专利名称：一种克隆无动物成分的人胚胎干细胞的方法一 状况第一个未分化的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES细胞)系是1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman将延迟附植的胚胎进行培养，从4-6天的囊胚内细胞团分离而得。1994年，Wheeler和Robert等分离获得了猪的ES细胞。直到1998年美国威斯康星大学Thomson和以色列Rambam医学中心ItskovitxEldor等从人体外受精囊胚中分离到了ES细胞。同年约翰霍普金斯大学的Shamblott等从人原始生殖细胞中分离获得人的全能性干细胞。1997年英国科学家应用核移植克隆胚胎技术，培育出了世界上第一只体细胞克隆绵羊-多利。此技术的成功极大的促进了克隆人胚胎干细胞研究。ES细胞具有全能性，且增殖能力强、分化潜力巨大，可在体内外定向诱导分化为各种细胞、组织和器官，用于替代、修复病损的细胞、组织和器官。治疗目前不能治疗的许多疾病。近期的美国《科学》杂志上列出了2002年值得关注的六大热门科技领域，干细胞研究位于首位，未来抢占生命科学制高点的将会是干细胞组织工程技术。自上世纪90年代以来，科学家开展ES细胞分离与定向培养方面的研究发现不论是来自于动物或人类的ES细胞，在体外都能定向分化为各种细胞，如内皮细胞、血液细胞、神经细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肝脏和胰岛细胞等。ES细胞可在体内外诱导分化为机体所有的组织和器官需要的干细胞。干细胞功能新概念的形成和新技术的产生和发展，将为血液病、心血管病、恶性肿瘤、神经系统疾病、糖尿病以及其它需要组织修复和干细胞移植治疗的疾病带来新的治疗希望。可是由于ES细胞来源困难及在体外分化诱导中不易控制，因而影响了采用ES细胞作为细胞和组织修复治疗的前景。细胞、组织、器官移植性治疗是个性治疗的原则，异种、同种异体干细胞用于临床会引起免疫排斥反应。其主要原因是组织相容性复合体(MHC)不同。因此干细胞的来源与数量是细胞治疗最关键的问题，干细胞组织工程技术的发展和完善，将使人们能用上自己基因的干细胞或干细胞衍生的新组织器官，来替代病变或衰老的组织和器官，治疗目前不能治疗的多种疾病。所以，目前开发一种能提供相同组织特异性的人胚胎干细胞的技术势在必行。为此克隆人自体基因的ES细胞诱导定向目的干细胞分化移植治疗，或克隆人组织、器官工程是解决细胞、组织移植治疗的根本，是21世纪国际研究焦点。目前国际上有牛、兔、绵羊类ES细胞系培养成功的报道。韩国报道采用牛卵作为人体细胞核转移的受体细胞，可以得到人胚胎干细胞。我国的中山医科大学陈系古教授等先后使用“核移植”技术将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过2000多次试验，成功克隆出100多个人类胚胎，其中部分发育到“桑椹胚”阶段。采用牛卵和兔卵作为受体细胞克隆人ES细胞，虽然存在卵细胞来源相对丰富，易于获取等优点。但用动物细胞作为受体细胞克隆的人胚胎干细胞含有动物成份，用于人类疾病的治疗有一定危险。本发明建立了一种用人体细胞，经与人卵母细胞的核置换构建自体基因的人胚胎干细胞克隆技术。该方法首先建立人体细胞系，将体细胞核移植到去核的人卵母细胞中，在体外将胚胎细胞培养发育至囊胚。这些胚胎干细胞及其衍生的细胞和组织进行自体移植，移植后不会产生免疫排斥反应。该发明有助于患者病变组织及其功能的重建，对人类治疗性克隆研究的贡献将是巨大的。二、申请专利技术1、建立克隆人关键技术平台。