专利名称：抗原性改变的肠毒素c2突变体及编码基因与制备和应用的制作方法超抗原(superantigen, SAg)是一组由细菌或病毒编码的，并在极低浓度下对T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子。与传统抗原不同，超抗原不需要抗原递呈细胞的递呈作用，在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC 11(组织相容性复合物)分子和T 细胞V P区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，进而导致在体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物，用于肿瘤疾病的临床治疗。金黄色葡萄球菌肠毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一类典型的细菌超抗原。由于其极强的T细胞激活功能，近年来受到人们的广泛关注。但是作为一种异源毒素蛋白，野生型SEC2在刺激肌体免疫系统的同时，也诱导B细胞产生大量抗体，这些抗体可特异性的识别并结合于野生型SEC2的抗原表位，使其被血清抗体中合，从而导致其体内刺激激活T淋巴细胞的能力大大降低，因此影响了其临床治疗效果。
本发明就是针对上述问题，提供了一种抗原性改变的肠毒素C2突变体及编码基因与制备和应用。为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，肠毒素C2突变体具有序列表SEQ ID NO 3中的氨基酸序列。肠毒素C2突变体的编码基因具有序列表SEQ ID NO : I中的碱基序列。肠毒素C2突变体的制备方法为，I)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F 5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2_R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 扩增出SEC2全基因sec2 ；2)在此基础上，以sec2为模板，采用引物对sec2_F和R-Mutant :5’ -CATCATATAATACTTTCGTATTACCCATCG-3’；引物对 sec2_R 和 F-Mutant :5’-GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’分别扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2-F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQ ID NO 1中碱基序列的SEC2(Y26V)突变基因；3)将以上突变基因SEC2(Y26V)克隆于表达载体pET_28a，并转化大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌，构建成异源表达抗原表位改变的肠毒素C2突变体的基因工程菌，经IPTG诱导表达并纯化制得相应抗原表位改变的肠毒素C2突变体纯品。基因片断的PCR反应体系为50iil :10XPfu DNA聚合酶反应缓冲液5 ill、dNTP4uL、上下游引物各lOpmol、模板25ng、Pfu DNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至50 yl。基因片段的PCR反应条件为第一阶段95°C，5分钟；第二阶段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30个循环；第三阶段72°C，10分钟。步骤3)中采用Ni亲合层析柱对目的产物进行纯化，纯化时以0. 5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲合层析柱；以含40mM咪唑的平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液洗脱下目的产物，并对洗脱产物经透析法除盐浓缩。所述的洗脱缓冲液的组成为20mM Tirs-HCl, 0. 5M NaCl，250mM咪唑，溶液的pH=7. 9。所述的肠毒素C2突变体可作为抗肿瘤或免疫调节药物的活性成份。 所述的肠毒素C2突变体具有良好的免疫刺激活性和肿瘤抑制活性，应用于抗肿瘤或免疫调节药物中，其抗原表位较野生型有显著改变，可有效规避人体内野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性抗体的识别和结合，减少体内血清清除反应。本发明的有益效果I.本发明为人工构建的编码抗原表位改变的肠毒素C2突变体的核苷酸序列，获知其基因全序列的组成。2.本发明利用基因工程技术，突变构建了编码抗原表位改变的肠毒素C2突变体的核苷酸基因，并在大肠杆菌中高效表达，获得的抗原表位改变的肠毒素C2突变体经检验具有较好的超抗原活性和较高的肿瘤抑制活性。3.本发明获得的抗原表位改变的肠毒素C2突变体较野生型肠毒素C2相比，其抗原表位有显著差异，其对野生型肠毒素C2特异性抗体的亲合能力有显著下降，因此可以避免长期使用野生型肠毒素C2患者体内抗体的中合作用和血清清除效应，更具有肿瘤临床治疗的前景。图I为本发明中编码抗原表位改变的肠毒素C2突变体基因的PCR产物核酸电泳图谱(其中M代表DL2000 marker ; I代表具有序列表SEQ ID NO : I中碱基序列的突变基因的 PCR 产物 SEC2 (Y26V)。图2为本发明中抗原表位改变的肠毒素C2突变体纯品的电泳图谱(其中M代表蛋白marker ；1代表具有序列表SEQ ID NO 1中碱基序列的突变体SEC2(Y26V))。图3为本发明中抗原表位改变的肠毒素C2突变体纯品的超抗原活性检测实验结果图(横坐标为剂量梯度；纵坐标为增值指数)。图4为本发明中抗原表位改变的肠毒素C2突变体纯品的体外抑制Hepal-6肿瘤细胞生长能力的检测结果图(其中横坐标为突变体的剂量梯度；纵坐标为抑瘤率)。