专利名称：：稳定等渗的去氨普酶α1或其突变体制剂的制作方法技术领域：。：去氨普酶(DSPA)是南美一种吸血蝙蝠唾液中分离的纤溶酶原激活剂，主要包括四种蛋白质DSPAa1、DSPAa2、DSPAP和DSPAY。试验发现，其中去氨普酶a1具有最好的生物化学和药理学性质，所以被进一步研究。研究表明在纤维蛋白剌激下，去氨普酶a1活性增加10500倍，而组织纤溶酶原激活剂(tPA)仅为550倍；在纤维蛋白与纤维蛋白原存在的条件下，去氨普酶a1活性的比率为12900倍，而tPA仅为72倍，去氨普酶a1具有更高的纤维蛋白选择性。药理学研究表明，在肺栓塞的模型中，与tPA相比，去氨普酶a1具有更好的纤维蛋白凝块专一性；在鼠的人工模型中，去氨普酶a1也表现出比tPA更好的纤维蛋白专一性和更长的半衰期；在狗急性心肌梗塞的冠状血栓形成模型中，去氨普酶a1具有更快的再灌注和更低的再闭塞率；在鼠肠系膜静脉模型中，相比较与tPA，去氨普酶a1表现出较低的出血率；另外在鼠和猕猴药理学实验中，去氨普酶a1也表现出比tPA更低的清除率。在实验过程中，未发现去氨普酶al直接的毒性作用，仅在大剂量时表现出副作用。目前DSPAa1已完成了II期临床实验DIAS试验及DEDAS试验，其中DIAS试验结果表明安慰剂对照和给药两组血流再灌注率分别达到46.7%和71.4%，患者脑部栓塞血流获显著改善，有效的阻止了脑部损伤。90天时，两组分别有46.7%和60%的患者达到主要临床终点，颅内出血发生率两组均为3.3%(tPA在大型试验中，出血发生率为6^左右)；DEDAS试验是一个多中心、剂量递增的II期临床试验研究，目的为评价急性脑缺血症状发作39小时内，DSPAal随剂量递增(具体试验剂量未见报道)的疗效和安全性，结果表明共有38例病人在卒中症状发作39小时内接受了安慰剂治疗、90mcg/kg的去氨普酶a1治疗或125mcg/kg的DSPAa1治疗，受试者的入选标准是MRI证实弥散灌注缺失面积达20%以上和皮层组织低灌注区域超过2cm，在第90天时，安慰剂组有25%的病人临床结果有所改善，90mcg/kg组有28.6%的病人结果有所改善，而125mcg/kg组的比例为60%。重要的是，在接受治疗的病人中，无人出现脑出血。相对于野生型去氨普酶a1而言，去氨普酶a1突变体比活性提高、表达量提高、半衰期延长、溶栓活性提高，因此，申请人此前申请的专利涉及的去氨普酶a1突变体(专利申请号CN200810237709.8)更具有开发成新型有效的溶栓药物的潜在应用价值。随着生物技术的发展，多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛，相应的制剂学研究也日益受到重视。然而，与传统的小分子有机药物相比，多肽存在稳定性差的问题。引起多肽不稳定的原因研究发现包括以下几个方面(1)脱酰胺反应在脱酰反应中，天冬酰胺/谷胺酰胺残基水解形成天冬氨酸/谷氨酸。非酶催化的脱酰胺反应的进行，在天冬酰胺-甘氨酸-结构中的酰胺基团更易水解，位3于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。(2)氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，蛋氨酸、半胱氨酸和组氨酸、色氨酸、酪氨酸等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。(3)水解多肽中的肽键易水解断裂。由天冬氨酸参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是天冬氨酸_脯氨酸和天冬氨酸_甘氨酸肽键。(4)形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。(5)消旋除甘氨酸外，所有氨基酸残基的a碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中天冬氨酸残基最易发生消旋反应。(6)|3-消除P-消除是指氨基酸残基中13碳原子上基团的消除。半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基都可通过P-消除降解。在碱性pH下易发生|3-消除，温度和金属离子对其也有影响。(7)变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。提高多肽稳定性的途径包括以下几个方面(1)定点突变通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。(2)化学修饰多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG(聚乙二醇)修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可提高原生物活性。(3)添加剂通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。此外表面活性剂如SDS(十二烷基硫酸钠)、Tween(吐温)、Pluronic(普流尼克)，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4)冻干多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、P-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。因此，冻干可提高多肽的稳定性。
