专利名称：包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物的抗癌用途的制作方法肿瘤是当今社会危害人类健康的重大疾病之一，已成为仅次于心脑血管疾病的世界第二大死因疾病。恶性肿瘤治疗方案一般为在手术后配合放化疗治疗，但化疗药物具有一定的毒副作用，中药抗肿瘤药具有独特的优势，具有祛邪、扶正或增效、减毒的作用，所以中药抗肿瘤药物一直是研究的热点。大蒜防癌抗癌的历史悠久，其主要成分有含硫有机化合物、氨基酸类、酶类、糖类、脂类、皂苷类、维生素和微量元素等。现代药理研究表明，大蒜有抗菌、消炎、降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化以及增强机体免疫力等多种功效。一、大蒜主要成分的防癌抗癌作用综述大蒜属于免疫激发型中草药，可诱生干扰素，抑制肿瘤坏死因子的生成，降低致癌物作用，提高人体免疫功能，在恶性肿瘤的防治方面有着广阔的开发前景。下面对大蒜油及其主要成分二烯丙基三硫(也称作大蒜素)和二烯丙基二硫以及大蒜多糖、大蒜皂苷的作用进行详细分析I、免疫作用大蒜具有很好的免疫调节作用，可增加实验动物的脾脏重量，增加吞噬细胞和T淋巴细胞数量，增强吞噬细胞的吞噬能力，提高淋巴细胞转化率。其活性成分大蒜提取物可以促进T淋巴细胞的增殖，提高NK细胞的活性，促进IL-2、TNF、IFN等细胞因子的释放，从而加强免疫系统的防御和监视功能。特别地，大蒜中含有的大蒜素还能提高肿瘤患者的细胞免疫功能。2、预防及治疗肿瘤的作用从大蒜中提取的大蒜油含有的烯丙基硫化物有抑制人类多种肿瘤生长的作用。具体而言，烯丙基硫化物中的二烯丙基三硫(DATS，合成品即大蒜素)，是大蒜油的中的主要成分之一，在油中含量最高。大蒜素能阻断致癌物的合成，抑制致癌物的活化和抗突变、抗畸变；还对肿瘤细胞有直接杀伤作用，能够抑制癌细胞生长、调节细胞周期、促进癌细胞凋亡。烯丙基硫化物中的二烯丙基二硫(DADS)是大蒜油的中的另一个主要成分，在油中含量居第二，目前已发现，它能抑制多种人肿瘤细胞生长。此外，大蒜中的螺留皂苷eruboside-B具有与甘草次酸相似的体内抗肿瘤作用，对若干细胞系具有细胞毒作用，例如BC1、LuUCol2、KB、KB-V。大蒜多糖还能减轻肿瘤药物阿霉素(adriamycin，ADR)对心脏的毒性。3、抗氧化作用由于多种氧化物都是癌症的诱导因子，因此目前研究认为，抗氧化物对抗癌有一定功效，已经证明大蒜中的一些组分有很强的抗氧化作用，从而有助于其抗癌作用。此外，大蒜多糖具有清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，且在较高浓度下强于大蒜素，而大蒜素的还原能力则强于大蒜多糖。综上所述，目前对大蒜中的大蒜油及其主要成分预防和抗肿瘤的作用有详细报道，对大蒜素、大蒜多糖的抗氧化作用、大蒜皂苷的单体抗肿瘤作用以及大蒜多糖的减毒作用也有报道，但是并没有将三者组合协同进行抗肿瘤的研究报道。二、大蒜主要成分的制备方法综述专利200610135316. 7涉及大蒜总皂苷(大蒜甙)与大蒜生物活性成分组合物的提取工艺及其用途，该技术的主要存在的问题为没有说明所含皂苷、生物活性成分是怎样鉴别的及其含量测定方法。另有多篇专利涉及大蒜多糖(如专利2007100171321、CN1239719 和 200310117625. 8)和大蒜精油(专利 200310117624. 3、200610033685)的提取 方法。但是，现有技术大多只涉及单独提取利用大蒜中的大蒜油、大蒜阜苷或大蒜多糖。实际上，大蒜中含有多种活性成分，主要分为脂溶性成分和水溶性成分两类。脂溶性成分主要是大蒜油，含量为0. 2%左右，水溶性成分氨基酸、蛋白质、多糖、皂苷、维生素、微量元素等，含量为25%左右。然而在目前的大蒜药品和保健品中，还没有联合制备大蒜脂溶性成分和水溶性成分的先例，也没有将上述成分组合在一起，以充分发挥大蒜的药用或保健价值的女口广叩o
