专利名称：CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法炭疽(Anthrax)是由感染炭疽杆菌(Bacillus anthracis)而引发的一类传染性疾病。炭疽杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，携带者为马、鹿等食草动物。人感染炭疽事件主要发生于那些经常接触动物的牧民和从事皮革工作的工人。引发炭疽感染的方式有三种一是经皮肤感染，主要由炭疽芽孢从破损皮肤进入而致病，炭疽杆菌常聚集于皮肤破损处，这类感染常可恢复而不会引发严重后果。二是经胃肠道感染，常因食用含有芽孢污染的生肉而引发，这类感染常是致死性的，也是我国炭疽感染散发病例的主要感染方式。三是经呼吸道吸入感染，炭疽芽孢直径在5 μ m以下，因此，芽孢经呼吸道吸入后可直达肺泡组织，而肺泡巨噬细胞可以吞噬芽孢，肺泡巨噬细胞目前被认为是炭疽芽孢的发芽位点，并且由此进入纵隔淋巴组织，在那里，炭疽杆菌快速弥散入血，如果不及时治疗，常可以引起100%的死亡。炭疽杆菌的致病因子主要集中在两个质粒上。一是pXOl质粒，主要表达保护性抗原(protective antigen, PA)、7jC月中因子(edema factor, EF)禾口致死因子(lethal factor, LF)，三种蛋白统称为炭疽毒素(anthrax toxin)，其中PA是介导EF和LF进入宿主细胞的关键蛋白，也是炭疽疫苗研制的基础成分。LF是Zn2+依赖的蛋白激酶，可以阻断细胞内MAPK 信号通路而导致细胞死亡，EF是Ca2+依赖的蛋白激酶，具有腺苷环化酶活性，可提高细胞内 cAMP水平，引发细胞水肿并损伤细胞生理功能。炭疽杆菌的另一个毒力因子是pX02质粒， 该质粒主要编码荚膜成分D-多聚谷氨酸，该成分能抑制巨噬细胞的吞噬作用，有利于细菌快速入血和向全身扩散，对炭疽芽孢杆菌的侵袭和感染具有重要作用。TEM8 (tumor endothelial marker 8)是PA的受体之一，最初发现其在肿瘤血管系统和胚胎小鼠血管系统上有较高表达，因此命名为肿瘤血管内皮标志物，而cDNA表达分析和原位杂交分析显示在脑，心脏，肠，肺，骨骼肌和胰腺等组织中也有少量分布，其天然功能未知。TEM8有三种蛋白亚型(isoform，variant 1-3), variantl由564个氨基酸组成，其肽链包括信号肽，胞外区，跨膜区和约221个氨基酸的胞内区，而variant〗和variantl相比有一个较短的约25个氨基酸的胞内区和4个不同的C端氨基酸残基，variant3是一个分泌性的蛋白，仅由318个氨基酸组成，不过其C端有15个不同的氨基酸。炭疽感染中，和 PA受体结合的主要是TEM8 variant2和variantl。CMG2 (capillary morphogenesis protein 2)是炭疽 PA 的另一个受体，最初在人的脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVECs)上发现，可能参与毛细血管的形成，故名CMG2，后来发现CMG2也表达于其它组织如心脏，肺，肝脏和骨骼肌等。CMG2也有三种异构体，分别由489、488、386个氨基酸构成，这些变异体都含有胞外区， 跨膜区和胞内区，CMG2与PA结合的区域序列与TEM8高度相似，相似度达60%，CMG2的天然功能目前还不清楚，但是由于这一蛋白的VWA domain可以选择性的结合collagen IV和 laminindV型胶原蛋白和层粘连蛋白)，所以有报道认为它是这些蛋白的天然配体。TEM8 和 CMG2 胞外都含有一个 VffA 区域(von Willebrand factor A), VffA 功能区常见于细胞粘附蛋白中，常常是蛋白-蛋白相互作用的位点，如整合素integrin和细胞外基质的作用。在两个PA受体中，同样也是和PA相互作用的区域。虽然接种疫苗是防治细菌和病毒等引起的传染性疾病的有效手段，但是仅仅采用疫苗接种来应对突发性传染病还很不够，以防治炭疽为例，用疫苗免疫有以下不足(1)炭疽感染一般是源自突发事件，很难预计何时需要接种疫苗。( 如已遭到恐怖袭击再接种疫苗往往为时已晚，因为炭疽疫苗在初次注射几周甚至几个月以后才开始产生免疫力。(3) 不是所有人疫苗接种后都能产生抗体。(4)减毒的炭疽疫苗，安全性上仍有一定风险，无法全面推广使用。( 单独使用疫苗不能治疗炭疽感染和中和炭疽毒素。采用疫苗免疫和抗体治疗可有效防治炭疽等传染性疾病，其有如下优势(1)注射特异性抗体能使机体迅速产生抵抗病原体的免疫力；( 被动免疫一个剂量产生的免疫力可持续几周至几个月；(3)副作用极低；(4)抗体作为治疗药物，不仅能够杀死病原体，还可中和病原体产生的毒素，阻止病情的发展。(5)抗体作为预防药物，快速、灵活、安全和有效，能很好应对突发性和不确定性事件。研制用于临床治疗的抗炭疽毒素抗体有3个难点(1)病原体抗原的突变可能会导致已有抗体丧失与抗原的亲和力，使抗体无法发挥作用；( 目前抗体多为鼠源，其人源化需要大量时间和实验验证。(3)更具挑战性的是，由于PA与其受体CMG2的亲和力Kd达到170pM，而研制的抗体要发挥治疗作用，其亲和力一般要相当于或高于毒素与受体的亲和力，要研制高于此亲和力的鼠源抗体已很困难，而将其人源化又保持高亲和力则更困难。发明内容