图5为本发明中抗原表位改变的肠毒素C2突变体体外对野生型SEC2特异性抗体的亲合能力检测结果图(其中横坐标为蛋白浓度；纵坐标为吸光度)图6为本发明抗原表位改变的肠毒素C2突变体SEC2 (Y26V)的三维结构示意图。实施例I具有序列表SEQID NO 1碱基序列的一种抗原表位改变的肠毒素C2突变体的编码基因序列(参见序列表)001GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAATATGAAAGTATT081ATATGATGATCATTATGTATCAGCAACTAAAGTTATGTCT121GTAGATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTAIAACATTA161GTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGA201GTTATTAAATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAA241GTAGTTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAACTGCT281ATTTTTCATCCAAAGATAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGG321TAAAACTTGTATGTATGGAGGAATAACAAAACATGAAGGA361AACCACTTTGATAATGGGAACTTACAAAATGTACTTAIAA401GAGTTTATGAAAATAAAAGAAACACAATTTCTTTTGAAGT441GCAAACTGATAAGAAAAGTGTAACAGCTCAAGAACTAGAC481ATAAAAGCTAGGAATTTTTTAATTAATAAAAAAAATTTGT521ATGAGTTTAACAGTTCACCATATGAAACAGGATATATAAA561ATTTATTGAAAATAACGGCAATACTTTTTGGTATGATATG601ATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACCAATCTAAATATT641TAATGATGTACAACGACAATAAAACGGTTGATTCTAAAAG681TGTGAAGAIAGAAGTCCACCTTACAACAAAGAATGGA(a)序列特征*长度717碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有序列表SEQID NO 3氨基酸序列的一种抗原表位改变的肠毒素C2突变体序列(参见序列表)001ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKVLYDDHYVSATKVMS041VDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDE081VVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEG121NHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELD161IKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFffYDM20IMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNGSEQ ID NO. 3的信息(参见序列表)
(a)序列特征*长度239个氨基酸*类型肽链*链型单链(b)分子类型成熟肽链(C)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)实施例2一种抗原表位改变的肠毒素C2突变体的制备方法①金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养，取I. 5ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA (基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R. E.金斯顿，D. D.穆尔，J. G塞德曼，J. A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。②PCR引物设计及反应条件分别设计合成PCR引物序列如下sec2-F:5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’sec2-R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3，F-Mutant :5’ -GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’R-Mutant :5，-CATCATATAATACTITCGTATTACCCATCG-3，；所有引物均由 invitrogen生物技术公司合成。