本发明的目的是提供一种包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物的抗癌用途，本发明的另一个目的是提供所述包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物及其制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的—方面，本发明提供了一种包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总阜苷的组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物、保健品和/或食品中的应用。进一步，所述大蒜油的主要成分包括二烯丙基三硫、二烯丙基二硫、二烯丙基一硫、甲基稀丙基二硫和甲基稀丙基_■硫等；所述大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖；所述大蒜总皂苷的主要成分为甾体阜苷，其包括呋留阜苷、螺留阜苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B、proto-iso-eruboside-B、sativoside-Bl 和 proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside-C、sativoside-Rl、sativoside_R2、sativoside_B2、sativoside_B3、sativoside_B4 和 sativoside_B5 等，总之大蒜中共含有25种皂苷单体。进一步，所述癌症选自胃癌、直/结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、脑瘤、皮肤癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤等癌症。进一步，所述药物选自以下剂型注射剂、片齐IJ、颗粒齐IJ、胶囊齐IJ、软胶囊齐IJ、滴丸、口服液、膜剂、散剂、外用膏剂、栓剂和丸剂等剂型。进一步，所述组合物中大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷的比例以重量计为I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。另一方面，本发明提供了一种制备包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物的方法，其包括以下步骤I)根据现有技术(专利ZL200510083951. 0)提供的方法进行大蒜双提，得大蒜油、药液和药渣，药液保留；2)大蒜油采用无水硫酸钠脱水，得纯大蒜油，再经环糊精包合，得大蒜油的包合物；3)药渣水提，得水提液；4)将步骤I)所得药液和步骤3)所得水提液合并，减压回收水，浓缩，浓缩液加乙醇醇沉，过夜，离心，得沉淀和上清液(即药液I);5)将步骤4)所得沉淀干燥，得浅黄色大蒜总多糖；或溶解步骤4)所得沉淀，离心，上清液过树脂柱，流出液减压浓缩，干燥，得黄白色大蒜总多糖； 6)将步骤3)水提后的药渣淋干，加乙醇回流提取，得药液II ；7)合并步骤4)所得药液I和步骤6)所得药液II，减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，离心，得上清药液III ;8)步骤7)所得药液III过大孔树脂，依次水洗和/或乙醇洗，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，干燥，得棕色或深黄色大蒜总皂苷；9)将步骤I)所得大蒜油或步骤2)所得大蒜油包合物、步骤5)所得大蒜总多糖和步骤8)所得大蒜总阜苷组合得到包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总阜苷的组合物。此外，根据不同的剂型，形成不同的处方(处方中包括三个有效部位的比例要求和适当的辅料)，可以得到包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物的不同制剂。进一步，步骤I)中，所述双提为将大蒜粉碎，加水保温酶解，水蒸气蒸馏提取，进行1_3次，每次加3_9倍水，每次0. 5_2h。进一步，步骤2)中，所述大蒜油包合的具体步骤为大蒜油用65%-95% (体积比)乙醇按I : 5-1 15(mL/mL)的比例溶解，在25-45 °C超声池中，以环糊精包合0. 5-1. 5h;优选地，所述环糊精包括a-环糊精、￠-环糊精、羟乙基-￠-环糊精、羟丙基-￠-环糊精、￠-环糊精甲基化衍生物和支链环糊精等，环糊精的浓度为10% (质量体积比)，大蒜油环糊精以重量计为I : 6_1 : 12。进一步，步骤3)中，所述水提为1-2次,每次加3-9倍水,每次0. 