专利名称：为再生而制备的无细胞有机组织及其生产方法为再生而制备的无细胞有机组织及其生产方法 说明书_2] 发明的本发明涉及用于制备用于再生(revitalization)(尤其是用于引入活细胞)的人 或动物来源的无细胞有机组织(acellular organic tissue)的方法,其包括为无细胞有机 组织的表面提供多个孔的阶段，所述多个孔朝向所述组织内部延伸，其中所述多个孔由一 个或更多个针产生。本发明还涉及所制备的用于再生(尤其是用于引入活细胞)的人或动物来源的无 细胞有机组织，其包含孔，所述孔是用电针产生的刺孔(puncture)，并且从所述组织的表面 朝向其内部延伸。现有技术医学界中(且更具体地说，在外科领域中)公知，能够使用可植入活体的组织是日 益重要的，以满足更换器官的一部分或完整器官的不断增长的需要。在实验室中制备并且随后植入宿主(无论是动物或是人)中的生物代用品的生产 属于医疗技术，并且被称为组织工程。根据已知的技术，在实验室中通过将细胞插入到由无机支持物(通常称为“支架 (scaffold) ”)组成的基质中来进行要移植之组织的制备。被插入以替代要被治疗器官中缺损的所述“支架”有利于细胞的三维组织 (organization),直至组织(tissue)完全形成。显然，所述支架必须发生降解过程，直至完全消失，并且被再生的组织所替代，所 述支架中植入的细胞有助于该过程。可用人工支架和可源自人和动物的天然支架(来自“供体”)来获得用该系统所获 得的植入物，例如食管壁。很多出版物论述人工组织，且其中以下出版物可值得一提Tiaw K. S. et al. in " Laser surface modification of poly (epsilon-caprolactone) (PCL) membrane for tissue engineering applications" (Biomaterials 26 (2005)763-769)； Tejas S. Karande et al. in " Diffusion in Musculoskeletal Tissue Engineering Scaffolds Design Issues Related to Porosity, Permeability, Architecture, and Nutrient Mixing " (Annals of Biomedical Engineering, Vol. 32, no.12, December 2004, p. 1728-1743) ；Tejas S. Karande and C. Mauli Agrawal in " Functions and Requirements of Synthetic Scaffolds in Tissue Engineering" (" Nanotechnology and Tissue Engineering The Scaffolds " , 2008CRC Press, Taylor&Francis Group, 6000Broken Sound Parkway NW, Suite 300，BOCA RATON, FL 33487-2742USA，p. 53-86)； Curtis D. Chin et al. in" A microfabricated porous collagen-based scaffold as prototype for skin substitutes" (Biomed Microdevices(2008)10 :459_467)。所描述的合成组织具有人工产生的结构多孔性，可以以预先确定的方式配置以在组织内部获得足够的迁移。仅最近的出版物提及这样的陈述圆柱形孔(在多孔组织中连续制成)有助于充 分地改善细胞穿透。