胞的腈水合酶和酰胺酶活性失活。在25℃下混合0.52g(湿细胞糊)A.facilis72W细胞(ATCC 55746)在9.48mL 0.020M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中的悬浮液，所述缓冲液含有0.106mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在悬浮液中的最终浓度为0.10M)。2h后，乙醇腈的转化完全，乙醇酸和乙醇酰胺的收率分别为大约61％和39％。
反应2h后，向反应混合物加入另外0.312mL 55wt％乙醇腈水溶液(向反应混合物加入另外0.30M乙醇腈，总计0.40M)。4h后，剩余大量另外的乙醇腈，乙醇酸与乙醇酰胺的浓度比为ca.3.4∶1。向反应混合物加入另外0.624mL 55wt％乙醇腈水溶液(另外0.60M乙醇腈，总计1.0M)。22h后，剩余ca.40％乙醇腈，乙醇酸与乙醇酰胺的浓度比为ca.9∶1。
实施例3使用敏捷食酸菌突变体72-PF-15(ATCC 55747)或72-PF-17(ATCC 55745)转化乙醇腈为乙醇酸重复实施例1所述反应，但是使用突变体菌株A.facilis 72-PF-15或72-PF-17代替A.facilis 72W。将0.50g(湿细胞糊)A.facilis 72-PF-15或72-PF-17在8.44mL 0.020M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中的悬浮液置于15mL聚丙烯离心管内。然后向该管加入1.06mL55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在悬浮液中的最终浓度为1.0M)，在25℃旋转平台上混合所得悬浮液。先将分析用悬浮液样本(0.200mL)用6NHCl调至pH2.5以终止反应，离心，用0.2微米滤器过滤上清液。足够的时间后，乙醇腈完全转化为乙醇酸，没有副产物乙醇酰胺生成。
实施例4使用大肠杆菌转化体SS1001(ATCC PTA-1177)或SW91(ATCCPTA-1175)转化乙醇腈为乙醇酸重复实施例1所述反应，但是使用大肠杆菌转化体SS1001或SW91代替A.facilis 72W。将0.50g(湿细胞糊)大肠杆菌SS1001或SW91在8.44mL 0.020M磷酸钾缓冲液(pH6.0)中的悬浮液置于15mL聚丙烯离心管内。然后向该管加入1.06mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在悬浮液中的最终浓度为1.0M)，在25℃旋转平台上混合所得悬浮液。先将分析用悬浮液样本(0.200mL)用6N HCl调至pH2.5以终止反应，离心，用0.2微米滤器过滤上清液。足够的时间后，乙醇腈完全转化为乙醇酸，没有副产物乙醇酰胺生成。
实施例5利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性转化丙酮合氰化氢为2-羟基异丁酸将0.34g(湿细胞糊)敏捷食酸菌72W细胞(ATCC 55746)在5.61mL100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中的悬浮液置于15mL聚丙烯离心管内，将细胞悬浮液在50℃下加热0.5h(使不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性完全失活，同时保存腈酶活性)，然后在水浴中冷却至25℃。然后向该管加入51.0mg丙酮合氰化氢(丙酮合氰化氢在悬浮液中的最终浓度为0.10M)，在25℃旋转平台上混合所得悬浮液。将分析样本(0.180mL)与0.020mL 1.0M丙酸(HPLC外标)混合，离心，用HPLC分析上清液的丙酮合氰化氢、丙酮、2-羟基异丁酸和2-羟基异丁酰胺。21h后，2-羟基异丁酸、2-羟基异丁酰胺和丙酮的收率分别为21.6％、0％和71.3％，没有丙酮合氰化氢剩余。
实施例6使用大肠杆菌转化体SS1001转化丙酮合氰化氢为2-羟基异丁酸将0.66g(湿细胞糊)大肠杆菌转化体SS1001(ATCC PTA-1177)在5.29mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)中的悬浮液置于15mL聚丙烯离心管内，然后加入51.0mg丙酮合氰化氢(丙酮合氰化氢在悬浮液中的最终浓度为0.10M)，在25℃旋转平台上混合所得悬浮液。将分析样本(0.180mL)与0.020mL 1.0M丙酸(HPLC外标)混合，离心，用HPLC分析上清液的丙酮合氰化氢、丙酮和2-羟基异丁酸。8h后，2-羟基异丁酸、2-羟基异丁酰胺和丙酮的收率分别为23.0％、0％和65.6％，没有丙酮合氰化氢剩余。


本发明涉及使用具有腈酶活性的催化剂从对应的α－羟基腈生产α－羟基酸的方法。更具体而言，本发明涉及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈酶水解乙醇腈为乙醇酸或者水解丙酮合氰化氢为2－羟基异丁酸的用途。使乙醇腈在水性混合物中与具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化剂反应，以高浓度、高收率选择性地得到乙醇酸。