专利名称：野生型和突变体hFⅨ毕赤酵母表达载体及构建方法和应用的制作方法凝血因子IX研究进展:凝血因子IX是凝血“瀑布反应”中重要的促凝集因子。其主要由肝实质细胞合成，以酶原的形式分泌到外周血中。当各种内外因素激活内源性凝血反应后，凝血因子IX被激活，发生一系列的凝血连锁反应，最终形成血块、血栓，从而达到止血的目的。凝血瀑布反应中内源性凝血途径由因子XII活化而启动。当血管受损，内膜下胶原纤维暴露时，可激活XII为Xlla，进而激活XI为XIa。XIa在Ca2+存在时激活IXa(活化的hFIX)，IXa再与激活的VDI a、PF3、Ca2+形成复合物进一步激活因子X。Xa与因子V、Ca2+和PF3(血小板第3因子，为血小板膜上的磷脂)共同组成凝血酶原复合物，最终启动凝血酶和纤维蛋白的形成。当某些指导凝血因子IX合成的基因发生各种突变时，凝血因子IX不能正常合成，或合成量减少，或活性下降，都会使得内源性的凝血反应受到不同程度的影响，从而导致活化的部分凝血酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)时间延长，引发一系列的凝血功能异常。这种疾病就是人类B型血友病(Hemophilia B)。人类B型血友病，又称凝血因子IX缺乏症(Factor IX Deficiency)、克里斯多式症(Christmas Disease)。它`是一组由于缺乏凝血因子IX所引起的性连锁隐性遗传性疾病，X染色体隐性遗传，因而常见于男性。导致B型血友病的发生主要是因为指导合成凝血因子IX的基因发生了插入、倒位、缺失和点突变等异常，直接的后果就是合成的凝血因子IX量减少或活性降低，或者两者兼备。根据凝血因子IX活性相当于标准活性的百分比(hFIX: C)，可以分为轻、中和重型血友病。临床上治疗重型B型血友病的方法常见的就是凝血因子IX输入替代疗法和基因治疗，由于基因治疗存在着副作用大、效果不佳的缺点，在临床应用上仍属于试验阶段，所以常用的治疗方法主要是凝血因子补充替代疗法。临床实践证明，补充所缺乏的凝血因子是控制血友病出血最有效的措施。替代疗法的原则是根据hFIX的半衰期、稳定性，以及出血严重程度、手术大小及范围，有针对性地选择合适的血液制品、剂量和给药方法。替代疗法包括输入新鲜血浆(已不常用)、冷沉淀物凝血酶原复合物(含因子IX、X、π、νπ)和基因工程生产的hFIX药物(如BenefIX)等。但是血浆和血浆提纯的凝血因子的安全性受到了很大的质疑，反复输入很容易感染HIV、HBV、HCV和梅毒等，有报道称有5%左右的血友病人因输血引起各种感染。所以应用重组凝血因子是一个很好的选择，它避免了感染的隐患，但其高昂的价格和国内重组hFIX药品短缺使得病人在用药上很不便。hFIX的编码基因位于X染色体长臂末端，大小约为10kb，转录的mRNA大小约为2500bp。hFIX主要是由肝脏实质细胞合成的，细胞合成的hFIX由461个氨基酸残基组成，血液中游离的hFIX由不带信号肽片段的415个氨基酸残基组成。hFIX是单链糖蛋白，含有约17%的糖基化修饰，分子大小根据糖基化程度不同为55-75kD。当发生内源性凝血时，其转化为活化的hFIX (hFIX a)。hFIX a由一个轻链和一个重链组成，具有丝氨酸蛋白酶活性。血液中凝血因子IX的正常浓度为3-5mg/L。从已有的资料看，大部分报道的hFIX突变都会引起其活性的降低，从而罹患B型血友病。点突变也是B型血友病遗传学上的病理机制之一。但是，也有报道某些氨基酸的改变会增强其凝血活性。例如在轻链Gla区域的第86氨基酸V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸)时，特异性凝血活性会增高至原来的2倍，原因可能是由于加强了和活化态凝血因子IX的结合的能力；在轻链EGF-2区域的V107突变为A时，和活化态凝血因子VDI的结合能力是野生型的36倍左右，因此怀疑能提高凝血因子IX的活性。因此，我们选择了这两个突变位点对hFIX进行突变研究。毕赤酵母表达载体研究进展:目前可以表达重组蛋白的成熟的蛋 白表达系统主要有巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)蛋白表达系统、中华仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)蛋白表达系统和昆虫细胞蛋白表达系统等，但是都有各自的优缺点。