人或动物来源的支架已经具有有机组织的天然多孔性，其具有类似海绵之孔的均 匀外观。为了能够使用源自供体的支架并随后将其植入人，必需事先以这样的方式处理组 织，以完全清除结缔组织纤维之间所存在的所有细胞，并连续地重新引入属于宿主的人细 胞，以避免排斥反应。用于制造支架(即始于从供体中取组织的无细胞基质)的技术是已知的并因此将 不在本文中详尽地描述，因其基本在于将要处理的组织浸入含有酶物质的液体中，所述酶 物质能够消化和破坏组织中所包含的活细胞，而同时保持结缔组织纤维完整。一旦已获得准备好接受取自宿主之细胞的人或动物来源的无细胞组织，将所述组 织或支架置于所谓的“培养皿(Petri capsule)”(每个生物实验室中使用的小容器，将要 再生的组织被放置在其底部)中或放置在类似的装置中。通过引入培养在培养基中的宿主干细胞而进行再生，所述培养基使细胞获得营 养、存活、增殖和扩散。实质上，开始时位于组织上表面的干细胞移动通过所述组织上表面的天然间隙， 所述间隙之前被供体的细胞所占据。给定的时间间隔之后，在受控的温度下以及在培养基中所含有的营养物质存在 下，活细胞在组织的间隙中重新定位，这使得所述组织准备好被植入宿主的器官中。可注意到的是，一般来说，用于再生支架的细胞是干细胞，其将会或者已经分化， 并且将承担将要植入再生组织之器官的特定功能。植入经所述处理之组织的成败取决于所 述组织内部细胞的毛细扩散。如果所述扩散难以发生或者浅表而不深入，所移植的组织不能被再生并倾向于坏 死，这意味着移植将会失败。上文中清楚地显示要满足的几乎不能放弃的关键和重要条件是组织在其所有部 分中尤其是在其全部深度上深入再生。目前，即便制备和再生处理发生足够长的时间，也不能获得确保成功移植的某些结果。这是由于必须在支架中植入之活细胞的穿透不充分深入。实际上，该缺陷大幅限 制制备适于移植之组织的可能性，因为不能被深入穿透的非常厚的组织在移植之后无法完 全再生。因此，显而易见的是，上文中所描述的技术仅适于移植厚度非常有限(例如，不超 过约0. Imm)的组织。为了克服该缺陷，以本申请人的名义提交的文件WO 2008/146106A2描述了 这样的方法，根据该方法，为无细胞有机组织提供孔，以有利于细胞扩散通过全部组 织。专利US 5，112，354描述骨部分的穿孔(perforation),其意在提高暴露于脱矿质剂 (demineralizing agent)的表面，并且有利于与为了骨诱导而引入的间充质细胞相互作用。根据所述文件，尽管与传统技术相比有大幅的改进，制备以引入细胞为目的的简单组织穿孔仍然花费相对长的时间以达到细胞的均匀穿透，尤其是在非常厚和延伸的组织 的情况中。因此，从细胞在组织内部迁移的角度来看，人或动物来源组织的天然多孔性连同 按照文件WO 2008/146106A2中的描述所制成的孔还不是最佳的。
本发明的目的是提供人或动物来源的无细胞有机组织及其生产方法，所述无细胞 有机组织很容易被活细胞所定植，并且能够克服上述缺陷。更具体地说，本发明的目的是提供无细胞有机组织，这样当用干细胞再生所述组 织时，与现有技术相比，所述细胞更易于进入和穿透结缔组织纤维所形成的网中的每一个 间隙，以基本重现失活之前组织的状况。本发明的另一个目的是当引入意在制备用于移植之组织的活细胞时，在再生无细 胞支架所必须的处理时间上获得更明显和大幅的降低。因此，本发明的一个目的是开发用于产生无细胞有机组织的方法，所述无细胞有 机组织是以改进的形式制备的，用于均匀和快速地引入再生的细胞。本发明的一些目的是通过开篇时所描述类型的方法实现的，其中从组织的外部表 面朝向所述组织内部延伸的孔至少部分相交，因此形成至少部分彼此相连通的孔。换句话说，可用本发明方法获得的组织具有多个孔，并且单个孔沿其延伸与一个 或更多个其他孔相连通，因此形成网状结构。