本发明的目的是提供一种在贮存和运输中稳定的去氨普酶al(DSPAa1)或其突变体的冻干制剂，并结合本品的临床应用，使重建后的产品维持等渗。本发明所述的以重组吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂去氨普酶a1或其突变体为活性成分的稳定等渗冻干制剂，包括去氨普酶a1或其突变体及冻干保护剂；其特征在于，所述去氨普酶a1突变体是指将野生型去氨普酶a1肽链中195位的苯丙氨酸替换成缬氨酸的肽链，命名为DSMa，或在DSMa基础上继续改变其210213位的氨基酸，将所述肽链中4210213位的四个氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、精氨酸(QNRR)替换成四个丙氨酸(AAAA)的肽链，命名为DSMb;所述冻干保护剂包括氨基酸、糖/多元醇、等渗调节剂和pH值为5.57.0的缓冲体系，其中氨基酸为甘氨酸、L-精氨酸或L-组氨酸，糖/多元醇为蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇，等渗调节剂为氯化钠，缓冲体系为磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述冻干制剂中，去氨普酶a1或其突变体的单位剂量范围为310mg，且每毫克去氨普酶a1或其突变体适配的冻干保护剂甘氨酸用量为0.0110mg、或L-精氨酸的用量为0.1100mg、或L-组氨酸的用量为0.150mg，蔗糖的用量为0.1100mg、或乳糖的用量为0.1100mg、或葡萄糖的用量为1200mg、或甘露醇的用量为1200mg、或山梨醇的用量为1200mg;缓冲体系为0.01M0.2M的磷酸盐缓冲液、或0.05M0.5M枸橼酸盐缓冲液、或0.01M0.2M醋酸盐缓冲液。上述冻干保护剂中还可加入表面活性剂吐温20或吐温80，其中每毫克去氨普酶a1或其突变体适配吐温20的用量为0.001lmg、或适配吐温80的用量为0.015mg。优选的方式为所述每毫克去氨普酶a1或其突变体适配吐温20的用量为0.010.5mg、或适配吐温80的用量为0.01lmg。更优选的方式为所述每毫克去氨普酶a1或其突变体适配吐温20的用量为0.050.3mg、或适配吐温80的用量为0.050.5mg。上述冻干制剂中每毫克去氨普酶a1或其突变体适配甘氨酸的用量优选0.055mg、或适配L-精氨酸的用量优选150mg、或适配L-组氨酸的用量优选120mg，蔗糖的用量优选150mg、或乳糖的用量优选150mg、或葡萄糖的用量优选5100mg、或甘露醇的用量优选5100mg、或山梨醇的用量优选5100mg。更进一步优选的方式为每毫克去氨普酶a1或其突变体适配甘氨酸的用量为0.1lmg、或L-精氨酸的用量为530mg、或L-组氨酸的用量为210mg，蔗糖的用量为530mg、或乳糖的用量为530mg、或葡萄糖的用量为1050mg、或甘露醇的用量为1050mg、或山梨醇的用量为1050mg。上述的冻干制剂为稳定等渗的制剂。上述的去氨普酶al或其突变体的冻干制剂中，冻干保护剂即氨基酸、糖/多元醇、等渗调节剂和PH值为5.57.0的缓冲体系的组合方案优选以下几种方式方案1:氨基酸(甘氨酸或L-精氨酸或L-组氨酸)+糖(蔗糖或乳糖或葡萄糖)+等渗调节剂+缓冲体系(磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液)。方案2:氨基酸(甘氨酸或L-精氨酸或L-组氨酸)+糖(蔗糖或乳糖或葡萄糖)+等渗调节剂+缓冲体系(磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液)+表面活性剂(吐温20或吐温80)。方案3:氨基酸(甘氨酸或L-精氨酸或L-组氨酸)+多元醇(甘露醇或山梨醇)+等渗调节剂+缓冲体系(磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液)。方案4:氨基酸(甘氨酸或L-精氨酸或L-组氨酸)+多元醇(甘露醇或山梨醇)+等渗调节剂+缓冲体系(磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液)+表面活性剂(吐温20或吐温80)。本发明所述冻干制剂的制备方法是(1)按设定的试验方案以处方量配制所需要的缓冲体系，用此缓冲体系置换去氨普酶a1或其突变体原液缓冲液，获得适于制剂制备的去氨普酶a1或其突变体原液；(2)准确称取处方量的各辅料(冻干保护剂)，以所述缓冲体系的缓冲液溶解，并调节PH值为5.57.0，得含有冻干保护剂的缓冲溶液；(3)将去氨普酶a1或其突变体原液加入含冻干保护剂的缓冲溶液中，定容；除菌过滤，分装、冻干；得去氨普酶a1(DSPAa1)或其突变体的冻干制剂。(4)将分装容器加塞、压盖，即得成品。本发明的冻干制剂临床应用时加入适量注射用水进行重建即可使用。本发明有以下显著优点(l)通过冻干保护剂的合理选择和使用，显著改善了产品的稳定性，便于贮存、运输和应用；(2)处方组成中所用辅料易得，价格适宜，不会明显增加产品成本，易于接受；(3)制备工艺简单，可操作性强，适于工业化生产。具体实施例方式以下实施例将进一步说明本发明，但不限制本发明。