Pichia.pastoris基因表达系统经过近二十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中。作为真核生物，毕赤酵母具有闻等真核表达系统的许多优点:如蛋白加工、折置、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。目前已经有300多种外源蛋白在Pichia.pastoris基因表达系统得到有效表达，其中已高效表达了 HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，被认为是目前最有效的酵母表达系统。研究中所应用的野生型hFIX毕赤酵母表达载体pPIC9K_hFIX分子量较大，有IOOOObp,以现在的点突变技术，没有一种Pfu和Taq酶可以完成延伸如此大的质粒，因而我们同时构建了 pPICZ A-hFIX进行点突变。pPICZ A载体也是一种分泌型毕赤酵母表达载体，它只有3600bp，加上目的片段后也只有6000bp左右，现在的Fast-Pfu酶可以准确的扩增8000bp以下的片段，故突变技术上比较成熟；再者pPICZ A的酵母信号肽a -factor部分含有Xho I位点，同时下游也有Not I位点，正好可以连入从pPIC9K-hFIX切下的目的基因；最后，pPICZ A载体有Zeocin抗性位点,可以很容易用Zeocin进行筛选,并可利用Zeocin浓度不同，筛选出多拷贝转化子。本部分多个点突变采用单点突变累积法，即将测序验证的，突变成功的质粒再次进行其他位点的突变，这样一步步达到累积突变的目的。毕赤酵母中试工艺研究进展:毕赤酵母发酵产物的累积不会对自身产生毒副作用，且毕赤酵母的表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，不影响外源基因的表达水平。这注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力。中试工艺是连接研发和生产的一个重要台阶，是科技成果向生产力转化的一个重要环节。多年来，中试在我国并未得到足够的重视，“中试空白”现象比较严重。然而，成果产业化的成败主要取决于中试的成败,科技成果经过中试,产业化成功率可达80%，而未经过中试产业化成功率只有30%，只有通过了中试才能进行量产，可见中试工艺的重要性。毕赤酵母是近十年比较流行的新的高效表达系统。目前，用该系统成功表达的外源基因到2000年己有220种，其中大部分为医药制品，如重组人白介素6、鲤鱼生长激素、硫氧还蛋白、血小板生成素、人白细胞介素11等。但是利用毕赤酵母表达不同的外源蛋白其表达水平相差很大，高的达到12g/L，最低的只有lmg/L的水平，相差可达10000倍，这种外源蛋白表达的差异，一方面是外源基因本身的特性引起的:另一方面，发酵条件也对表达量起了极其重要的作用。在进行小量表达时，常用摇瓶培养，由于培养液的酸碱度无法控制，发酵系统的通气不足及碳氮最适添加量均无法控制，影响了外源基因的真正表达水平，如用发酵罐培养，外源蛋白的表达水平可以比普通摇瓶高10 100倍(Wood andKomives, 1999)。传统发酵工业中，常需要采用高密度发酵的策略来提高生产能力。发酵生产中主要采用的策略有:分批发酵、连续发酵和补料发酵，分批发酵操作比较简单，发酵周期短，已经广泛应用于重组蛋白的生产。然而分批发酵过程有明显的局限性，一般不能得到高密度的培养物。连续培养的生产效率要比分批发酵要高得多，适合于长周期的生产，也可实现高密度发酵，但相对操作比较复杂、容易染菌，且长时间培养过程中，微生物容易发生变异，若采用重组 微生物，则质粒的稳定险也很难保证，这也限制了连续发酵在工业中的应用。补料发酵技术己成功应用于青霉素、维生素、氨基酸及酶的发酵生产中，补料发酵过程中关键是补料工艺的控制，补料工艺是微生物控制代谢、提高产量的一个灵活而有效的手段。当然，应该根据菌种或培养条件来确定最适的补料种类、补料量及补料方式。到目前为止，已经发展了各种发酵过程中的补料策略，如:为了避免发酵过程中乙酸的积累，把溶氧控制在某一个水平；为了得到比较高的比生长速率，可以采用指数补料策略；为了得到较高的细胞浓度，可把比生长速率控制在预先设定的某个水平；为了保证重组微生物中质粒的稳定性，把发酵液中葡萄糖的浓度控制在一个较低的水平或间隙的让发酵液中的细胞处于葡萄糖饥饿状态，从而减小微生物的比生长速率。然而，由于不同的微生物的发酵有不同的特点，例如在面包酵母培养时以获得最多的物量为目标，而在重组微生物中的发酵过程中要表达出目标蛋白、并防止宿主细胞中质粒丢失现象等。