相连通之孔构成的网大幅升高填充再生细胞 的速度。此外，所述网状结构有利于细胞的均匀扩散。在最简单的情况下，所述相连通的孔是基本直的，用针通过所述组织的外部表面 产生，以使所述孔相交。还可考虑使用弯针。现有技术中提及的文件均未公开增强属于组织结构多孔性之孔的互连孔。相反， 论述人工组织的文献考虑结构孔隙率(并且仅在一种情况(Curtis D. Chin的文章)中，进 一步应用彼此分开的圆柱形孔)要在可获得的细胞穿透程度上得以满足。以这样的方式产生根据本发明提供的孔其深度至少部分地延伸进入所述组织的 厚度，但优选延伸进入所述组织的几乎整个厚度，在一些具体的情况中，延伸进入所述组织 的整个厚度。优选在与穿孔的表面相反的一侧保留薄的非穿孔层，以阻止所引入的细胞流出。有利地，所述孔沿其所有侧均匀地延伸通过整个组织。可用针和多种方法通过要处理之组织的厚度来产生所述孔，前提是所述孔的实施 不引起所述孔附近之结缔组织的任何变质或改变(撕裂、坏死、厚度降低或升高、液体含量 的改变、凝固)，并且在任何情况下不引起支架整体的变质或改变。根据本发明的一个尤其有利的实施方案，所述组织还具有与所述孔的至少一部分 相连通的储藏腔(reservoir cavity)。所述储藏腔可被认为是凹槽(recess),即作为要被 引入所述组织之细胞的储备库，与体内的细胞储备库(例如，肠的上皮细胞储备)相当。如果要被引入所述组织的细胞不再简单地施加在组织的表面，而是还引入在所述 组织中产生的与所提供孔的至少一部分相连通的储藏腔中，则可进一步改善细胞分布的均 匀性并且进一步加速所述细胞穿透整个组织。对于施加至组织(并且引入所述储藏腔)的细胞，生成与所述孔至少一部分相连 通的储藏腔升高了孔的网之进入点的数目。有利地，所述储藏腔在组织的表面上以使所述组织更易于被细胞所填充，即确保 所述细胞易于进入。所述储藏腔优选均匀地分布。在任何情况下，所产生之孔的直径必须足以使细胞易于进入所述孔并使周围的组 织再生。对于细胞的大小，其直径应当至少为50iim。还必须根据维持所述组织之结构完整性的需要而进行直径的选择，同时确保快速 穿透和完全填充所述孔。可在产生所述孔之前或之后制备所述储藏腔。优选在生成所述储藏室腔之后施加通道以确保组织的稳定性。所述储藏腔是基本圆柱形的，直径高至约1mm。具有700 ii m至1mm直径的储藏腔 尤其适合该目的。可作为用具有合适直径的相应的针所产生的孔而很容易地生成所述基本 圆柱形的储藏腔。很明显，所述储藏腔的直径必须不削弱所述组织的结构。所述储藏腔的 直径应当大于连通它们的通道的直径，这样所述储藏腔可充当细胞储库，并且所述通道不 进一步转化为其他储藏腔(这削弱组织本身的结构)。储藏腔的深度取决于组织的特征，并 且本领域技术人员可根据需要很容易地对其进行优化。这同样适用于通道与储藏腔之间的距离。甚至可考虑单个储藏腔之间约200 的距离，以及更长或更短的距离。必须根据在穿透速度和组织稳定性上的需要来选择理想的距离。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述孔具有彼此不同的直径。这同样适用 于所述储藏腔，其甚至可在所述组织内部具有不同的直径。必须通过在升高穿透速度(这 当然随直径的升高而升高)和避免由于过多穿孔而削弱组织结构之需要之间的折中来确 定直径分布的选择。改变组织内部孔直径的可能性提供了调节加速的穿透与组织稳定性之 间平衡的更高灵活性。为了有效地避免孔和/或储藏腔之形成过程中的坏死问题，所述多个孔和/或储 藏腔优选地用与电源相连的一个或更多个金属针产生，所述电源引起每个针的尖端通过这 样强度和波形的电流以供应一定量的能量，所述能量足以打开临近所述针的所述尖端的连 接所述有机组织的分子的键，例如已在所提及的文件WO 2008/146106A2中描述的那样。