5_2h。进一步，步骤4)中，所述减压回收是在温度不高于80°C下进行的；所述浓缩液，以大蒜(g):药液(mL)为单位计，浓度为I : 0.8-1. 2，使药液在60°C下的相对密度为0.9-1. 10 ;所述乙醇在浓缩液中的含量为75-85% (体积比)。进一步，步骤5)中，所述溶解沉淀的溶剂为热的去离子水；所述树脂为D316、HPD300L、D900、D318或D941型树脂，优选为D941或D900型树脂；所述减压浓缩是在温度不高于80°C下进行的；所述干燥为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，优选地，所述减压干燥温度不高于60°C，所述喷雾干燥的预热器温度为280°C，其干燥室温度为120°C，所述冷冻干燥的冷肼温度为_50°C，其干燥温度为25°C。进一步，步骤6)中，所述回流提取的具体步骤为加3-5倍(质量比)95% (体积比)乙醇回流，提取1-2次，每次0. 5-1. 5小时。进一步，所述步骤7)包括，合并药液1、11，减压回收至无醇味，使其25°C时相对密度为I. 00-1. 10，加水稀释，加水量为药材重量的0. 5-0. 9倍，离心，得上清药液。进一步，步骤8)中，将药液III过大孔树脂，所述树脂优选为DM-130、AB_8或HPD100，按照树脂与生药重量比计，上样量为I : 0.8-1. 1，依次水洗4-6BV(Bed Volume，床体积)和/或30 % (体积比)乙醇洗2-5BV，70 % -95% (体积比)乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脱液，或30% (体积比)乙醇洗脱后的乙醇洗脱液，在温度<70°C下减压回收乙醇至无醇味，减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，所述减压干燥温度不高于60°C，喷雾干燥干燥室温度不超过120°C，冷冻干燥冷肼温度低于_50°C。再一方面，本发明提供了一种根据所述的方法制备的包含大蒜油、大蒜总多糖和 大蒜总皂苷的组合物。进一步，所述组合物中大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷的比例以重量计为I : 2. 5 : I. 25 I : 200 : 50。更进一步，所述大蒜油的主要成分包括二烯丙基三硫、二烯丙基二硫、二烯丙基一硫、甲基稀丙基二硫和甲基稀丙基_■硫等；所述大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖；所述大蒜总皂苷的主要成分为甾体阜苷，其包括呋留阜苷、螺留阜苷，其中，所述呋留阜苷包括proto-eruboside-B、proto-iso-eruboside-B、sativoside-Bl 和 proto-desgalactotigonin,所述螺留阜苷包括eruboside_B、iso-eruboside-B、sativoside-C、sativoside-Rl、sativoside_R2、sativoside_B2、sativoside_B3、sativoside_B4 和 sativoside_B5 等。再进一步，所述大蒜油中二烯丙基二硫和二烯丙基三硫的总含量不低于50%，大蒜油包合物中，大蒜油的利用率不低于93% ;所述大蒜总多糖中大蒜总多糖含量以葡萄糖标定不低于45%，大蒜总多糖水解后，各单糖含量总和不低于50 %，所述大蒜总皂苷中，总阜苷含量以阜苷单体proto-iso-eruboside-B(C57H96O3tl)为对照品标定不低于40%。本发明提供的包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物及其制备方法的有益效果如下本发明提供的包含大蒜油、大蒜总多糖和大蒜总皂苷的组合物填补了大蒜脂溶性和水溶性活性成分在抗肿瘤防治领域联合应用方面的空白，充分利用大蒜提取大蒜油之后的药渣，所得到的组合物使大蒜水溶性、脂溶性有效成分防癌抗癌的活性得到充分的发挥，产品具有显著的抗肿瘤活性，可以达到扶正祛邪、增效减毒的作用，可以制成抗肿瘤药物、保健品和食品，并且安全低毒，应用前景广阔。本发明提供的制备包含大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷的组合物的方法以鲜大蒜为原料，在提取大蒜油的同时，提取分离到大蒜总多糖和大蒜总皂苷，经纯化后将它们组合，具有操作简单、产品质量可控、适于产业化生产等优点。

