专利名称：一种葡萄糖脱氢酶的生产方法葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,缩写GlcDH),是短链乙醇脱氢酶家族的一员，在辅酶NAD (P)+等存在时能够催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸。葡萄糖脱氢酶广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等方面，这些酶催化反应一般都需要辅酶NAD (P) H的参与，而这些辅酶价格昂贵，因此NAD(P)H的再生对于消减成本是非常必要的。美国施贵宝公司在利用白地霉脱氢酶不对称还原4-氯-3-羰基丁酸甲酯合成(s) -4-氯-3-羟基丁酸甲酯的规模化生产中，有效地利用了葡萄糖脱氢酶进行辅酶NADP+-NADPH的循环，该反应的产率高达95%，产品为降胆固醇药物的手性原料。现有技术中，葡萄糖脱氢酶主要从动物的肝脏提取，或者由芽孢杆菌发酵而来，来源受到限制。而国内葡萄糖脱氢酶都主要依靠进口。由于葡萄糖脱氢酶具有广泛的应用价值，市场需求量也日益增加，因此，开发一种廉价高效的葡萄糖脱氢酶的生产方法具有十分重要的现实意义。
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中葡萄糖脱氢酶的来源受到限制而难以满足市场需求的问题，提供一种利用基因工程菌发酵生产葡萄糖脱氢酶的方法。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案一种葡萄糖脱氢酶的生产方法，是先构建表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌并将其接种至初始培养基中进行发酵，发酵过程中通过流加补料技术向包含所述重组大肠杆菌的发酵液中添加补料培养基，当发酵参数达到设定阈值时，再向发酵液中添加诱导剂，并继续发酵一定时间至发酵结束，最后从发酵液的培养物中取得葡萄糖脱氢酶；其中，流加补料时，补料培养基的流加速度随着发酵时间的延长而梯度递增，至添加诱导剂后保持不变。流加补料技术是发酵过程中用来提高菌体浓度的一种传统方法。这种方法能控制发酵时培养液中营养成分的浓度，因此在细胞生长或产物形成对底物浓度受限敏感的工艺过程中使用比较理想。根据本发明，所述的发酵参数可以为发酵液的细胞光密度、发酵液中的溶氧或发酵液中的碳源总浓度等。若未经特殊说明，本发明中所述的细胞光密度皆指的是0D_值。0D_是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。OD是optical density (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。0D_指的就是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率成反比。本发明优选的一种生产方法，包括以下步骤(1)、准备阶段构建基因工程菌，配制种子培养基、初始培养基和补料培养基；使基因工程菌在所述种子培养基中活化，然后将活化后得到的种子液接种到初始培养基中进行发酵，按体积比，接种时种子液/初始培养基=1°/Γ4% ;所述基因工程菌为表达了葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌；(2)、发酵过程本发明根据发酵进行的不同阶段，细胞对培养液中营养成分的消耗速度不同，将发酵过程分为六个阶段，并以培养液中的细胞光密度(0D_)来划分这六个阶段， 依次为第一阶段(Γ4、第二阶段Γ8、第三阶段8 12、第四阶段12 16、第五阶段16 20和第六阶段 OD6tltl > 20 ；当发酵液中的细胞光密度(0D_)随着发酵的进行依次达到4、8、12、16、20时，通过流加补料技术分批向发酵液中补充补料培养基，且补料培养基的流加速度依次对应为(TlOg/ l/h、l(T20g/l/h、2(T30g/l/h、3(r40g/l/h、4(r50g/l/h ;当细胞光密度(0D_) > 20 时，向发酵液中添加诱导剂，且诱导剂在发酵液中的加入质量占发酵液总量的O. 019Γ0. 2% ;然后在保持补料培养基的流加速度不变的情况下继续发酵16 20小时；发酵过程的前五个阶段为菌体生长阶段，补料培养基的流加速度保持较低，在(Γ40 g/ Ι/h之间,且补料培养基的流加速度应随着发酵的进行逐渐加快，以适应菌体生长对培养液中营养物质的需求增加；发酵过程的第六阶段为诱导表达阶段，补料培养基的流加速度应保持较快，在40 50 g/1/h之间。(3)、步骤(2)完成后，采用常规方法从步骤(2)所得发酵液的培养物中取得葡萄糖脱氢酶，经后续处理，完成整个生产过程。优选地，所述初始培养基包括蛋白胨6 15g/L、酵母粉5 10g/L、甘油6 18g/L、硫酸镁f4g/L、磷酸盐r8g/L和氯化钠5 12g/L ;所述补料培养基包括蛋白胨、酵母粉和甘油，且按质量计蛋白胨酵母粉甘油=2:1:14 15。优选地，发酵过程中，发酵液的溶氧维持在309Γ40%之间，发酵液pH值控制在
6.8 7.3之间(可用氨水调节)。优选地，所述诱导剂为异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。优选地，添加诱导剂前，发酵温度控制在37°C ;添加诱导剂后的发酵温度控制在 28°C。即发酵过程的前五个阶段(菌体生长阶段)，温度应控制在37°C，利于菌体繁殖生长， 而发酵过程的第六阶段(诱导表达阶段)，发酵温度应控制在28°C，利于葡萄糖脱氢酶的诱导生成。优选地，步骤(I)中，所述种子培养基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl IOg/ L,且pH值为7. 0，使用前需高温灭菌。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点