以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用特异性PCR引物sec2-F和sec2-R扩增出具有列表SEQ ID NO. 2碱基序列的SEC2全基因sec2 ；SEC2全基因的制备，具有SEQ ID NO 2所示的序列SEQ ID NO. 2的信息(参见序列表)001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATA TGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAA AGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATT TATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAG TGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTA CAAAGATGAA 241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTAT GTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTAGGTAAAG TTACAGGTGG321TAAAACTTGT ATGTATGGAG GAATAACAAA ACATGAAGGA361AACCACTTTG ATAATGGGAA CTTACAAAAT GTACTTATAA401GAGTTTATGA AAATAAAAGA AACACAATTT CTTTTGAAGT441GCAAACTGAT AAGAAAAGTG TAACAGCTCA AGAACTAGAC481ATAAAAGCTA GGAATTTTTT AATTAATAAA AAAAATTTGT
521ATGAGTTTAA CAGTTCACCA TATGAAACAG GATATATAAA561ATTTATTGAA AATAACGGCA ATACTTTTTG GTATGATATG601ATGCCTGCAC CAGGCGATAA GTTTGACCAA TCTAAATATT641TAATGATGTA CAACGACAAT AAAACGGTTG ATTCTAAAAG681TGTGAAGATA GAAGTCCACC TTACAACAAA GAATGGA(a)序列特征*长度717碱基对
*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在此基础上，以SEC2全基因sec2为模板，采用引物sec2_F :5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 R-Mutant :5’ -CATCATATAATACTTTCGTATTACCCATCG-3’ ；采用引物 sec2-R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCAITCITTGTTG-3’ 和 F-Mutant :5’ -GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’分别扩增获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物，然后以sec2_F和sec2-R为引物，采用上述获得突变位点上游和下游的重叠PCR产物为模板进行PCR扩增扩得具有序列表SEQID NO 1中碱基序列SEC2(Y26V)突变基因；各基因片断的PCR反应体系均为50iU :10XPfu DNA聚合酶反应缓冲液5 ill、dNTP 4uL、上下游引物各lOpmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA25ng、Pfu DNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至50 ii I。基因片段的PCR反应条件为第一阶段95°C，5分钟；第二阶段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30个循环；第三阶段72°C，10分钟；③抗原表位改变的肠毒素C2突变体编码基因的鉴定片断PCR扩增产物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见图I)，分别切下大小为717bp的基因片段，按博大泰克生物技术公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；抗原表位改变的肠毒素C2突变体表达载体的构建以上SEC2(Y26V)的PCR回收产物经EcoRI、XhoI双酶切，再行胶回收，以T4DNA连接酶连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28a-SEC2 (Y26V) -SEQID NO 1转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R. E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40),筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列(DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。抗原表位改变的肠毒素C2突变体的表达及纯化接种测序结果正确的BL21(DE3)克隆于含50 y g/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1% (V/V)接种量转接下一级，37°C摇床培养至0D_为0. 5，加入终浓度I. OmmoI/L的IPTG(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)，30°C诱导表达4小时。
离心收集菌体，并将收集的菌体重悬于1/5体积的平衡缓冲液(IOmMTirs-HCl，0. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 9)，常规超声波破碎菌体，过滤除沉淀，采用Ni亲合层析柱对各目的产物进行纯化，即获得具有序列表SEQ ID NO :3中氨基酸序列的抗原表位改变的肠毒素C2突变体；纯化时以0. 5ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲合层析柱；以含40mM咪唑的平衡缓冲液洗涤10个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；最后以洗脱缓冲液(20mMTirs-HCl, 0. 5M NaCl，250mM咪唑，pH7. 9)洗脱下目的产物，并对洗脱产物经透析法除盐浓缩。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小及纯度(参见图2，如图所示，大肠杆菌BL21(DE3)重组表达菌株经过IPTG诱导，并经Ni-亲合层析柱纯化后，获得了高纯度的突变体，能够满足进一步的实验需要)。