因此，并非在一种微生物发酵中取得成功的控制策略在另一种微生物的发酵中也适用。一些学者在研究微生物发酵过程中对以上的方法进行了一些尝试和改进，同时也发展了一些新的补料控制。目前常用的补料策略有线性补料、变速补料、指数补料及反馈控制。根据碳氮源的吸收或需求来确定补料速率、恒PH流加、恒溶氧流加及通过神经元和模糊理论来控制微生物的补料发酵等。2004年Chang-ChiChen等对毕赤酵母工程菌KM71-76在SL发酵罐中发酵进行研究，对培养基进行改良，生长阶段为2L的BMGY (含4%的甘油)，控制温度在300C，pH值为6.0，搅拌速度为800r/min，通气量为2_3丽1，当溶氧突然快速上升时，批培养阶段结束，收集细胞，重新将细胞悬于含0.5% (v/v)甲醇的2L新鲜BMMHY中，然后无菌操作返回发酵罐进行诱导产酶，釆用甲醇电极MC-168将甲醇浓度控制在0.5，植酸酶活力最高达到4946U/mLo2005年李洪森根据摇瓶发酵的优化结果对产植酸酶工程菌进行了在IOL发酵罐高密度发酵条件进行了试验。以种龄为16h的种子，按3%的接种量接种，生长阶段最适pH为5.5,诱导阶段最适pH为6.5,溶氧控制在30% 40%,甲醇的诱导浓度为10g/L。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优，最高菌体浓度0D600达到70，最高酶活达到2.63X 105U/mL。2006年何锡呆，彭远义等对植酸酶基因工程菌(E-22)在SL发酵罐中发酵产植酸酶条件作了初步研究。研究结果表明，接种36h，接种量10%，增菌时间72h，发酵液pH6.0装液量10%，进行了不补料、补料、间隙流加甲醇、恒速流加甲醇的发酵实验，结果表明间隙补料并恒速流加甲醇产酶效果好，最高酶活可达235290U/mL。目前，对于高密度表达植酸酶的工艺研究主要集中在摇瓶水平上，然后在摇瓶的基础上，在发酵罐中进行放大培养，但在发酵罐水平上关于发酵工艺的详细报道比较少。由于摇瓶和发酵罐培养条件的差别很大，在摇瓶培养中毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确反映其在发酵罐中的真实情况，我们最关注的还是发酵罐中的表达情况。摇瓶层次上得到的最佳培养条件只是为发酵罐相应参数提供了一些参考数据。因此在实际的生产过程中，在摇瓶的基础上，要经过几次发酵罐的连续放大，并且每次都要经过仔细的发酵工艺研究，同时发酵工艺还应根据下游纯化的需要以及生产总成本的控制加以改进，是能真正的应用于大规模的生产。因此，发酵罐的工艺研究是非常重要的。
本发明的目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX和hFIX高活性突变体在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体，带有非常强且收严格调控的启动子，直接有酵母-信号肽诱导高分泌，所表达蛋白的分子量大小适于酵母发酵，效能高，产业化潜能大，所得到的表达蛋白活性远远高于普通人体血清提取产品。本发明的另一个目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX(hFIX)和三种种hFIX高活性突变体在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体的构建方法，涉及的技术都是目前分子生物学领域常用的操作简单，所用的材料市售均可获得，采用非常普通的培养技术就可以进行后续发酵研究。本发明的再一个目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体PPIC9K-hFIX在中试发酵工艺中的应用，采用非常简单的培养技术就能得到很高的生物量，具有很高的分泌能力，以及接近于高等真核生物的翻译后产物加工和糖基化。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:一种野生型和几种突变体hFIX在酵母中表达载体的构建方法，包括下列步骤:A、hFIXcDNA的克隆及克隆载体pTG19_hFIX的构建:从人肝脏组织(来源于一交通意外健康人肝破裂部分切除者)中提取细胞总RNA，根据GENEBANK中hFIX基因序列，设计克隆人野生型hFIX的全长序列的引物pOls和pOla (请见下表序列)，经测序后证实序列正确的克隆；利用TA克隆的方法(《分子克隆实验手册》(第三版)J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京:科学出版社)，以T4连接酶连接至pTG19-T载体(购自Invitrogen)中；经IPTG-X-Gal-Amp-LB培养板筛选出典型白色菌落，提取质粒DNA，比对序列，筛选出包含完全正确的野生型hFIX序列的连接产物pTG19-hFIX质粒。