I、本发明利用基因工程菌发酵的方法获得葡萄糖脱氢酶，根据发酵过程的不同阶段采用流加补料的技术为发酵液逐渐补充营养物质，使发酵过程中的发酵条件尽可能与菌体实际需要相适应，大大有利于菌体的生长和外源蛋白的高效表达。2、本发明可有效避免由于发酵某个阶段培养基过量引起的底物抑制，并可有效控制诱导表达阶段菌体的生长速度。
3、用本发明方法生产葡萄糖脱氢酶的时候，葡萄糖脱氢酶的表达量在总蛋白中的比例可高达47. 2%，可达6. 3g/L。

种子培养基
蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 10 g/L，调节pH=7. 0，121°C灭菌20分钟。初始培养基
蛋白胨12g/L、酵母粉6 g/L、甘油18 g/L、硫酸镁2. 3 g/L、磷酸二氢钾I. 7 g/L、磷酸氢二钾2. 6 g/L、氯化钠10 g/L，调节pH=7. 2，加消泡剂O. 5 g/L，121°C灭菌30分钟。初始装液量5L。补料培养基
蛋白胨为60 g/L，酵母粉为30 g/L，甘油为432 g/L，121°C灭菌30分钟。以下通过葡萄糖脱氢酶的几种不同发酵生产方法的对比，对本发明的生产方法做进一步说明。实施例I
本实施例提供一种发酵过程中不采用流加补料技术来生产葡萄糖脱氢酶的方法，具体过程如下
甘油管保存的重组大肠杆菌种子经种子培养基活化15小时后，按2%接种量接入发酵罐。发酵罐参数设置温度37°C，初始通气量5L/min，初始搅拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 为100%。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30%-40%之间，用氨水控制 pH=7. 2 + 0. I。发酵3小时左右，当OD600达到4时，开始降温至28°C，并加入占发酵液总量
O.03%的IPTG，继续培养12小时至溶氧回升至100%，培养基营养成分耗尽后发酵结束。采用此发酵工艺，15小时发酵终了时，菌体浓度(用细胞光密度OD6c 表示)达到 15，葡萄糖脱氢酶产量可以达到1.6g/L。实施例2
本实施例提供一种发酵过程中采用恒速流加补料技术来生产葡萄糖脱氢酶的方法，具体过程如下
甘油管保存的重组大肠杆菌种子经种子培养基活化15小时后，按2%接种量接入发酵罐。发酵罐参数设置温度37°C，初始通气量5L/min，初始搅拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 为100%。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30%-40%之间，用氨水控制 pH=7. 2±0. I。发酵3小时左右，当0D_达到4时，开始以恒定的40 g/1/h的流加速度向发酵液中添加补料培养基。14小时左右，OD600达到20时，开始降温至28°C，并加入占发酵液总量O. 03%的IPTG，保持40 g/1/h的补料速度继续培养14小时后发酵结束。发酵过程搅拌最高转速为600rpm，通气量最大至20L/min，溶氧可一直控制在30%_40%之间。
采用此发酵工艺，28小时发酵终了时，菌体浓度(用细胞光密度OD6c 表示)达到 68，葡萄糖脱氢酶产量可以达到4. 8g/L。实施例3
本实施例提供一种发酵过程中采用本发明的梯度流加补料技术来生产葡萄糖脱氢酶的方法，具体过程如下
甘油管保存的重组大肠杆菌种子经种子培养基活化15小时后，按2%接种量接入发酵罐。发酵罐参数设置温度37°C，初始通气量5L/min，初始搅拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 为100%。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30%-40%之间，用氨水控制 pH=7. 2±0. I。发酵3小时左右，当OD6tltl达到4时，开始以8 g/1/h的流加速度向发酵液中添加补料培养基；5小时左右，当OD6tltl达到8时，调整补料速度为16g/l/h ；7小时左右，当 OD600达到12时，调整补料速度为24 g/1/h ；8. 5小时左右，当0D_达到16时，调整补料速度为32 g/1/h ；10小时左右，当OD600达到20时，调整补料速度为40 g/1/h，同时开始降温至28°C，并加入占发酵液总量O. 03%的IPTG，保持40 g/1/h的补料速度继续培养18小时后发酵结束。发酵过程搅拌最高转速为600rpm,通气量最大至20L/min,溶氧可一直控制在 30%-40% 之间。采用此发酵工艺，28小时发酵终了时，菌体浓度(用细胞光密度OD6c 表示)达到 95，葡萄糖脱氢酶产量可以达到6. 3g/L。以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。


本发明涉及一种葡萄糖脱氢酶的生产方法，主要是采用了微生物发酵方面的流加补料技术，利用基因工程菌发酵生产葡萄糖脱氢酶。具体过程是在37℃的培养温度下，培养含有葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌，从而表达葡萄糖脱氢酶；然后将所述重组大肠杆菌接种至培养基进行发酵，发酵过程中通过流加补料技术向包含所述重组大肠杆菌的发酵液中添加补料培养基，并使流加速度随着发酵时间的延长而梯度递增；当菌体初始生长阶段结束后，加入诱导剂，将温度由37℃降至约28℃后保持恒温，至发酵结束。本发明方法使发酵过程中的发酵条件尽可能与菌体实际需要相适应，可以使菌体密度达到高值，提高葡萄糖脱氢酶的产量，具有极好的产业应用价值。