野生型人生长激素突变体的制作方法[0002]人体的生长激素是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，由191个氨基酸组成，它是体内最重要的促进生长的激素。人生长素(hGH)有较强的种属特异性，除猴的生长素以外，其他动物的生长素对人无效。生长素的生理作用主要有:(I)促进生长:hGH是体内促进生长起关键作用的激素。它作用于全身各组织，特别对骨骼、肌肉及内脏器官的生长作用尤为显著。动物实验表明，幼年动物摘除垂体后，生长随即停止，如及时补充hGH，生长则可恢复。人幼年时期缺乏hGH，则生长停滞，身材矮小，但智力发育不受影响，称为侏儒症；如hGH分泌过多，生长过度，则引起巨人症。成年后hGH分泌过多，由于长骨骨骺已钙化，不再生长，只能使手脚肢端短骨、面骨及其软组织生长异常，出现手足粗大、鼻大唇厚、下颌突出等症，称为肢端肥大症。hGH促进生长作用是由于它能促进骨、软骨、肌肉及其他组织细胞分裂增殖，蛋白质合成增加。实验研究发现，hGH的促进生长作用并不是直接作用。hGH作用于肝、肌肉、肾、心与肺等组织，使这些组织产生一种具有促生长作用的肽类物质，称为生长素介质(SM)。由于它的化学结构与胰岛素相似，所以又称为胰岛素样生长因子(IGF)。生长素介质有IGF-1和IGF-1I两种。hGH的促生长作用主要是通过IGF-1介导的；而IGF-1I主要在胚胎期产生，对胎儿的生长起重要作用。⑵调节代谢:hGH对蛋白质、脂肪和糖的代谢均有调节作用。具体表现为:①促进氨基酸进入细胞，加速蛋白质合成，这也是通过生长素介质介导实现的促进脂肪分解，加速脂肪酸氧化；③抑制组织对葡萄糖的利用，提高血糖水平；生长素分泌过量，一方面影响糖代谢，可使血糖增高，另一方面脂肪分解供能增多，葡萄糖分解减少，也可使血糖增高，引起垂体性糖尿病。[0003]生长素的分泌受到下丘脑分泌的GHRH和GHRIH的双重调节。GHRH促进腺垂体分泌GH ;而GHRIH则抑制GH的分泌。GH的分泌呈脉冲式，其波动周期为1_4小时，这是因为受到下丘脑GHRH脉冲式释放的控制。睡眠过程中的慢波睡眠期hGH分泌达高峰，这对促进生长是有利的。代谢因素也可影响hGH的分泌，如血糖降低、血中氨基酸与脂肪酸增高均可引起hGH分泌增加。[0004]儿童身高的增长主要是长骨的骨干与骨骺之间的软骨板中的细胞分裂增殖实现的，而生长激素正是对这种软骨细胞的分裂增殖具有显著的促进作用。进入青春发育期时，生长激素在性激素的协同作用下，更进一步引起身高的快速增长。生长激素还具有促进蛋白质合成的作用，所以对体内各种器官组织的生长也有积极作用。当儿童患有先天或后天性疾病，引起生长激素缺乏或分泌不足时，可造成身材矮小，甚至侏儒症，全身各种器官组织的生长也较迟滞。可表现为身材增长缓慢。婴儿起病者出生时身长和体重可正常，I~2岁以后生长落后，停滞于幼儿身材。儿童起病者生长逐渐缓慢平均身高增长每年小于3cm，身体各部分比例同儿童期，头大，手足小，面容幼稚但较躯体显老，皮肤细腻，毛发少且柔软，身体脂肪多，肌肉不发达，智力发育与同龄儿童无区别。骨骼发育不全，骨龄幼稚，骨骼短小，身高常小于130cm。骨龄常代表骨骼成熟的程度，常用腕、肘关节X线观察骨化中心出现的情况计算。11岁女孩大约90%骨骺已形成，男孩约80%形成，如骨龄的成龄的成熟超过其身高的增长，最终身高将较低。[0005]hGH正常基础值4~8ng/ml，夜间入睡后30~60分钟出现hGH高峰，可于入睡后60分钟取血测定，即睡眠试验，病儿基础值往往低于零，且睡眠后无高峰出。还可让稍大的患儿运动，如上、下楼梯5分钟后测hGH。但此2项结果正常儿童与患儿常有重叠，故hGH值升高可除外hGH缺乏症,而降低不能确诊本症。[0006]hGH作为治疗侏儒症特效药于1958年已经在临床上使用。但是由于这种药品只能从人的脑垂体前叶提取，一名侏儒患者每年所需要的药量约需从50个尸体的脑垂体中提取，这样就大大限制了它在临床上的其他适应症研究。为解决hGH的供给问题，美国专门制定了法律，规定所有美国公民死后都有无偿贡献脑垂体的义务，国家建立脑垂体库，以保证来源。但是在用了几年这样提取出的hGH后，发现几个使用者被传染上了致命的病毒，病人肌肉逐渐萎缩、痴呆，几年后死亡，后来证实是疯牛病。因此美国食品药品监督管理局(FDA)在上世纪80年代停止一切提取自尸体脑垂体的hGH应用于人体上。[0007]20世纪80年代，基因工程兴起。1986年，波耶尔首次通过基因重组技术合成出hGH，实现了 hGH的大量生产。由于能够在药厂大规模生产，它的临床适应症不断被扩展。不仅在促进人体身材长高广泛临床应用之外，而且在抗组织器官衰竭、改善重症病人营养、治疗恶液质(营养衰竭)，抗感染和炎症、促进创伤和烧伤愈合、提高机体免疫力等方面都有广泛应用。[0008]人工合成的生长素与人脑垂体产生的生长激素的化学结构完全一样。适当采用生长素作为替代治疗，可明显地促进患儿的身高增长，并改善全身各器官组织的生长发育。基因重组人生长激素是美国FDA 批准的促进儿童身高增长的唯一有效药物，对各种生长发育迟缓类疾病均有较确切疗效。目前，人生长激素在临床主要应用于青少年矮小症、外科术后和重症烧伤、心衰、抗衰老等方面。


