专利名称：玉米耐旱种质鉴定和筛选caps标记及其检测方法和应用的制作方法玉米目前已成为世界和我国播种面积最大的禾谷类作物。随着全球畜牧业迅速发展和应用玉米加工液体燃料こ醇エ业的迅速攀升，对玉米的需求量大幅度増加。然而，全球性气候变化引发干旱发生周期越来越短，程度越来越重，对粮食生产构成严重威胁。据统计，毎年因干旱造成玉米减产约20% 30%，干旱已成为玉米产量的重要限制因素(苏治军等，2010)。尽管传统育种技术在作物遗传改良方面取得了显著成就，但由于其选择效率较 低、周期较长，已不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。利用基因组学和生物信息学的最新研究成果，开展玉米分子标记育种研究，构建实用、经济、高效的分子育种技术体系，选育高产优质多抗玉米新品种，已经成为玉米育种的重要研究方向(李建生等，2007)。耐旱性是ー个非常复杂的数量性状。分子数量遗传学的发展促进了分子标记的更新和高密度遗传连锁图谱的构建，发掘出大量与数量性状相关的QTUQuantitative TraitLoci),同时也促进了 MAS (Marker-assisted selection)在数量性状选择上的应用。MAS是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技木，可以使育种家无需测定表型就能够追踪调控耐旱性状的遗传位点，可免去多年多点的大量田间测试工作，提高选择效率。Bernier等(2009)指出QTL效应在不同的群体和环境中缺乏重复性是限制了 QTL在MAS上应用的两个重要因素。此外，验证耐旱基因和在基因内开发有效的标记十分困难。因此，一方面利用一致性耐旱QTL及其潜在的基因是解决辅助育种ー种有效途径(Hao et al.，2010)。另ー方面使用功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来功能标记将更有效地固定群体中的优异等位基因，并由此开发的功能标记将在育种中有助于对不同背景遗传材料的性状选择(Hao et al.，2011)。酶切扩增多态性序列(CleavedAmplifiedPolymorphic Sequences, CAPS)又称为RFLP-PCR技术，是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物，将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的ー种技木，即属于以PCR为基础的共显性的分子标记。它的基本原理是先用已知位点的DNA序列去设计ー套特异性的PCR引物(19 27bp)。然后应用这些引物去扩增该位点上的某一 DNA片段；接着用一种专ー性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。与以杂交为基础的RFLP相比，它具有如下优点(I)引物与限制酶组合非常多，増加了掲示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖凝胶电泳分析；(2)在真核生物中，CAPS标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基因型；(3)所需DNA量少；(4)结果稳定可靠；(5)操作快捷、自动化程度高。CAPS标记技术因具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低、所需DNA样品量少和对DNA的纯度要求不高等优点，因此受到了科研人员的重视。目前已成为现代生物学研究的ー个非常重要的分子标记技术，在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。
为了解决上述问题，本发明的目的在于筛选出玉米耐旱种质鉴定和筛选的CAPSo本发明的另ー目的在于提供上述分子标记的检测方法。本发明的还一目的在于提供上述分子标记在耐旱基因检测以及标记辅助育种中的应用。为了实现本发明目的，本发明提供了一种玉米耐旱种质鉴定的分子标记，所述分 子标记包括dhnC397和rspC1090，所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如SEQ. ID Nol所示，所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ. ID No2所示。dhnC397和rspC1090两个标记是基于玉米耐旱基因dhnl和rsp41基因多态性基序开发的。其中，dhnC397是基于dhnl基因中G/A碱基突变而开发的ー种功能性分子标记。根据dhnl基因序列信息设计特异性引物，扩增出一段长度为164bp的片段。图I中，在基因序列397位点处发生了 G与A的变异(CCAAGG/CCAAAG)，限制性内切酶StyI可以识别CCAAGG。PCR产物经StyI酶切后，含有G位点的目的片段被酶切成131bp和33bp的两个片段，而含有A位点的目的片段由于缺少StyI酶切识别位点，因此不能被酶切。其中，rspC1090是基于rsp41基因中G/A碱基突变而开发的ー种功能性分子标记。根据rsp41基因序列信息设计特异性引物，扩增出一段长度为286bp的片段。图2中，在基因序列1090位点处发生了 G与A的变异(CCGG/CCAG)，限制性内切酶HpaII可以识别CCGG位点。PCR产物经HpaII酶切后，含有G位点的目的片段被酶切成225bp和61bp的两个片段，而还有A位点的目的片段由于缺少HpaII酶切识别位点，因此不能被酶切。本发明还提供了扩增上述述分子标记的引物。所述dhnC397的引物序列如SEQ. ID No3和SEQ. ID No4所示，所述rspC1090的引物序列如SEQ. ID No5和SEQ. ID No6所示。本发明还提供了含有所述分子标记的载体。所述载体为植物、组织或细胞等。ー种利用分子标记进行玉米耐旱种质鉴定和筛选的检测方法，该方法所用的分子标记为 dhnC397 和 rspC1090。具体的，上述检测方法的步骤为利用所述分子标记的引物扩增目标植物基因组DNA，得到该分子标记在目标植物中的特征谱带，所述携带目标等位基因型的植株谱带所测得的核苷酸序列为所述的分子标记的核苷酸序列。所述植物优选为玉米，所述目标植物基因组DNA优选为耐旱和不耐旱玉米基因组DNA。优选的，上述检测方法的步骤为利用上述分子标记的引物扩增耐旱和不耐旱基因组DNA，得到该分子标记在玉米中的特征谱带，该特征谱带分为耐旱优异等位基因型的植株谱带和不耐旱等位基因型的植株谱带，所述携带耐旱优异等位基因型的植株谱带所得到的核苷酸序列为上述的分子标记的分子标记的核苷酸序列。上述方法中，PCR反应扩增体系为20ii L 反应体系包括正、反向引物各 0. 5iiM，0. 2mM dNTPs,2. 5mM MgCl2, IX Taqbuffer, 0. 5units Taq 聚合酶，DNA 模板 IOOng0上述方法中，PCR扩增程序为94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C或60°C退火45s, 72°C延伸 30-60s, 37 个循环;72°C延伸 5-lOmin。Sty I酶切反应体系本发明提供了玉米耐旱种质鉴定的分子标记，所述分子标记包括dhnC397和rspC1090，其中所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ.ID No 2所示。本发明提供的分子标记及其方法用于耐旱标记辅助选择，开辟了耐旱分子标记应用于育种工作的先河。同时本发明提供的分子标记也将大大提高育种中耐旱的选择效率，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。