2、构建人自体基因的胚胎干细胞克隆技术平台。三、建立该技术的目的和意义1、提供构建与人个体基因型相同的人胚胎干细胞方法，为细胞及基因治疗提供“材料”来源。人胚胎干细胞具有全能性，且增殖能力强、分化潜力巨大，可在体内外定向诱导分化为各种细胞、组织和器官，用于替代、修复病损的细胞、组织和器官。可以说该技术是一座金桥，只有通过它，其他技术才可以通向理想完善的彼岸。该技术为以下临床治疗性研究奠定了坚实基础第一人胚胎干细胞在体外定向诱导分化为所需的特定干细胞后，直接用于临床移植治疗皮肤病、神经系统疾病、血液病等多种疾病。第二用干细胞携带治疗基因，经过诱导分化为成体细胞，用于治疗遗传性疾病。
第三利用干细胞的跨系统分化潜能，用于自体组织和器官的修复，可以避免同种异体移植的免疫排斥反应。
第四建立经遗传改构的通用型MHC基因型胚胎干细胞系或度身定做一个与受者MHC同型的ES细胞系。以供患者任意选用。
第五ES细胞可作为基因打靶的靶细胞，借助基因打靶技术，可定点整和外源基因，对与人类疾病相关的基因进行遗传改造，寻找治愈疾病的新途径。
第六建立包含多种MHC基因型的胚胎干细胞库，以满足不同患者的需求。
第七将干细胞作为种子细胞，与可降解支架材料联合培养，在体外构建有生命的种植体，修复组织缺损或再生组织和器官。
第八建立干细胞库，用于将来自体病损或衰老组织器官的修复，也可经配型后，用于同种异体组织或器官的修复等。
2、构建人胚胎干细胞为克隆人的关键技术平台。通过以下方法可获得克隆人(1)获得所需克隆者的体细胞，将其作为供体核的来源；(2)获得志愿捐献者的卵母细胞；(3)去掉卵母细胞的核；(4)通过显微注射的方式将供体细胞核转移至去核卵母细胞中；(5)经电融合、激活融合细胞；(6)体外培养融合细胞至桑葚胚(7)将4胚胎细胞、桑葚胚或囊胚移植到志愿者体内，使之发育成胎儿(伦理、法律允许方可进行)。
根据上述，可以明显看到本发明的最大优势在于采用此技术可提供自体基因的人胚胎干细胞，为克隆人组织和器官无排斥反应移植治疗技术奠定基础。为科研和临床治疗性研究提供充足的材料。在体外ES细胞可定向诱导分化为人体所需要的全新的、无免疫异原性的细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织、器官，可避免移植排斥反应的发生，治疗目前不能治疗的许多疾病，展现出广阔的临床应用前景。
四、方法步骤克隆人胚胎干细胞技术主要包含以下步骤1、制备人供体细胞，建立细胞系。用于核移植的体细胞可获自供体各种细胞和组织，制备的供体体细胞系包括人皮肤细胞、成纤维细胞和外周血淋巴细胞、等。体细胞系是指将体细胞培养传代后应用。外周血淋巴细胞是理想的细胞类型，细胞易于分离获得。从外周血分离出的单个核细胞可直接用作供体细胞，也可在体外培养24小时后，用作供体细胞体细胞系的传代培养通过胰蛋白酶处理后，用含10％-15％人脐血血清(AB型)和100U/L青霉素-100μg/L链霉素的RPMI1640细胞培养液，在37℃、5％CO2环境下培养。
如供体细胞为淋巴细胞，则按以下步骤制备供体细胞。抽取供者外周静脉血5ml，每毫升血用肝素(500U/ml)30μl抗凝，在抗凝血中加入等量生理盐水充分混匀，然后用尖吸管沿管壁徐徐加入等量淋巴细胞分层液(比重为1.077)，离心2000rpm/min，20min，用尖吸管吸取淋巴细胞层，置于Hank’s液的试管中，混匀后，1000-1500rpm/min，离心10min，弃上清，将细胞悬浮于2ml Hank’s液中再洗涤2次。用含15％人脐血血清的RPMI1640细胞培养液，在37℃，5％CO2条件下培养24小时，作为核供体的来源。