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I为实施例2的二烯丙基二硫化物标准曲线图(标准曲线方程y =477. 1029x-2. 2526，相关系数:0. 9999，线性范围:0. 368 ~ 7. 36 u g)；图2为实施例2的二烯丙基三硫化物标准曲线图(标准曲线方程y =796. 9455x-4. 3282，相关系数:0. 9999，线性范围:0. 2288 4. 576 u g)；
图3为实施例3的大蒜皂苷对照品与样品显色后全波长扫描图；图4为实施例3的大蒜皂苷标准曲线图(标准曲线方程y = 0. 012x+0. 002，相关系数:0. 9995，线性范围19. 44 58. 32 u g)；图5为实施例4的葡萄糖标准曲线图(标准曲线方程y = 12. 97x-0. 078，相关系数:0. 9990，线性范围17. 8 71. g)；图6为实施例4的标准溶液离子色谱谱图；图7为实施例4的样品离子色谱谱图。

1、11，减压回收乙醇(温度<70°C)至无醇味(25°C，相对密度I. 05)，加水稀释至提取药材的0. 8倍(12000mL)，离心，上清液过HPD100大孔树脂，上样量I I. 1,30% (体积比)乙醇洗4BV，95% (体积比)乙醇洗4BV，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味(温度<70°C)，减压干燥(温度< 60°C )，得棕色大蒜总皂苷提取物I. 56kg(按生品计算，大蒜总皂苷出膏率为10. 38%，提取物中总皂苷含量以皂苷单体proto-iso-eruboside-B(C57H9603Q)为对照品标定为42% )。取上述大蒜油包合物、大蒜总多糖、大蒜总阜昔进行组方I、组合物颗粒制剂的制备颗粒处方组成大蒜油lmL环糊精包合物9. 95g，大蒜总多糖45g，大蒜总皂苷17. 5g，糊精适量，阿斯巴甜适量；制备混匀，95% (体积比)的乙醇做润湿剂，制粒，减压干燥(温度< 50°C )，共制成颗粒IOOOg,得大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总阜苷组合物颗粒,每克颗粒含大蒜油Img,大蒜总多糖45mg,大蒜总阜苷17. 5mg。2、组合物乳剂的制备乳剂处方组成大蒜油lg，大蒜总多糖35g,大蒜总阜苷17. 5g,吐温-80 lg ；、
制备研匀，加蒸馏水至IOOOmL,制成大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷组合物乳齐U，每毫升乳剂含大蒜油Img,大蒜多糖35mg,大蒜总阜苷17. 5mg。实施例2 :大蒜油的质量控制(参照专利ZL200510083951. 0)本实施例采用液相色谱法测定大蒜油中二烯丙基三硫和二烯丙基二硫的含量，测定方法为I、仪器和材料
高效液相色谱仪=HPllOO液相色谱仪(包括四元泵、二极管阵列检测器、自动进样器、HP化学工作站)。化学试剂甲醇、甲酸为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。对照品二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物自制，纯度均在98%以上。2、色谱条件色谱柱为Zorbax extend C18 柱(4. 6X 250_ 5 U m);流动相为甲醇-0. 17% (体积比)甲酸溶液(80 20);流速=ImL min-1 ;检测波长240nm ;柱温35°C。3、对照品的制备精密称取二烯丙基二硫化物30. 44mg, 二烯丙基三硫化物对照品32. 12mg置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀；分别精密吸取0. 6088mg -mr1的二烯丙基二硫化物溶液和0. 6424mg -m^1的二烯丙基三硫化物溶液各I. OmL于IOmL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇勻，即得0. 06088mg ^mL-1的二烯丙基二硫化物和0. 06424mg ^mL-1的二烯丙基三硫化物混合溶液。