实施例3抗原表位改变的肠毒素C2突变体的超抗原活性检测取SPF级纯系小鼠Balb/c，通过颈椎处死后在无菌条件下取其脾脏，轻轻压碎后过200目筛网。然后将过筛网后的细胞悬液在1000rpm/min转速下离心5min收集细胞沉淀，用5mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后于1000rpm/min离心5min。再以不含血清的1640培养基(购自Gibco公司)清洗细胞1-2次，最后用含10% (体积百分比)小牛血清的RPMI-1640培养液(购自Gibco公司)调节细胞浓度，以8X IO5Cells/孔加到96孔板中。将经纯化的突变体以10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml的终浓度加入各孔，每个浓度设3个复孔，SEC2野生蛋白作为阳性对照。培养72h后，加入25ul/孔的MTT液(购自Sigma公司)。继续培养4h，1500r/min离心5分钟后弃上清培养液，收集细胞，加入浓度为120ul/well的二甲基亚砜溶液(DMSO)，溶解15min后，通过酶标仪以测定波长570nm、参比波长630nm条件下测吸光值。最后以增殖指数(Proliferation Index, PI)表示增值能力，PI =实验组吸光值/阴性对照组吸光值(参见图3，突变体在不同浓度范围均能够有效地刺激小鼠T细胞增殖)。实施例4抗原表位改变的肠毒素C2突变体的抗肿瘤活性检测将小鼠肝癌细胞H印al-6传代培养后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含含10%(体积百分比)小牛血清的1640培养基稀释成浓度为5X IO5ceIlsAiL的单细胞悬液，然后以2. 5X IO4Cells/孔培养在96孔板。将按实施例3中方法分离获得的小鼠脾淋巴细胞以5X105cells/well加入到上述含有H印al-6细胞的96孔板中，使效靶比达到20 I。然后将纯化的突变体分别以10、100、1000ng/mL的终浓度加入各孔。以牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照，SEC2野生蛋白作为阳性对照，并设肿瘤细胞对照孔、淋巴细胞自然释放孔、空白对照孔及调零孔，每个浓度设3个复孔，按常规条件培养72h，加入25ul/Well的MTT液。继续培养4h，1000r/min离心收集细胞，加入DMS0120ul/well，溶解15min后，在酶标仪上以测定波长570nm，参比波长630nm测定各孔的吸光值。肿瘤抑制率计算公式如下100-[(蛋白实验孔吸光值-淋巴细胞自然释放孔吸光值)/ (肿瘤细胞对照孔吸光值-空白对照孔吸光值)]X 100% (参见图4，突变体均对Hepal-6细胞具有一定体外抑制能力)。实施例5抗原表位改变的肠毒素C2突变体的抗原表位分析
该分析中所使用的抗体均由中国药品生物制品检定所提供。将野生型肠毒素C2和抗原表位改变的肠毒素C2突变体以含20 % (体积百分比)吐温80的PBS缓冲液(PBS-T20)分别稀释成25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml后加入到事先包被有抗野生型肠毒素C2抗体的96孔板中(100 ill每孔)。37°C培养2小时后去除培养孔中的液体并用PBS-T20清洗各孔。向各孔中加入100 ill抗SEC2酶联抗体继续37°C培养I. 5小时，除去各孔中的液体并用PBS-T20清洗，向各反应孔中加入100 ill邻苯二胺37°C培养0. 5小时，再向各反应孔中加入50 u I 2mol/L的H2SO4终止反应并在450nm波长下测定各孔的吸光值(参见图5，突变体对野生型SEC2抗体的识别结合能力显著下降，说明其抗原表位显著改变)。实施例6抗原表位改变的肠毒素C2突变体的分子三维结构分析 经过Ni亲和层析纯化的系列SEC2突变体纯品SEC2 (Y26V)，经分子排阻和离子交换法再次纯化并超滤浓缩(方法参考分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。在室温下通过悬滴法获得突变体的晶体。以稀疏矩阵采样法确定结晶条件。最终的结晶条件如下SEC2(Y26V)蛋白溶液(20mg/ml)和等体积的母液(0. IMTris-HCKpH 7. 4)，0. 08M醋酸镁，26% (w/v)聚乙二醇6000)混合，约15-18天时出现晶体。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum_4R C⑶探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView4. 0软件在Silicon Graphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。突变体SEC2(Y26V)的三维结构参见图6，结果显示，该突变体结构整体上为椭圆体蛋白分子，包含两个相对独特的结构域，N端结构域主要为P卷筒结构，C端结构域主要为P发夹结构。整体分子的二级结构主要由a-螺旋和￠-折叠组成。


抗原性改变的肠毒素C2突变体及编码基因与制备和应用涉及基因工程技术领域，更具体的说，是涉及一种具有药用前景的抗原性改变的肠毒素C2突变体及编码基因与制备和应用。本发明提供了一种抗原性改变的肠毒素C2突变体及编码基因与制备和应用。抗原性改变的肠毒素C2突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示；肠毒素C2突变体的编码基因的碱基序列如序列表SEQ IDNO1所示。