本发明的目的是提供一种CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质
1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由447个氨基酸残基组成，成熟的二聚体蛋白有邪4个氨基酸。
上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。
上述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
在上述编码基因中，所述严格条件为在6X SSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。
其中，序列表中的序列1由2144个脱氧核苷酸组成。
含有所述蛋白的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。
在上述重组载体中，所述重组载体为将上述编码基因插入载体pIRES2-EGFP中得到的重组载体；在本发明的实施例中其具体为将所述编码基因插入载体PIRES2-EGFP的 XhoI和BamHI位点间得到的重组载体。
在上述转基因细胞系中，在本发明的实施例中其具体为将上述重组载体导入宿主细胞得到的转基因细胞系，所述宿主细胞具体为CHO-Kl细胞。
扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围。
在上述的引物对中，本发明具体的实施例采用的引物对如下一条引物为序列5 所示的DNA分子，另一条引物为序列6所示的DNA分子。
本发明的另一个目的是提供一种炭疽疫苗。
本发明提供的一种炭疽疫苗，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种1)上述的蛋白；2)上述的重组载体；3)上述的转基因细胞系。
本发明的第三个目的是提供一种抗炭疽毒素产品。
本发明提供的一种抗炭疽毒素产品，它的活性成分为如下1)-3)中任一一种1) 上述的蛋白；2)上述的重组载体；3)上述的转基因细胞系。
上述的蛋白、上述重组载体或上述转基因细胞系在抗炭疽毒素、制备炭疽疫苗和/ 或制备抗炭疽毒素产品中的应用也是本发明保护的范围。
在应用中，所述炭疽毒素为保护性抗原PA和致死因子LF的混合物。
本发明的实验证明，本发明提供的蛋白，其可以保护细胞免受炭疽毒素的攻击， 可以作为炭疽疫苗，该蛋白与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fc片段，而Fc段又提供抗体的生物学活性，它有以下特点(1)无抗原性，两段蛋白均来自于人体；(2)高亲和力， CMG2-Fc突变体和配体PA的亲和力KD值都达到ΚΓ^πιοΙ/Ι。(3)和目前在研的PA抗体相比，不用担心病毒和菌株PA抗原的突变。(4)也具有抗体的ADCC和CDC效应。( 半衰期较长，与人源抗体相近(10-20天左右)。
下面结合附图和具体实施方案对本发明进行进一步说明，不以任何方式限制本发明的实施。凡是依照本发明公开内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。


图1为通过ftOtein A亲和层析柱纯化CMG2_Fc (E117Q)突变体蛋白结果
图2为CMG-Fc (E117Q)突变体蛋白非还原电泳检测结果
图3为CMG-Fc (E117Q)突变体蛋白还原电泳检测结果
图4为质谱法测定CMG-Fc (E117Q)突变体蛋白分子量
图5为R)rt6Bio仪器测定CMG2_Fc (E117Q)突变体蛋白和PA配体的亲和力
图6为R)rt6Bio仪器测定未突变CMG2_Fc蛋白和PA配体的亲和力
图7为CMG2 (E117Q) -Fc保护RM^64. 7巨噬细胞免受炭疽毒素攻击
图8为CMG2(E117Q)_Fc用于保护注射受炭疽毒素大鼠的存活率
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、CMG2突变体基因设计及载体构建
pIRES2-EGFP-CMG2 (E117Q) -Fc 为将 CMG2_Fc (E117Q)编码基因(序列表中的序列 1)插入pIRES2-EGFP(Clontech公司，产品目录号=6029-1)的XhoI和BamHI间得到的载体。具体构建过程如下
含有CMG2 胞外区 34-225AA 的基因载体 pIRES2_EGFP-CMG2_Fc，为将 CMG2_Fc 蛋白 (其氨基酸序列见序列表4，其核苷酸为序列表中的序列幻插入pIRES2-EGFP (Clontech公司，产品目录号6029-1)的BioI和BamHI间得到的载体。其中CMG2_Fc蛋白的信号肽为尿激酶原信号肽序列，采用重叠PCR方法将117位Glu (E)突变为Gln (Q)，将158为Tyr (Y) 突变为Glr^Q)，突变体引物见表1。具体试验操作如下