实施例1:以pH5.8的10mM磷酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1冻干制剂处方细成组分用量DSPAa1lg甘氨酸300mg甘露醇30g氯化钠适量缓冲液加至1000ml分装至.200支制备方法配制处方量的pH5.8的10mM磷酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的磷酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSPAa1原液的差值。将处方量的DSPAa1原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例2:以p朋.0的20mM磷酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突变体DSMa冻干制剂处方组成组分用量DSMalg甘氨酸150mg甘露醇40g吐温80200mg氯化钠适量缓冲液加至1000ml分装至200支6制备方法配制处方量的pH6.0的20mM磷酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的磷酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSMa原液的差值。将处方量的DSMa原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例3:以p朋.2的0.1M枸橼酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突变体DSMb冻干制剂处方组成__用量DSMblgL-精氨酸10g蔗糖10g氯化钠适量缓冲液加至1000ml_分装至_200支制备方法配制处方量的p朋.2的0.1M枸橼酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的磷酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSMb原液的差值。将处方量的DSMb原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例4:以p朋.0的0.2M醋酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1冻干制剂处方组成组分_SiDSPAa1lgL-组氨酸5g乳糖15g吐温20lOOmg氯化钠适量缓冲液加至1000ml分装至200支制备方法配制处方量的p朋.0的0.2M醋酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的枸橼酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSPAa1原液的差值。将处方量的DSPAal原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为O.22ym的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例5:以p朋.5的50mM磷酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突7变体DSMa冻干制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>制备方法配制处方量的pH6.5的50mM磷酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的磷酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为6.07.0，定容至体积为配液总体积与DSMa原液的差值。将处方量的DSMa原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例6:以p朋.0的50mM醋酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突变体DSMb冻干制剂处方组成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>制备方法配制处方量的p朋.0的50mM醋酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的磷酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSMb原液的差值。将处方量的DSMb原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例7:以pH6.0的lOmM磷酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1冻干制剂处方组成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备方法配制处方量的pH6.0的lOmM磷酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的醋酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSPAa1原液的差值。