4、样品溶液的制备取实施例I制得的大蒜油样品约2mg，精密称定，置于5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。5、标准曲线的绘制对照品溶液分别进样2、4、8、12、16、20和40 ii L，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程如图I和2所示。6、样品测定分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各IOy L，注入高效液相色谱仪，测定，即得。大蒜油中二烯丙基二硫、二烯丙基三硫的含量分别为20. 33%和39. 06%，二者总和为59. 39%。实施例3 :大蒜总皂苷的质量控制本实施例采用紫外-可见分光光度仪测定大蒜总皂苷的含量，因目前国内外大蒜皂苷类化合物无对照品销售，本发明人从大蒜总皂苷中分离到一个皂苷单体proto-iso-eruboside-B,以此为对照品，采用紫外可见分光光度法，以硫酸_甲醇为显色齐U，建立了大蒜总皂苷含量测定方法，使产品质量得到控制。经方法学验证，该方法准确可靠，稳定性(RSD%= I. 1%)、精密度(RSD%= 1.0%)、重复性(RSD%= I. 52% )均良好，加样回收率为102. 59% (RSD/ = I. 4%,n = 6。经该方法检测，在本发明的大蒜总皂苷中，阜苷含量以proto-iso-eruboside-B计不低于40%,具体测定方法如下I、仪器与试剂
8453紫外-可见分光光度计(美国，安捷伦)；HW SYll-K数显恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；CX-250超声波清洗机(天海双龙医疗设备有限公司)；天平(德国赛多利斯，P225D);浓硫酸和95% (体积比)乙醇(均为分析纯，北京化工厂)；Proto-iso-eruboside-B (简称PIEB)(供含量测定用，实验室自制，经核磁共振光谱氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)及质谱(MS)测试鉴定其结构，HPLC归一化法测试纯度> 98% )。2、对照品溶液的制备精密称取大蒜总皂苷样品(60目，38#柱样品批号20101129) IOmg置25mL量瓶中，加入甲醇超声30min至样品完全溶解，定容，过滤即得。3、样品溶液的制备

精密称取实施例I制得的大蒜皂苷样品3. 64mg至IOmL容量瓶中，加入甲醇至样品完全溶解，定容即得。4、显色方法及测定波长的选择精密吸取0. 5mL对照品溶液和0. 5mL供试品溶液，置于IOmL具塞试管中，80°C水浴挥干后，加入硫酸-甲醇(7 3)5mL，摇匀，90°C水浴反应60min，取出后冰水浴lOmin，以相应溶剂为空白，测定样品吸光度，如图3所示，对照品与样品显色后全波长扫描图均在326nm处有最大吸收。5、标准曲线的绘制精密吸取对照品(0.324mg/mL)，稀释 1/10，精密吸取 0. 6mL、0. 8mL、l. OmLU. 2mL和I. 4mL至具塞试管中，80°C水浴挥干后，加入70% (体积比)硫酸-甲醇5mL，置于60°C水浴加热60min,取出后冰水浴IOmin,室温放置15min后，以相应溶液为空白，测定326nm下吸光度。以对照品的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，如图4所示，计算标准曲线为y = 0. 012x+0. 002，相关系数为0. 9995，表明对照品在19. 44 58. 32 y g范围内呈良好的线性关系。6、样品测定分别精密量取对照品溶液和样品溶液各I. OmL，分置于具塞试管中，80°C水浴挥干溶剂，各加入70% (体积比)硫酸-甲醇5mL密塞，摇匀，于60°C水浴下反应60min，取出后冰浴IOmin,室温放置15min后，以相应溶液为空白，于326nm波长下测定其吸光度。7、测定结果大蒜总皂苷的含量为42. 00%。实施例4 :大蒜总多糖的质量控制I、仪器与试剂8453紫外-可见分光光度计(美国，安捷伦)、Hf SYll-K数显恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)、CX-250超声波清洗机(天海双龙医疗设备有限公司)；天平(德国赛多利斯，P225D);苯酚(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)，浓硫酸(分析纯，北京化工厂)，95% (体积比)乙醇(分析纯，北京化工厂)，D-无水葡萄糖对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号110833-200503)。2、样品测定(I)对照品溶液制备精密称取无水葡萄糖对照品约12mg，置于25mL量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，即得。