以表皮细胞作为供体细胞时，取供者皮肤小块先放置于0.02％EDTA中在室温条件下作用5分钟；然后置入0.25％胰蛋白酶中冷消化(4℃)过夜后，分离皮块，用镊子把真皮和表皮分开，取出表皮用剪刀剪成小块，置新的胰蛋白酶中，37℃消化30-60分钟，用吸管反复轻轻吹打，使成细胞悬液，通过80目不锈钢沙网过滤后，低速离心，吸弃上清，沉淀中加入Eagle液和15％脐带血血清，制成细胞悬液，转入培养瓶中37℃，5％CO2条件下培养48h-72h，也可继续传代后，作为核供体。
2、促排卵，采集人卵母细胞经技术处理后，获得去核的卵母细胞。自愿捐献卵细胞者自月经周期21天开始注射达必佳0.1mg，注射7天后改半量，直到注射HCG；月经来潮第3-5天(因病人具体情况而定)每天注射果纳芬2-3支，直到注射HCG。当卵泡发育至16-18mm，有1-2个时，注射HCG1000单位后11-12小时在阴道B超监视下，用15G的穿刺针，从卵巢滤泡中抽吸卵泡液，置于含有IVF2.0培养介质的平皿中，培养4-6小时，使卵母细胞发育成熟。然后优选出存在极性小体、胞质均匀、周围有足够数量的丘细胞层的处于分裂中期II阶段的卵母细胞作为受体卵母细胞(因为此阶段的细胞能被足够活化，所以可用于核移植)。将优选出的细胞放在35ml平皿内，用TCM199清洗介质洗3次。
经过用透明质酸酶(1毫克/ml)处理后，在TCM199清洗介质中通过用物理方法即反复用内径为140-180微米玻璃吸管移液的方法，去掉卵母细胞周围的卵丘细胞，然后用TCM199清洗介质清洗剥脱了的卵母细胞，再将它们移入含TCM199培养介质和细胞松弛素B(7.5ug/ml)溶液中5分钟后，准备去核。采用微移液管吸住卵母细胞，另外用显微针穿刺透明带以得到一个裂口，从此裂口处用微吸管吸取去掉极性小体和周围的胞质。即吸取极体和极体近区的胞质1/5-2/5，以得到去核的卵母细胞，清洗去核卵母细胞，并且在含15％脐血血清的TCM199培养介质中培养。
另外，应用偏振光光源，在显微镜下去除极体和胞质中的遗传物质，可得到去核的受体卵母细胞。
3、将供体细胞核移入去核的人卵母细胞内，经过激活，在体外发育成自体基因的胚胎干细胞。在把供体细胞核注射进受体卵母细胞前，用含15％脐血血清的TCM199清洗介质清洗去核的卵母细胞后，把它们移到细胞松弛素B的溶液中，用显微注射针吸取体细胞核，从透明带裂口处，把体细胞核注入去核的受体卵母细胞细胞质边上。在电融合介质(含甘露醇0.3M、0.1mmol/L CaCL2、0.1mmol Mg2SO4、)中使用电融合仪(BTX ECM2001)，用间隔1秒每次80-120微秒的120-140伏/厘米的两次直流电脉冲使细胞实现电融合，融合后的细胞通过在6-DMAP洗2次后，放入6-DMAP(6-DMAP 2.5mmol/L 15％人脐血血清的TCM199)溶液中被激活，在含有15％人脐血血清的TCM199介质中37℃、5％CO2环境下培养激活的细胞。
4、融合细胞经过体外继续培养发育成胚胎、桑椹胚、囊胚。激活后的融合细胞在体外适宜的细胞培养环境中(TCM-199+15％脐血血清，37℃，5％CO2)培养2-13天，使细胞分裂成2胚胎细胞至桑椹胚或囊胚。
5、建立胚胎干细胞系。将桑椹胚内细胞团的细胞用2.5％胰蛋白酶在4℃-37℃消化1-6小时，获得单个胚胎干细胞，继续传代培养，建立人ES细胞系。此干细胞系可进一步定向诱导发育成人体各种组织干细胞，用于临床病人的细胞生物治疗和体内外培养克隆细胞、组织和器官的研究和临床治疗。
6、自体基因胚胎干细胞的确认取人胚胎干细胞采用PCR-STR9位点测序分析构建的自体基因的胚胎干细胞与供体基因的差异。
现在提供以下实施例进一步具体说明本发明。
