专利名称：一种梨叶片诱导不定芽再生植株的方法梨是蔷薇科(Rosaeeae)梨亚科(Maloldeae)梨属(Pyrus)植物，为乔木落叶果树，共有20余种。分布在世界各国的梨可归于两个类型东方梨和西洋梨。东方梨起源于我国，也称中国梨；西洋梨原产于欧、亚，是欧美国家的主要栽培品种。梨果不仅形美色艳、肉质细软或酥脆，汁液丰润、香甜爽口，而且具较高的营养价值，梨果除可鲜食外，还可制作梨脯、梨膏、梨干、酿酒、制醋等，而且还有很高的医疗价值，其性寒味甘，具清热润肺、止咳祛痰之功。另外，梨木质地细腻坚韧，花纹美观，是建筑、制造家具和雕刻、印刷等的优良用材，可作为用于家具制作和纺织业的工业原料。 梨是栽培历史悠久的果树之一，寿命长、产量高、果实营养丰富，而且具有止咳化痰、润肺清火、助消化、解疮毒等医疗作用。梨同其它农作物一样，在生产中常会遇到病虫侵袭，造成果实大量减产。目前，主要的病虫害有梨火疫病、黑星病、白粉病、黄叶病、轮纹病等，妨碍了梨的发展，使梨的产量严重降低。生产上迫切需要抗性较强的砧木和品种。研究减少病虫害损失成为农业生产的重点。传统上病虫害防治主要采用化学试剂，化学试剂造成生态破坏、环境污染，并使各种病原产生了抗药性，现已不能满足要求。研究培育抗性品种，提高作物自身的抗病性是减轻病虫危害的一个新途径。但是木本果树童期长、自交不亲和、杂合程度高，而且往往缺乏理想的亲本资源，进行常规杂交育种改良品种相当困难。基因工程的兴起为弥补传统育种的不足提供了可能性。它是在体外定向地进行基因重组和基因改造，通过离体再生实现基因从一物种向另一物种转移，从而打破物种之间的天然屏障。且当期望性状引入现有品种的同时，不会出现基因的大量重组，也避免了童期的干扰。采用生物技术手段进行果树品种改良应用最多的一是抗病基因的遗传转化，二是染色体组加倍培育多倍体。进行这些工作的前提首先是体细胞不定器官再生已获得成功。而且转入有价值的外源基因成功的关键环节是建立稳定、高效的叶片不定梢再生体系。经叶片再生植株一直是组培上的难题，叶片分化不定梢的报道极少。目前，仅在西洋梨和某些砧木上初步建立离体器官再生体系，东方梨再生体系的报道较少，迄今尚未见利用东方梨叶片再生植株的报道。但是，在西洋梨上，早在1988年，Laimer等用西洋梨康弗伦斯(Conference)试管苗叶片做实验,在BA和IBA的配合下,部分愈伤组织能够形成球状结构，但仅有少量球状结构转化成不定芽。此后，Abu-Qaoudt> Chevreau> Predierit等相继以几种梨试管苗叶片为材料并成功诱导出不定芽，但再生率不高。另外，梨的叶片培养与转基因研究范围较窄(主要集中于西洋梨梨)，转化品种有限，因而，在西洋梨研究的基础上，应加强对东方梨的研究。在培养方法、培养基设计上要利于不定梢的诱导和转化细胞的生长与植株再生。虽然有部分报道叶片再生率较高，但叶片再生率普遍较低，仍是梨叶片组织培养急需解决的问题。砂梨作为我国南方的主要栽培品种不仅资源品种多，分布广，而且早实性较强、抗热、抗火疫病能力强。本发明旨在研究影响梨叶片不定芽再生的因素，为从梨叶片体细胞再生不定芽中筛选同质多倍体及遗传转化改良品种奠定基础。三
本发明的目的是提供一种梨叶片不定芽再生诱导的方法，直接用试管苗叶片作为外植体，取材简单方便。梨叶片不定芽再生诱导的方法，通过如下步骤实现(I)选取试管苗健康幼嫩的叶片，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切2 4个伤 口，叶片背面朝下接种于不定芽诱导培养基上，暗培养2(T32天后转到光下培养；培养温度25±2°C ;所述的不定芽诱导培养基为NN69+TDZ I. 0 3. Omg/L+IBA 0. 2 0. 5mg/L+蔗糖30 50g/L+ 琼脂 5. 0 6. 5g/L, PH 值为 5. 8 ；(2)待叶片长出不定芽后，将不定芽转接到增殖培养基上，在光照强度1500-20001x,光照iri8h/d，温度25±2 °C的培养条件促进其抽茎生长，从而获得茎干粗壮的试管苗；所述的增殖培养基为1/2MS+6-BA1. 0 2. 0mg/L+IBA0. 2 0. 