(2)标准曲线的绘制精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于25mL量瓶中，蒸馏水定容。分别精密量取上述对照品溶液5份各ImL于IOmL具塞试管中，分别加5% (质量体积比)苯酚溶液I. OmL，摇匀后加入浓硫酸5. OmL，摇匀后沸水浴lOmin，取出置于冰水浴中冷却放置至室温。以试剂空白为参比在485nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，如图5所示。(3)样品溶液的制备精密称取实施例I制得的多糖样品约30mg，置于IOmL离心管中，加80% (体积比)乙醇溶液8mL,超声振荡60min, 3000rpm离心15min,弃去上清液，残渣用80% (体积比)乙醇洗涤2 3次，加入8mL沸水于离心管中，超声60min溶液样品，冷却后转移至IOmL量瓶中，少量蒸馏水洗涤离心管，洗涤液合并至量瓶中，蒸馏水定容至10mL。摇匀过滤，取续滤液lmL，至25mL量瓶中，加水定容，即为供试样品溶液，按标准曲线制备项下操作，由标准曲线计算供试品中多糖含量。3、测定结果
样品中以葡萄糖计多糖含量为48. 45% (n = 2)。实施例5 :采用离子色谱(ICS 3000)测定大蒜总多糖水解后单糖的含暈I、仪器与试剂色谱柱CarboPacPA20 分析柱，150*3mm，S/N 002823 ；CarboPac PA20 保护柱，50*3mm, S/N 002652检测器脉冲安培检测器，Au电极，S/N 0050150糖四电位波形淋洗液组成及流速EG产生ImMKOH，0. 45mL/min自动进样，IOuL2、实验方法取实施例I制得的样品IOmgJ 2mL浓度为2moL/L三氟乙酸溶液，密闭后80°C下水解4小时。放至室温后，静置I小时，精密量取上清液lmL，置于50mL茄形瓶中，50°C减压蒸干。残余物加50mL去离子水，超声IOmin溶解后过0.22 滤膜及RP柱，进样分析。上述溶液再稀释10倍，供测定含量。3、测定结果实验结果如表I所示。表I离子色谱(ICS 3000)测定大蒜总多糖水解单糖结果
单样品杲糖* 葡萄糖*阿拉伯糖半乳糖木糖甘露糖合计糖 I 49.46% 7.20% 0.11% 0.13% 0.18% 0.13% 57.21%含 2 48.37% 4.09% 0.43% 0.60% 0.14% 0.10% 53.73%量 3 50.30% 4.58% 0.45% 0.77% 0.19% 0.13% 56.29%*其中葡萄糖和果糖含量为稀释10倍的结果实施例6 :大蒜有效部位对大鼠脾淋巴细胞增殖影响的WST检测I、材料(I)受试药物实施例I制得的大蒜不同部位提取物1#(大蒜油)、2#(大蒜总多糖)、5# (大蒜总皂苷)、2#+5# (大蒜总皂苷和大蒜总多糖提取分离后按I : I混合样品)(2+5) # (大蒜总多糖和大蒜总皂苷未经分离样品)，由中国中医科学院中医基础理论研究所制备并提供，上述样品以DMSO(二甲基亚砜)溶解，实验前配制；阳性药物ConA(ConcanavalinA,刀豆球蛋白 A, Sigma 公司);(2)动物SD大鼠，雄性，体重(180±10)g，清洁级动物，实验动物室提供；(3)试剂淋巴细胞分离液(Sigma公司)、RPMI1640培养基(GIBC0公司)、胎牛血清(GIBC0公司)、DMSO (Sigma)等，购自北京奥信拓普科技有限公司；快速细胞增殖检测试剂盒(Bio-Vision 公司);(4)仪器全自动酶标仪，Thermo MK-3 ；C02培养箱，Revco 300T ;倒置显微镜，0LYMPUS-IMT-2 ;洁净工作台，BCN-1360B型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf ;台式高速离心机TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，CP64上海奥豪斯公司。 