将处方量的DSPAal原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为O.22ym的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例8:以p朋.2的0.1M醋酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突变体DSMa冻干制剂处方组成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备方法配制处方量的p朋.2的0.1M醋酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的枸橼酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSMa原液的差值。将处方量的DSMa原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。实施例9:以p朋.2的0.1M枸橼酸盐缓冲液为缓冲体系制备稳定等渗的DSPAa1突变体DSMb冻干制剂处方组成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>制备方法配制处方量的pH6.2的0.1M枸橼酸盐缓冲液，准确称取处方量的各辅料，加入适量的醋酸盐缓冲液溶解，并调节pH值为5.56.5，定容至体积为配液总体积与DSMb原液的差值。将处方量的DSMb原液加入其中，轻摇混匀，用孔径为0.22i！m的微孔滤膜除菌过滤，分装、冻干、加塞、压盖，即得。权利要求一种以重组吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂去氨普酶α1或其突变体为活性成分的稳定等渗冻干制剂，包括去氨普酶α1或其突变体及冻干保护剂；其特征在于，所述去氨普酶α1突变体是指将野生型去氨普酶α1肽链中195位的苯丙氨酸替换成缬氨酸的肽链，命名为DSMa，或在DSMa基础上继续改变其210～213位的氨基酸，将所述肽链中210～213位的四个氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、精氨酸替换成四个丙氨酸的肽链，命名为DSMb；所述冻干保护剂包括氨基酸、糖/多元醇、等渗调节剂和pH值为5.5～7.0的缓冲体系，其中氨基酸为甘氨酸、L-精氨酸或L-组氨酸，糖/多元醇为蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇，等渗调节剂为氯化钠，缓冲体系为磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液；所述冻干制剂中，去氨普酶α1或其突变体的单位剂量范围为3～10mg，且每毫克去氨普酶α1或其突变体适配的冻干保护剂甘氨酸用量为0.01～10mg、或L-精氨酸的用量为0.1～100mg、或L-组氨酸的用量为0.1～50mg，蔗糖的用量为0.1～100mg、或乳糖的用量为0.1～100mg、或葡萄糖的用量为1～200mg、或甘露醇的用量为1～200mg、或山梨醇的用量为1～200mg；缓冲体系为0.01M～0.2M的磷酸盐缓冲液、或0.05M～0.5M枸橼酸盐缓冲液、或0.01M～0.2M醋酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干保护剂中还加入表面活性剂吐温20或吐温80，其中每毫克去氨普酶a1或其突变体适配吐温20的用量为0.001lmg、或适配吐温80的用量为0.015mg。3.根据权利要求2所述的冻干制剂，其特征在于，所述每毫克去氨普酶al或其突变体适配吐温20的用量为0.010.5mg、或适配吐温80的用量为0.01lmg。4.根据权利要求3所述的冻干制剂，其特征在于，所述每毫克去氨普酶al或其突变体适配吐温20的用量为0.050.3mg、或适配吐温80的用量为0.050.5mg。5.根据权利要求l所述的冻干制剂，其特征在于，所述每毫克去氨普酶al或其突变体适配甘氨酸的用量为0.055mg、或适配L-精氨酸的用量为150mg、或适配L-组氨酸的用量为120mg，蔗糖的用量为150mg、或乳糖的用量为150mg、或葡萄糖的用量为5100mg、或甘露醇的用量为5100mg、或山梨醇的用量为5100mg。6.根据权利要求5所述的冻干制剂，其特征在于，所述每毫克去氨普酶al或其突变体适配甘氨酸的用量为0.1lmg、或L-精氨酸的用量为530mg、或L-组氨酸的用量为210mg，蔗糖的用量为530mg、或乳糖的用量为530mg、或葡萄糖的用量为1050mg、或甘露醇的用量为1050mg、或山梨醇的用量为1050mg。全文摘要本发明公开了一种以重组吸血蝙蝠纤溶酶原激活剂去氨普酶α1或其突变体为活性成分的稳定等渗冻干制剂，包括去氨普酶α1或其突变体及冻干保护剂；本发明的冻干制剂可用合适的稀释剂重建成溶液制剂以适于临床应用。文档编号A61K38/49GK101785856SQ200910013968公开日2010年7月28日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者刘禄娟,张明会,杨清敏,王晶翼,马中珲申请人:齐鲁制药有限公司