通过这种方式，每个孔是所述针的尖端进入打开所述分子的键而留下的空间并产 生所述孔。应当理解的是，还可以以其他方式产生所述孔和/或所述储藏腔，例如机械地产 生。对于组织中所制成的孔/储藏腔的品质来说，通过向每个针的尖端应用高频电压 (通常为4MHz)产生弱的但却足以打开结缔组织之分子之间的键的电流流通而获得最佳结 果，以使孔不破坏所述分子本身。优选使用带电(上文中所指定的具有4MHz波频率的电 压)的针产生所述孔和/或储藏腔。所述电压优选为200 230伏。有利地，所应用的正 弦电压波是失真正弦波，因此具有至少一次、二次和三次谐波。优选地调节每个针的尖端上可获得的电流以使其包括在2至2. 5mA之间。符合逻辑并且显而易见的是，产生多个相交的孔意味着产生所移植细胞进入组织 深部的新通道，这确保所述组织本身的完全再生。用于再生的无细胞有机组织的制备可包括引入多种材料(例如，清洗溶液、营养 溶液、不同类型的细胞(例如，来自不同供体或不同类型的自体细胞，要分化或已分化的细 胞)等)的步骤。有利地，在吸入系统(suction system)的辅助下将这些材料引入所述孔 中，所述吸入系统包含适于协助所述材料进入所述孔的驱动装置(drive mechanism)。所述吸入系统可由蠕动泵组成。根据本发明所制备的用于再生的组织如同可沿所 述孔渗透液体和细胞的海绵。在组织具有通孔并且因此在穿孔表面的对侧不具有非穿孔之 层的情况中，在生物可降解的膜上安排所述组织，所述膜具有液体可穿透但细胞不可穿透 的微孔，因此阻止细胞在吸入阶段流出。有利地，使用根据控制系统移动和倾斜的针或针阵列产生所述孔，所述控制系统 由确保以预先确定的密度形成孔相交的算法所操控，即形成确定数目的孔之间彼此相交的 点。上文中描述的方法可用于所有类型的有机组织。可用适于将来使用组织的所有类 型的细胞来再生具有相连通之孔的无细胞组织。本发明的组织几乎不限制要移植之组织的厚度，因为可使相连通的孔存在于所述 组织的整个厚度和整个表面，这确保完全再生。这是由于这样的事实要重新引入到无细胞 支架(优选进入存储腔)中的活细胞可达到所述组织的每个部分。本发明还包括为再生(尤其是用于引入活细胞)而制备的人或动物来源的无细胞 有机组织，其包含用针产生的并且从所述组织的表面朝向其内部延伸的穿孔，其中所述孔 至少部分地相交并且因而至少部分地彼此连通。根据上述方法的一些变化形式，所述组织还可包含储藏腔。根据本发明制备的所 述组织中的孔和/或储藏腔具有上文中描述的特征以及尤其是直径、深度和距离。本发明的结构变化形式是所附权利要求书的主题。在作为非限制性实例而提供的 本发明的优选实施方案的描述中，将会更详细地强调本发明的另一些特征和细节。附图简述现在参照附图举例说明本发明，其中-
图1显示为再生而制备的具有相连通之孔的无细胞有机组织的截面示意图；-图2显示为再生而制备的具有储藏腔和孔的无细胞有机组织的顶视图；-图3显示图2的组织沿图2的III-III线的截面。



本发明涉及用于制备用于再生(尤其是用于引入活细胞)的人或动物来源的无细胞有机组织的方法，其包括为无细胞有机组织(2；12)提供多个孔(4；14)的阶段，所述多个孔(4；14)通过其表面(8；18)产生并朝向所述组织(2；12)内部延伸，其中所述多个孔(4；14)由一个或更多个针产生。所述孔(4；14)部分相交，从而形成彼此部分连通的孔(4；14)。本发明还涉及所制备的用于再生(尤其是用于引入活细胞)的人或动物来源的相应的无细胞有机组织(2；12)，其包含孔(4；14)，所述孔是用针产生的刺孔，并且从所述组织的表面(8；18)朝向其内部延伸。所述孔(4；14)至少部分相交并且因此是彼此部分连通的孔(4；14)。