5mg/L+GA3I. 5 3. Omg/L+ 蔗糖 25 40g/L+ 琼脂 5. 0 6. 5g/L，培养基 pH 值为 5. 8 ；(3)待试管苗长到2. 5 3. 5cm将苗接到生根培养基中，暗处理疒IOd后再转光下培养，50-60天后得到生根苗；所述的光下培养条件为光照强度1500-20001X，光照14 18h/d，温度 25 ±2 °C;生根培养基为1/2MS+IBA 0. 5 0. 9mg/L+ 蔗糖 50 70g/L+ 琼脂 5. 0 6. 5g/L，培养基pH值为5.8。步骤(I)优选选取试管苗健康幼嫩的叶片，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切2 4个伤口，叶片背面朝下接种于不定芽诱导培养基上，暗培养2(T32天后转到光下培养；培养温度25±2°C;所述的不定芽诱导培养基为NN69+TDZ 2. Omg/L+IBA 0. 3mg/L+蔗糖40g/L+琼脂 6. 0g/L, PH 值为 5.8。步骤(2)优选待叶片长出不定芽后，将不定芽转接到增殖培养基上，在光照强度1500-20001x，光照16h/d，温度25±2°C的培养条件促进其抽茎生长，从而获得茎干粗壮的试管苗；所述的增殖培养基为l/2MS+6-BAl. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+GA32. 0mg/L+ 蔗糖 30g/L+琼脂6. Og/L,培养基pH值为5. 8 ;步骤(3)优选待试管苗长到2. 5^3. 5cm将苗接到生根培养基中，暗处理7 IOd后再转光下培养，50-60天后得到生根苗；所述的光下培养条件为光照强度1500-20001X，光照14 18h/d，温度25±2°C ;所述的生根培养基为1/2MS+IBA 0. 6mg/L+蔗糖60g/L+琼脂6g/L，培养基pH值为5.8。有益效果组织培养技术的成功不仅取决于植物本身的遗传特性，还需要适宜的培养基种类、激素种类及浓度、以及适宜的培养温度、光照等条件；不同植物品种对组织培养条件的要求不同，本发明是通过多年试验研究，通过对比MS、1/2MS、NN69三种基本培养基(NN69基本培养基最适宜于梨叶片诱导再生，再生率为66. 67%)、不同激素组合(对比了 BA、IBA、TDZ、NAA这几种激素对叶片再生的影响，其中TDZ与IBA组合对叶片诱导最佳)、不同蔗糖浓度(设蔗糖浓度0、30、40、50、60g/L，其中蔗糖浓度为40g/L时，叶片再生率最高，为33. 0%)及暗培养时间(暗培养0、7、14、21、28天，其中暗培养21天，叶片再生率最高，可达31. 7%)对梨叶片诱导再生的影响，从而优化了梨叶片不定芽诱导再生植株的条件和培养基，成功的实现梨叶片不定芽诱导再生植株。该方法取材方便，操作简单，可以有效提高梨组织培养获得再生植株的效率，快速的建立起稳定、高效的叶片再生体系，有效的解决了梨叶片不定芽再生诱导的技术问题，从而为通过抗病基因的遗传转化和染色体组加倍培育多倍体这两种手段达到改良果树品种提供前提条件。图1A、B为外植体诱导的丛生芽；A 3周左右后少部分叶片切口处开始出现不定芽；B :4周左右大部分叶片切口出现不定芽。图2为外植体诱导的丛生芽；增殖培养中，不定芽迅速生长情况。图3为诱导不定芽生根。A :不定芽生根得到的完整植株；B :暗培养一周左右转光·下培养5周得到粗壮的根。


本发明属于植物细胞工程领域，涉及一种梨叶片诱导不定芽再生植株的方法。采用试管苗幼嫩的叶片作为外植体，在超净工作台上，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切2～4个伤口，然后接种在不定芽诱导培养基上，暗培养3周左右后转到光下培养，待其长出不定芽后转到增殖培养基上，以促进芽的生长；待不定芽长到2cm左右，将其转接到生根培养基中培养，从而获得完整植株。本发明的方法操作简单，成本低廉，效果良好，可以快速的建立起稳定、高效的叶片再生体系，有效的解决了梨叶片不定芽再生诱导的技术问题，从而为通过抗病基因的遗传转化和染色体组加倍培育多倍体这两种手段达到改良果树品种提供前提条件。