2、方法麻醉SD大鼠，取出脾脏，将脾剪碎成单细胞(取上清液)缓慢加入预先已加入淋巴细胞分离液的离心管中，脾悬液与分离液的比例为I : I。在4°C下以2000r/min离心20min，液相分为三层，用微量进样器抽取中层淋巴细胞放入无菌的离心管中，用PBS(Phosphate Buffered Saline,憐酸盐缓冲液)洗漆2次，每次均以2000r/min离心lOmin，弃上清液，用少量RPIM1640培养液(含10%血清)打散，用血细胞计数板统计调节细胞初始浓度至I X 106/mL,取100 ii L加入96孔培养板，于37°C的5% CO2培养箱中培养24h。将实施例I制得的不同质量浓度的药物1#、2#、5#、2#+5#、(2+5)#和阳性药物各 IOOii L 加入实验孔，使终浓度分别 I. 25,0. 625,0. 3125,0. 156,0. 078,0. 039,0. 0195、0. 0098和0. 005mg/mL，并同时设立空白对照组和阳性对照组，空白对照组加入100 y L无菌生理盐水，在阳性药物对照组中加入100 i! L的ConA (终浓度为5 u g/mL)，每一浓度设3个复孔，培养48或72h。每孔加入5mg/mL的WST溶液(按照快速细胞增殖检测试剂盒说明书配制，即把5毫升电子耦合试剂加入到WST-I粉末中，完全溶解)20 ii L，继续培养4h，在酶标仪于450nm波长读取各孔吸光度(A)，以A值反映淋巴细胞增殖率，结果见表2。3、实验结果从表2可见，与对照组比较，大蒜总多糖、大蒜总皂苷的组合物(2+5) #、2#+5#对大鼠T淋巴细胞增殖具有明显的促进作用(p< 0.01)，其中(2+5)#促增殖作用更为明显(p<0.001)。结果表明，(2+5)#和(2#+5#)样品对大鼠T淋巴细胞增殖具有明显的促进作用。表2大蒜成分对大鼠脾淋巴细胞增殖(A)影响的WST检测
A 值0.625mg/mL0.156mg/mL0.039mg/mL0.0098mg/mL
~1#(大蒜油)0. 398 + 0. 004 0. 404 + 0. 019 0. 399 + 0. 013 0. 395 + 0. 005
2#(大蒜总多糖) 0. 383 + 0. 004 0. 409 + 0. 018 0. 411 + 0. 006 0. 401 + 0. 0055#(大蒜总皂苷) 0. 576 + 0. 029 0. 451+0. 017 0. 425 + 0. 005 0. 414 + 0. 005~(2+5)#~0.637 + 0.009**0.660 + 0.021** ~O. 644 ± O. 062** ~O. 466 + 0. 025*
2#+5#O. 591 + 0.015*0.462 + 0.013* 0.465 + 0.003*0.456 + 0.014*
ContO. 427 + 0. 008
ConA(5u g/mL)O. 603 + 0. 054注与对照组比** :p < O. 001，* :p < O. 01实施例7 :包含大蒜油、大蒜总皂苷和大蒜总多糖的组合物对肿瘤细胞生长抑制作用的研究I、材料(I)受试药物与阳性药物受试药物实施例I制得的大蒜不同部位提取物1#(大蒜油)、2#(大蒜总多糖)、5#(大蒜总皂苷)由中国中医科学院中医基础理论研究所制备并提供。2#以DMEM (Dulbecco; s Modified Eagle Medium)溶解，1#、5# 先以 DMSO 溶解，再用 DMEM 溶解后，以O. 22 μ m的过滤器过滤,分装_20°C保存。阳性药顺钼由齐鲁制药有限公司生产(批号905011CF)。(2)胃癌细胞株MKN45细胞购于北京协和细胞资源中心；AGS、HGC_27细胞购于中国科学院上海生命科学研究所。(3)试剂=RPMI 1640 培养基(GIBC0 公司 lot8109038) ;DMEM、Ham，s F12 培养基(Thermo 公司);胎牛血清(GIBC016000 公司);胰蛋白酶(Solarbio 公司)；MTT (Sigma)；DMSO(Sigma)等，购自北京奥信拓普科技有限公司。