以 pIRES2-EGFP-CMG2-Fc 为模板，先用 CMG2_up-XhoI 禾Π C117dol 扩增出 CMG2 (E117Q)突变体前一部分，同时用C117up2和CMG-do-BamHI扩增出CMG2(E117Q)突变体后一部分，而后对这两部分进行重叠PCR，最后再用CMG2-up-XhoI和CMG-do_BamHI进行扩增，得到659bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列表中序列1的自5’末端第 1-636位核苷酸，即为CMG2 (E117Q)。
将上述获得的CMG2 (E117Q)用BioI和BamHI双酶切，得到酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的pIRES2-EGFP-CMG2-Fc连接，得到连接产物，将连接产物转化TranslO感受态细胞，涂LB平板培养，提取阳性克隆的质粒测序，结果为将序列表中的序列1的自5’ 末端第1-636位核苷酸插入pIRES2-EGFP-CMG2-Fc的BioI和BamHI酶切位点间，且替换掉CMG2得到的质粒，即将序列1插入pIRES2-EGFP的BioI和BamHI间得到的载体，命名为 ρIRES2-EGFP-CMG2(E117Q)-Fc。
其中，序列1的核苷酸所示的基因命名为CMG2(E117Q)_Fc，该基因编码的蛋白为CMG2(E117Q)-Fc，其氨基酸序列为序列表中的序列2。其中序列1的第1-636位 CMG2(E117Q)，序列 1 的第 637-2114 位为 Fc ；序列 2 的第 21-212 位为 CMG2 (E117Q)，序列 2 的第213-444位为Fe。
CMG2(E117Q)-Fc (序列2)与未突变的CMG2_Fc (序列4)的氨基酸相比，为将序列 4的第104位Glu(E)突变为Gln(Q)；
CMG2(E117Q)-Fc (序列1)与未突变的CMG2_Fc (序列3)的氨基酸相比，为将序列 3的第310-312位GAA突变为CAG ；
也可人工合成序列1，以CMG2-up-XhoI和CMG-do_BamHI为引物，进行PCR扩增，得到的PCR产物经过BioI和BamHI酶切后与经过同样酶切的pIRES2_EGFP连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将序列表中的序列1插入PIRES2-EGFP的BioI和BamHI间得到的载体，即为 pIRES2-EGFP-CMG2 (E117Q) -Fe。
表1CMG2-Fc突变体构建所需引物
CMG2-up-XhoI ； CCACCATGGTGGCGGAG (序列 5)
CMG-do-BamHI ； CCGGATCCACTTACCTGTCT (序列 6)
C117dol ；TCCTTCATGGATATATGTCTGTCCTACTGGACTAACACGT
C117up2 ；CAGACCTACATTCACGAGGGA
实施例2、CMG2 (E117Q) -Fc 的应用
一、蛋白的表达和鉴定
1、重组突变体基因质粒转染CHO-Kl细胞及阳性克隆筛选
转染采用hvitrogen公司生产的Lipofectamine^OOO阳离子脂质体转染试剂盒。按照试剂盒说明书操作，将由实施例1得到的载体pIRES2-EGFP-CMG2 (E117Q) -Fc转染的CH0-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号GNHa 7)培养于 5%C02、37°C温箱。转染12小时后，更换含10%肽牛血清(杭州四季青公司，产品目录号 4033)的D-MEM/F-12培养基(Gibco公司，产品编号12500-096)培养。48小时后，采用含 750ug/ml G418 和 10%肽牛血清的 D-MEM/F-12 培养基(invitrogen 公司，Gibco ，产品目录号12500-096)继续培养，每2-3天换液一次，加压12天后，采用有限稀释法对加压细胞进行单克隆，按2个细胞/孔传入96孔板，2周后出现细胞克隆。
将上述得到的细胞克隆换D-MEM/F-12培养基(invitrogen公司，Gibco公司，产品编号12500-096)继续培养M小时，后吸取细胞培养上清液10倍稀释后进行ELISA检测，所用抗体为HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号 ZDR-5301)，TMB显色后450nm测定OD值，以无血清培养基做阴性对照。
其中颜色越深的ELISA孔，表示该孔相对应的细胞克隆表达目的蛋白也越高，将该细胞克隆称之为阳性细胞克隆，命名为CH0-Kl/pIRES2-EGFP-CMG2 (E117Q) -Fe。
挑选15个阳性细胞克隆传入M孔板进行进一步ELISA检测(方法同上)，结果见下表2(H2为阴性对照)，将0D450nm数值在1以上的细胞株进行扩大培养后冻存。
表2 0D450nm 数值


本发明公开了一种CMG2突变体和Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白，是如下1)或2)中任一所述的蛋白质1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供的蛋白，其可以保护细胞免受炭疽毒素的攻击，可以作为炭疽疫苗，该蛋白与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fc片段，而Fc段又提供抗体的生物学活性。