[0009]本发明的 申请人:在已有的野生型人生长激素X线衍射晶体结构的基础上，对其活性中心附近的氨基酸进行了随机突变，获得了一系列活性优于野生型生长激素的突变体。
[0010]本发明公开了五种野生型生长激素突变体，分别为SEQ.1.D.N0.2氨基酸序列的第16位、第116位、第119位、第127位氨基酸单点突变，其中第16位精氨酸突变为酪氨酸、第116位天冬氨酸突变为苯丙氨酸、第119位谷氨酸突变为亮氨酸、第127位精氨酸突变为亮氨酸，和SEQ.1.D.N0.2氨基酸的第16位、第116位、第119位、第127位氨基酸四点突变，16位精氨酸突变为酪氨酸、第116位天冬氨酸突变为苯丙氨酸、第119位谷氨酸突变为亮氨酸、第127位精氨酸突变为亮氨酸。
[0011]本发明还公开了野生型生长激素突变体突变体的制备方法，包括首先野生型生长激素突变体基因的获得然后获得各种突变体基因、野生型生长激素突变体(突变体)表达载体构建、目的基因的表达和目的蛋白的纯化四个步骤，其中表达质粒为pET-32a(+)质粒，转化宿主菌为BL21 (DE3)。
[0012]得到的目的蛋白通过活性实验检测，结果表明各型突变体生物活性均优于野生型，其中四点突变体的活性约为野生型的8倍。



[0013]图lpET32a(+)质粒结构示意图。
[0014]图2携有hGH cDNA的pET32a重组质粒结构示意图。
[0015]图3Nb2细胞人生长激素依赖的增殖实验结果。

[0016]以下实施例、试验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
[0017]实施例1:野生型人生长激素(Wild Type hGH) cDNA及突变型cDNA序列的获得
[0018]检索Genbank获得人生长激素的cDNA天然序列如SEQ.1.D.N03所示。其中包括5’_端编码信号肽的序列以及3’-端终止密码后的一段非编码区。本发明 申请人:设计了利用大肠杆菌系统表达蛋白的方案，由于考虑到大肠杆菌对密码子的偏爱性，对上述的成熟肽编码区cDNA序列进行了同义突变，将在大肠杆菌中较为罕见的密码子更换为相对更为常见的同义密码子，确定如序列表中所述的野生型hGH序列。另外，我们在其5’-端加上了KpnI的酶切位点及DDDDK(EK酶识别位点)的编码序列，还在其3’ -端的tag终止密码子之后加上了 XhoI的酶切位点。后委托对上述序列进行了全合成，测序验证与理论序列完全一致，其构建的核苷酸完整序列如SEQ.1.D.NOl所示，其中，第1-6位为KpnI的酶切位点的核苷酸序列，第7-21位为EK酶切位点的核苷酸序列，第22-594位为野生型GH的核苷酸序列，第595-597位为终止密码子的核苷酸序列，第598-603位为XhoI的酶切位点的核苷酸序列；推定野生型GH的氨基酸序列如SEQ.1.D.N02所示。
[0019]人生长激素Mutantl cDNA序列的获得:
[0020]以合成的野生型hGH(含内切酶、EK酶切位点及终止密码)为模板，分别用引物I与引物4、引物3与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得Mutantl基因序列。
[0021]人生长激素Mutant2 cDNA序列的获得:
[0022]以合成的野生型hGH(含内切酶、EK酶切位点及终止密码)为模板，分别用引物I与引物6、引物5与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得Mutant2基因序列。
[0023]人生长激素Mutant3 cDNA序列的获得:
[0024]以合成的野生型hGH(含内切酶、EK酶切位点及终止密码)为模板，分别用引物I与引物8、引物7与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得Mutant3基因序列。
[0025]人生长激素Mutant4 cDNA序列的获得:
[0026]以合成的野生型hGH(含内切酶、EK酶切位点及终止密码)为模板，分别用引物I与引物10、引物9与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得Mutant4基因序列。
[0027]人生长激素Mutant5 cDNA序列的获得:
[0028]以Mutantl cDNA为模板，分别用引物I与引物6、引物5与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得中间突变体MutantA基因序列。
[0029]以MutantA cDNA为模板，分别用引物I与引物8、引物7与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得中间突变体MutantB基因序列。
[0030]以MutantB cDNA为模板，分别用引物I与引物10、引物9与引物2进行PCR，扩增产物为模板，引物I与引物2扩增，获得Mutant5基因序列。
[0031]引物I~10的核苷酸序列分别如SEQ.1.D.N04~SEQ.1.D.N013所示。
[0032]实施例2:野生型人生长激素及各突变体的获得
[0033]本发明大肠杆菌BL21(DE3)菌株、pET_32a(+)质粒，均为美国Novagen公司产品。
[0034]用KpnI和XhoI双酶切含有实施例1所述目的基因，将其插入用相同的两种酶酶切过的pET-32a(+)载体中(携有hGH eDNA的pET32a重组质粒结构示意图见图2)，质粒酶切图谱鉴定为正确后，用该质粒转化感受态BL21 (DE3)大肠杆菌，接种在LB培养基中，37 °C振荡培养，IPTG诱导表达。目标蛋白主要在细胞破碎后的上清液中，呈可溶性表达。超声碎菌后，上清经连接了 Ni2+的金属螯合柱纯化，获得以粗制hGH为主(纯度大于70%)的蛋白溶液。上述溶液加入一定量的重组牛肠激酶(rEK)(上海张江生物技术有限公司产品)，2mmo 1/L CaCl2，置21 °C孵育20小时，将N端的EK酶切位点去除，获得hGH粗制品。经分子筛层析，使样品纯度达到98%以上，获得hGH精制品。
[0035]野生人生长激素的氨基酸序列如SEQ.1.D.N0.2所示，
[0036]人生长激素Mutantl:SEQ.1.D.N0.2第16位精氨酸突变为酪氨酸
[0037]人生长激素Mutant2:SEQ.1.D.N0.2第116位天冬氨酸突变为苯丙氨酸
[0038]人生长激素Mutant3:SEQ.1.D.N0.2第119位谷氨酸突变为亮氨酸
[0039]人生长激素Mutant4:SEQ.1.D.N0.2第127位精氨酸突变为亮氨酸
[0040]人生长激素Mutant5:SEQ.1.D.N0.2的第16位、第116位、第119位、第127位氨基酸四点突变，16位精氨酸突变为酪氨酸、第116位天冬氨酸突变为苯丙氨酸、第119位谷氨酸突变为亮氨酸、第127位精氨酸突变为亮氨酸。
[0041]实验例1:Nb2细胞人生长激素依赖的增殖实验
[0042]实验器材及试剂:
[0043]细胞系:Nb2细胞，用含10%胎牛血清(FCS)的RPM1-1640培养液传代培养于25-75cm2方瓶中；
[0044] Nb2细胞培养液:为含10%胎牛血清(FCS)的RPM1-1640培养液；
[0045] rhGH生物活性检测用培养液:为含5%胎牛血清(FCS)的RPM1-1640培养液；
[0046]培养条件:37°C，5% CO2,饱和湿度；
[0047]野生型人生长激素及各突变体；
[0048]CellTiter 96 Aquetjus非同位素细胞增殖试验试剂盒(Promega公司产品，Catalog#G5430)检测细胞活力。由MTS/PMS 二种溶液组成，使用前将二者按体积比20: I混合；
[0049]酶标仪及相应波长滤光片。
[0050]实验步骤:
[0051]取对数生长期的Nb2细胞，用rhGH生物活性检测用培养液洗涤2次，计数，并用该培养液调整细胞密度至IX 105/ml备用；[0052]活性检测用培养液稀释待检测样品及标准品，至浓度为1000ng/ml，并以之为起始浓度，连续2倍比序列稀释，将稀释好的样品加入96孔细胞培养板，100 μ I/孔，设置复孔，活性检测用培养液为空白对照；
[0053]将步骤一准备好的细胞悬液加入96孔细胞培养板，100 μ I/孔；
[0054] 96孔板在孵箱中继续孵育48~72h后，加入新鲜配制的20: I混合的MTS/PMS溶液20 μ I/孔，在孵箱中继续孵育1-4小时，用酶标仪测量其Α490-Α630值；
[0055] Logistic回归:横坐标为待检测样品或对照品浓度，纵坐标为光吸收值的平均数(八490_八630)。
[0056]结果分析:
[0057]采用Logistic四参数法拟合标准曲线:横坐标(对数)为对照品或待测样品的浓度,纵坐标为(A49tl-A63tl)，回归方程的形式为:
[0058]Y= (A-B) / [ I + (X/C)D] +B
[0059]结果见图3及表1
[0060]表1
[0061]