B、pPIC9K-hFIX的构建:设计克隆hFIX不带信号肽序列的引物p06s和p05a(请见下表序列)，两端加入Xho I和Not I限制性内切酶识别序列，以上述TA克隆载体pTG19-hFIX为模板，PCR亚克隆出1330bp的hFIX cDNA片段，经Xho I和Not I双酶切，同时PPIC9K载体(购自InvitiOgen)也经同样的双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，纯化目的基因和载体并测序鉴定；以T4连接酶连接序列正确的目的基因hFIX和载体PPIC9K，经转入大肠杆菌DH5(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)中。提取质粒，用P07s (请见下表引物序列)和P07a(请见下表引物序列)引物进行PCR验证，再用可以克隆全长hFIX的5AOXs和3A0Xa引物(请见下表引物序列)进行筛选后基因组测序，比对目标序列，得到序列为SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，筛选出完全正确的菌(表达质粒pPIC9K-hFIX)进行保种。C、pPICZ A-hFIX 的构建:将 pPIC9K_hFIX 和 pPICZ A 载体(购自 Invitrogen)同时以Xho I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带(pPIC9K-hFIX的1330bp和pPICZ A 3600bp)，纯化目的基因和载体并测定含量；以T4连接酶连接后，用P06s(下表请见序列)和P05a (请见下表序列)引物进行PCR验证，证明可以得到目的条带；然后进行转化，用XhoI和Not I进行双酶切验证，证明可以得到目的条带(1330bp)和载体(5400bp)，pPICZ A-hFIX质粒即构建成功。提取质粒测序，得到完全正确的，得到序列为SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列，所得质粒为不含信号肽的hFIXcDNA序列的pPICZ A-hFIX质粒。D、突变质粒的构建(包括 pPICZ A-hFIX-V86A、pPICZ A_hFIX_V107A 和 pPICZA-hFIX-V86A-V107A，这些突变体的特征在于将hFIX-蛋白质相应位点的缬氨酸V分别或同时点突变为丙氨酸A):按照基因定点突变的引物设计原则，设计两个突变位点的两条互补引物(两对突变引物V86A1和V86A2、V107A1和V107A2序列请见下表)，以上述pPICZA-hFIX为模板，利用高保真DNA聚合酶，合成相应突变的hFIX序列，然后以DpnI酶切反应去除未突变的模板,依次构建出pPICZ A-hFIX-V86A、pPICZ A_hFIX_V107A和pPICZA-hFIX-V86A-V107A三种突变质`粒，将突变产物纯化后转化至感受态细胞中，将转化克隆进行酶切鉴定，取鉴定大小相符的克隆测序，经测序证实得到序列为SEQ ID NO:15,NO:16和NO:17所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQ IDNO:16所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQID NO:17所示的核苷酸序列，筛选与预期序列完全相符的克隆大量扩增，提取质粒保存。(V86A:hFIX蛋白第86号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A ；V107A:hFIX蛋白第107号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A ;V87A-V107A:hFIX蛋白第86号和第107号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A。)