实施例1制备供体细胞。抽取供者外周静脉血5ml，每毫升血用肝素(500U/m1)30μl抗凝，在抗凝血中加入等量生理盐水充分混匀，然后用尖吸管沿管壁徐徐加入等量淋巴细胞分层液(比重为1.077)，离心2000rpm/min，20min，用尖吸管吸取淋巴细胞层，置于Hank’s液的试管中，混匀后，1000rpm/min，离心10min，弃上清，将细胞悬浮于2ml Hank’s液中再洗涤2次。用含15％人脐血血清的RPMI1640细胞培养液，在37℃，5％CO2条件下培养24h，作为核供体的来源。
制备受体卵母细胞。自愿捐献卵细胞者自月经周期21天开始注射达必佳0.1mg，注射7天后改半量，直到注射HCG；月经来潮第3-5天注射果纳芬2-3支每天，直到注射HCG。当卵泡发育至16-18mm，有1-2个时，于晚上2100时注射HCG1000单位，隔日上午8点在阴道B超监视下，用15G的穿刺针，从卵巢吸取卵泡液，置于含有IVF2.0培养介质的平皿中，培养4-6小时。然后筛选有极体、均匀的胞质并且周围有足够数量的丘细胞层的卵母细胞，放在35ml平皿内，用TCM清洗介质洗3次。经过用透明质酸酶(1mg/ml)处理后，在TCM199清洗介质中通过用物理方法即反复用极细玻璃吸管移液的方法，去掉卵母细胞周围的卵丘细胞，然后把它们移入含TCM199培养介质和细胞松弛素B的溶液中。采用显微操作器械吸住卵细胞，另外用显微针穿刺透明带后，从卵母细胞中去掉部分包括第一极体的胞质，即吸取极体和极体近区的胞质1/5-2/5，以得到去核的卵母细胞，作为受体细胞。
在把供体细胞核注射进受体卵母细胞前，用TCM199培养介质清洗去核的卵母细胞后，用显微注射针吸取体细胞核，从透明带裂口处，把体细胞核注入去核的受体卵母细胞细胞质边上。在电融合介质中使用电融合仪(BTX ECM2001)，用间隔1秒每次80-120微秒的140伏/厘米的两次直流电脉冲使细胞实现电融合，融合后的细胞在含有10％人脐血血清的TCM199清洗10次，6-DMAP溶液洗2次后，放入6-DMAP(6-DMAP 2.5mmol/L15％人脐血血清的TCM199)溶液中1.5-2小时被激活，在含有15％人脐血血清的TCM199清洗介质中37℃、5％CO2环境下培养激活的细胞。融合细胞经过体外继续培养2-3天，使细胞发育成2胚胎细胞、桑椹胚、囊胚。胚胎干细胞系的建立是将桑葚胚或囊胚的内细胞层用2.5％胰蛋白酶在4℃-37℃消化1-6小时，获得单个胚胎干细胞，继续传代培养。
五、使用该专利技术所能产生的积极效果该发明提供了成熟的体细胞核移植构建自体基因的胚胎干细胞技术。此技术的成功，为采用自体基因的胚胎干细胞进行临床治疗性研究提供充足的材料；为克隆人组织和器官无排斥反应移植治疗技术奠定基础；胚胎干细胞在体外可定向诱导分化为人体所需要的全新的、无免疫异原性的各种细胞、组织和器官，用来取代病变的细胞、组织、器官，可避免移植排斥反应的发生，治疗目前不能治疗的许多疾病(如血液病、艾滋病、肿瘤等)，展现出广阔的临床应用前景，将对医学生物学的发展产生极大的推动作用，并且会产生明显的社会经济效益。


本发明提供了一种将人体细胞核与人卵母细胞核置换克隆胚胎干细胞技术，包含以下主要步骤采集制备人供体细胞；促排卵，取卵；脱卵母细胞周围的卵丘细胞；人卵母细胞核与人体细胞核置换；核置换后的人卵母细胞激活和体外培养发育到囊胚技术。本发明是克隆与人供体基因相同的胚胎干细胞技术，同时也是克隆人的关键技术。克隆的胚胎干细胞无任何动物成分，经过体外培养可建立胚胎干细胞系，定向诱导分化为人体各种干细胞，为应用干细胞治疗、克隆组织和器官等临床治疗性研究奠定基础，同时控制克隆人技术的发展。