(4)仪器全自动酶标仪，Thermo MK-3 ；C02培养箱，Revco 300T ;倒置显微镜，0LYMPUS-IMT-2 ;洁净工作台BCN-1360B型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf ;台式高速离心机TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，CP64上海奥豪斯公司。2、实验方法(I)细胞培养方法MKN45细胞用含10% (体积比)新生牛血清的1640完全培养基培养、AGS用含10% (体积比)新生牛血清的Ham’s F12培养、HGC-27细胞用含10% (体积比)新生牛血清的DMEM培养，(培养液中含有NaHC03. 2g，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素)，在37°C的5% CO2培养箱中培养至细胞覆盖率80 90%以上时传代，选取生长状态良好的细胞用于实验研究。(2)MTT法(张均田主编，现代药理实验方案，北京医科大学中国协和医科大学联合出版，1998年10月北京第一次印刷，P819)测定大蒜不同部位提取成分对胃癌细胞增殖的抑制并测定药物半数抑制浓度(IC50) 收集对数生长期MKN45、AGS、HGC-27细胞，以2 X IO4/孔的密度加入96孔板，每孔100 μ L。将不同质量浓度的药物各100 μ L加入实验孔，1#的终浓度分别为2. 5、I. 25、O.625,0.3125,0.156,0.078,0. 0395,0. 0198,0. 0099,0. 0049,0. 00248,0. 00124,0. 00064、O. 00032、0· 00016mg/mL，2#、5# 的终浓度分别 10、5、2· 5、I. 25、0· 625、0· 3125、0·156、O. 078,0. 0395,0. 0198,0. 0099,0. 0049mg/mL，并同时设立空白对照、阴性对照组和阳性对
照组，阴性对照孔接种等量细胞，并加入含终浓度为0.1% (体积比)的DMSO的完全培养液；空白孔不接种细胞，只加入等量完全培养液；顺钼作为阳性对照组，其剂量按临床用量换算，终质量浓度为 25、12. 5,6. 25,3. 125、I. 56,0. 78,0. 04,0. 02 μ g/mL。每一浓度设 3 个复孔，培养 48h。每孔加入 5mg/mL 的 MTT 溶液(四氮唑(3-(4, 5-dimethylthbm) l-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,以 PBS 稀释成 5mg/mL) 10 μ L,继续培养 4h,去上清，每孔加入200yL的DMS0，震荡溶解lOmin，室温下放置lOmin，在酶标仪570nm处测光密度(OD)值，计算细胞抑制率，绘制细胞增殖抑制曲线并测定药物半数抑制浓度(IC50)。计算细胞抑制率的公式细胞抑制率(％ )=(阴性对照组OD值-实验药物组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)X 100% ;以药物浓度为 横坐标、存活率为纵坐标绘制浓度效应曲线，求出回归方程，得出抑制50%细胞生长的浓度(IC50)，实验结果见表3-7。表3大蒜有效部位对人胃癌MKN45细胞杀伤作用的半数杀伤浓度(IC50)
药物分组IC50(mg/mL)~
1#(G0/ 大蒜油)O. 026
2#(TPG/大蒜总多糖) Γ665#(TSG/大蒜总皂苷) 0 37结果表明，1#、5#样品对肿瘤细胞的杀伤作用较强。表4大蒜有效部位对人胃癌MKN45细胞增殖的影响(抑制率％ )
抑制率(％ )lOmg/mL2. 5mg/mL0.625mg/mL
~1#(G0)89Γθ89 3τΓβ
2# (TPG)7δΤ2iH3 Γ9
5#(TSG) Γδ100.0θ Τθ结果表明，5#、1#样品对肿瘤的抑制作用较强。表5大蒜有效部位对MKN45、AGS、HGC、HeLa、!fepG2细胞杀伤作用的半数杀伤浓度(IC50)的对比


本发明提供了一种大蒜油、大蒜总多糖、大蒜总皂苷为原料组成的组合物，该组合物集大蒜水溶性、脂溶性有效成分于一体，使大蒜防癌抗癌的活性得到充分的发挥，该组合物具有良好的抗肿瘤活性，具有扶正祛邪、减毒的作用，应用前景广阔，可制成疗效显著且毒副作用小的肿瘤防治药物或保健品。本发明还提供了制备所述组合物的方法，将大蒜经双提，得大蒜油；药渣经水提醇沉，得大蒜总多糖；药渣经醇提，过大孔树脂纯化，得大蒜总皂苷。该制备方法操作简单，充分利用大蒜原料的每一部分，成本低廉，质量可控，能够产业化。