专利名称：海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, EC111. 27,简写为LDH)是生物体糖酵解过程中重要的氧化还原酶，普遍存在于动物、植物和微生物中。基于血清LDH活性水平可以反映富含LDH细胞的増殖、代谢等生物学性状，LDH作为临床诊断试剂已被广泛应用(张之南， 血液病诊断与疗效标准，1998)。目前对LDH的应用主要集中于临床白血病、心肌梗塞诊断，肺癌、淋巴瘤、卵巣癌等多种肿瘤的早期诊断和疗效判断，丙氨酸氨基转移酶測定试剂盒制备，作为食品添加剂用于发酵奶制品、腌溃品、糖果制品和饮料生产(王翰林，实用预防医学，2010 ;石轩峰等，河南エ业大学学报，2005)。早期生产LDH的方法是从动物脏器尤其是心肌和骨骼肌中提取，但很难得到纯度较高的LDH，而通过微生物发酵法则容易制得。目前普通微生物发酵生产LDH处于菌种选育、发酵条件优化、酶分离纯化、基因克隆及表达等研究阶段(朱勇，食品与发酵エ业，2006 ;杨海麟等，エ业微生物，2005)。但海洋微生物发酵生产LDH研究很少，尚在起步阶段。我国目前医用LDH主要依靠进ロ，海洋微生物发酵生产LDH产业化、规模化还未见报道。由于动物脏器组织中酶系复杂，生物活性物质变化较大，难以提取高纯度的乳酸脱氢酶。利用海洋微生物发酵生产LDH比从动物组织中提取更容易制得纯度高、专ー性强的乳酸脱氢酶。普通微生物发酵生产的LDH最适作用温度一般为45 55°C，而人体的生理温度一般为36. 5 37°C，致使普通微生物发酵生产的LDH不能充分发挥作用，出现治疗效果差或没有效果。海洋微生物(低温、寡营养、低光照、高压)发酵生产的LDH最适作用温度一般为35 40°C，比较接近人体的生理温度，应用于治疗效果比较明显。此外，海洋微生物发酵生产的LDH在医用诊断、治疗等方面精准度高于其他方法生产的LDH(苏虹等，吉林大学学报，2006)，因此海洋微生物发酵生产LDH具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力。技术内容本发明的目的是提供ー种海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法，该发明主要是海洋微生物经过定向驯化后，在常规培养条件下液体发酵生产乳酸脱氢酶的方法，这种生产方法获得的乳酸脱氢酶活性可以达到150U/mL，如再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。该酶制剂最适作用温度接近人体生理温度，医疗效果显著、检测精准度高；在食品加工中应用操作简单、方便、快捷、成本低，可以从根本上避免中温酶的加热、冷却设备和エ艺。本发明所述的ー种海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法具体包括以下步骤(I)将产生乳酸脱氢酶的海洋微生物进行6 10次活化，再经过定向驯化4 6次，使其在培养条件下生长良好；(2)按常规方法将定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在12 18°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(3)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的4 10%接种量接入液体发酵培养基中，在12 18°C培养24 60h吋，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束； (4)将(3)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。本项目中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。乳酸脱氢酶产生菌(CGCMM菌种编号1. 3或I. 11)先活化，再经过逐级定向驯化后，按本发明产酶条件进行培养，驯化后的菌株在4°C环境中可保存2个月，用10 25%甘油制成的菌悬液、在_80°C条件下可以长期保藏。6.Og,丙酮酸O. 2 O. 7mL,NaCl 5. O 10. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基蛋白胨8. O 12. Og,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,NaCl 5. O 10. 0g，KH2PO4L 5 2. 5g, K2HPO4O. 5 I. 5g,自来水 I. 0L，pH 值自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. O 6. 5g,玉米浆 12. 5 16. 5mL, NaCl 5. O 10. Og, ΚΗ2Ρ042· 5 6. Og,こ酸铵 I. 5 5. Og,丙酮酸O.2 O. 6mL，吐温801. 5 4. 5mL，自来水I. 0L, pH值自然，，121°C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经定向驯化4 6次，使其在培养条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在12 18°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(4)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的4 6%接种量接入IOL液体发酵培养基中，在12 14°C培养48 60h吋，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液在6，000 8，OOOrpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例ニ (I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,琼脂16. Og,蒸馏水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。②菌株定向驯化培养基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. O 6.Og,丙酮酸O. 2 O. 7mL, NaCl 5. O 10. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基蛋白胨8. O 12. Og,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,NaCl 5. O 10. 0g，KH2PO4L 5 2. 5g, K2HPO4O. 5 I. 5g,自来水 I. 0L，pH 值自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. O 6. 5g,玉米浆 12. 5 16. 5mL, NaCl 5. O 10. Og, ΚΗ2Ρ042· 5 6. Og,こ酸铵 I. 5 5. Og,丙酮酸0.2 O. 6mL,吐温801. 5 4. 5mL,自来水I. 0L，pH值自然，121 °C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经定向驯化4 6次，使其在培养条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在12 18°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；(4)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的6 8%接种量接入50L液体发酵培养基中，在14 16°C培养36 48h吋，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液6，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。实施例三(I)培养基制备①菌种活化培养基葡萄糖5. Og,蛋白胨5. Og,酵母膏2. Og,琼脂16. Og,蒸懼水
1.0L, pH值自然，121°C高压蒸气灭菌30min。②菌株定向驯化培养基葡萄糖2. 5 7. 5g,蛋白胨4. 5 6. 5g,酵母膏3. O
6.Og,丙酮酸O. 2 O. 7mL, NaCl 5. O 10. Og,蒸懼水I. 0L, pH值自然，121°C高压蒸汽灭菌 30min。③液体种子培养基蛋白胨8. O 12. Og,酵母膏I. 5 3. 5g,葡萄糖2. 5 8. Og,NaCl 5. O 10. 0g，KH2PO4L 5 2. 5g, K2HPO4O. 5 I. 5g,自来水 I. 0L，pH 值自然，121。。高压蒸汽灭菌30min。④发酵产酶培养基葡萄糖6. 5 8. 5g,酵母膏I. 5 2. 5g,蛋白胨3. O 6. 5g,玉米浆 12. 5 16. 5mL, NaCl 5. O 10. Og, ΚΗ2Ρ042· 5 6. Og,こ酸铵 I. 5 5. Og,丙酮酸
O.2 O. 6mL,吐温801. 5 4. 5mL,自来水I. 0L，pH值自然，121 °C高压蒸汽灭菌30min。(2)将产生乳酸脱氢酶的微生物按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株说明进行6 10次活化，再经定向驯化4 6次，使其在培养条件下生长良好；(3)按常规方法将产物定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在12 18°C培养24 36h而后按5 8%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和ニ级种子；
(4)将液体一级种子或ニ级种子，按发酵液体积的8 10%接种量接入200L液体发酵培养基中，在16 18°C培养24 36h吋，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；(5)将(4)的发酵液6，000 8，OOOrpm离心收集菌体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；(6)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；(7)根据不同需要和使用对象不同，将(6)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。


本发明所述的一种微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法是将产生乳酸脱氢酶的海洋微生物进行6～10次活化，再经定向驯化4～6次，使其在常规压力、盐浓度条件下生长良好；按常规方法将定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在18～24℃逐级扩大培养，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在18～24℃培养60～96h时，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；发酵液在6,000～8,000rpm离心收集菌体，数次洗涤后收集沉淀，悬浮于缓冲液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm离心收集上清即为粗酶液；根据不同需要和使用对象不同，可以将粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。