E、野生型和突变体hFIX在毕赤酵母表达中的表达和凝血活性的检测:活化毕赤酵母，并制备酵母感受态；利用电击仪将pPICZ A-hFIX及其突变体载体转入巴斯德毕赤酵母SMDl 168中(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，用YPD-Zeocin平板进行筛选，选取轮廓清晰的三个典型单菌落接种到含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，280rpm30°C培养12-14小时，保种和基因组PCR鉴定，以SDS-PAGE和Western Blotting检测确定hFIX及其突变体蛋白的表达，筛选出表达量最高的菌株，扩大培养，诱导表达，收集表达产物，并测定蛋白，经测序证实得到序列为SEQ ID NO:18,NO: 19和NO:20所示的核苷酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。利用纠正缺hFIX血浆的凝血时间的方法，进行蛋白活性的测定，测得毕赤酵母高活性的野生型hFIX和突变体蛋白hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A的凝血活性依次为:5.69%,5.71%,38.93%。F、一种野生型人凝血因子IX(pPIC9K_hFIX)在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体的在中试发酵工艺中的应用，其应用过程是:毕赤酵母表达野生型和突变体hFIX的中试发酵工艺:以毕赤酵母菌hFIX野生株完成了 hFIX的50L发酵罐的中试生产，并建立了一条成熟的中试生产工艺线路。摇瓶种子培养基YPD，发酵培养基BMGY和BMMY，在接种前先加入28 %的氨水使该培养基的pH值维持在5.5左右。培养条件:菌种复苏后置于YH)液体培养基中28°C活化培养24h，涂布于YPD平板(含G418)，28°C培养72h，挑取单菌落置于BMGY培养基中250rpm震荡培养24h，至0D600 ^ 10时作为种子液，准备上罐接种。使用50L发酵罐优化发酵条件，采用甲醇诱导批式发酵，摸索出其最佳发酵条件，大量制备和纯化hFIX，实现了中试发酵的新工艺，并用于凝血活性的研究。结果表明，发酵开始后13h，菌体湿重缓慢增加，处于适应期；之后，菌体开始快速生长进入指数生长期，至发酵24h时，发酵液开始检测到凝血活性，随着发酵时间的延长，凝血活性增强，48h后，hFIX蛋白的表达开始进入平台期，凝血活性增长缓慢，至72h，凝血活性达到最大，停止发酵，收获培养上清。经甲醇诱导可分泌大量的具有凝血活性的hFIX蛋白，在发酵液pH值5.5的条件下，甲醇诱导72小时放罐较为适宜，其产量可达到558mg/L，约为摇瓶表达量的4倍。中试发酵3批，菌体A600均值达(427.23±32.16)，hFIX表达量均值为(558.00±27.57)mg/L。在菌体的对数期和稳定期hFIX蛋白大量表达，菌体湿重达到438g/L，IOOh后，毕赤酵母进入衰退期，蛋白表达基本停止，菌体湿重下降明显，蛋白含量基本不变。至124h发酵停止，测得发酵液上清中蛋白含量达到168g/L。纯化后蛋白经反相液相色谱鉴定纯化产物纯度为> 91%。取分离纯化后的样品100μ I检测发酵上清的凝血活性，测得凝血活性为10.12，较摇瓶发酵产品增长I倍。野生型hFIX质粒pPIC9K_hFIX构建发明中用到的引物序列为:

本发明公开了一种野生型和三种突变体hFⅨ在毕赤酵母中的表达载体的构建方法及应用，其步骤根据Genebank提供的基因序列，用RT-PCR技术从健康人肝脏中克隆出hFⅨ全长cDNA序列，构建用于毕赤酵母表达的融合了酵母α-factor信号肽和全长hFⅨ序列的酵母表达质粒pPIC9K-hFⅨ，将该质粒转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌株。继而构建酵母表达质粒pPICZA-hFⅨ，在此基础上设计并构建三种酵母菌hFⅨ高活性突变体，电转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌突变株。得到的各种hFⅨ酵母表达载体凝血活性均高于标准hFⅨ。野生型hFIX(pPIC9K-hFⅨ)经50L中试发酵研究，蛋白纯化产物分泌表达量最高可达558mg/L，纯度和凝血活性均较高。