专利名称：一种神经干细胞培养容器的制作方法神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。神经干细胞在体外培养过程中大多呈悬浮状态不贴壁，并有形成神经球 (Neurosphere)的特性。神经球是神经干细胞聚集起来形成的球状物，根据生长进程的不同直径在几十微米至几百微米不等。神经球的细胞组成与许多因素有关，主要包括供体动物的年龄、细胞接种的密度、培养技术条件、细胞传代数等。神经球的形成有利于增强细胞之间的相互作用， 从而加快神经干细胞的增殖速度。目前市售的细胞培养瓶大多为平底，也有U型底。平底培养瓶中细胞一般均勻分散在容器底部，不利于神经球的形成；U型底培养瓶在静态培养中细胞多层沉积在容器底部中央，不利于底层细胞获取营养和呼吸代谢。本实用新型针对神经干细胞的生长特点对细胞培养容器底部的细胞接触面的材质和形状进行了改进，特别是对底部凹陷的具体尺寸进行了优化，有利于促进神经球的形成，加快神经干细胞的增殖速度。发明内容本实用新型的目的在于促进神经干细胞聚集形成神经球以加快增殖速度，同时又避免大量细胞多层沉积造成底层细胞难以获取营养和呼吸代谢。本实用新型的技术方案如下神经干细胞培养容器底部的细胞接触面是以抗细胞吸附的高分子聚合物为材质的密集排列的深度为0. 1-lmm、直径为0. 3-lmm的凹坑形状。在一个实施方案中，所述的抗细胞吸附的高分子聚合物是2-羟乙基甲基丙烯酸酉旨(HEMA，2-Hydroxyethyl Methacrylate)的聚合物(P0LY-HEMA)。在另外的实施方案中，所述的抗细胞吸附的高分子聚合物可以是聚乙烯氧(ΡΕ0， Poly Ethylene Oxide)、类 PEO聚合物(PEO-Like Polymer)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET， Poly Ethylene Ter印hthalate)、聚乙二醇(PEG，Poly Ethylene Glycol)或 2_ 羟乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)的共聚物。[0012]在一个实施方案中，所述的凹坑的纵切面呈U型。与传统平底细胞培养容器(图7)相比，本实用新型在容器底部密集排列的微小凹坑有利于神经干细胞聚集形成神经球(图幻。由于凹坑均勻分布在容器底部，神经干细胞在容器底部各个U型凹坑内分别少量聚集(图幻，与培养液接触更均勻，避免了传统U型底容器中所有神经干细胞大量沉积在底部中央的缺点(图6)。以抗细胞吸附的高分子聚合物作为细胞培养容器的细胞接触面，有利于阻止神经干细胞贴壁、维持神经干细胞的悬浮状态，更加易于形成神经球。本实用新型的有益效果是，能够促进神经干细胞在培养容器底部较为均勻的聚集形成神经球，从而加快神经干细胞增殖速度。图1 本实用新型一个实施例的纵切面。图2 本实用新型一个实施例的俯视图。图3 本实用新型一个实施例的纵切面，其中画斜线的阴影部分以抗细胞吸附的高分子聚合物为材质。图4 本实用新型一个实施例的纵切面，其中画斜线的阴影部分以抗细胞吸附的高分子聚合物为材质。图5 本实用新型一个实施例的纵切面，图中微小的球形代表神经干细胞，本图示意神经干细胞在该容器中分布的状态。图6 传统U型底细胞培养容器的纵切面，图中微小的球形代表神经干细胞，本图示意神经干细胞在该容器中分布的状态。图7 传统平底细胞培养容器的纵切面，图中微小的球形代表神经干细胞，本图示意神经干细胞在该容器中分布的状态。本实用新型可以通过以下手段制造或实现(1)使用模具和能形成固体的抗细胞吸附的高分子聚合物材料直接制作成所需形状(图1) ； (2)先使用模具和制造细胞培养瓶的常规材料制作成所需形状，再采用表面技术(如化学气相沉积、离子束合成薄膜技术等) 在容器底部的细胞接触面覆盖一层抗细胞吸附的高分子聚合物薄膜(图幻；(3)在常规的平底细胞培养容器的底部，使用模具和抗细胞吸附的高分子聚合物材料制作带有所需尺寸凹坑的凝胶层(图4)。本实用新型的使用方法如下(1)根据细胞计数结果，将神经干细胞悬液的浓度调节到5X 10、细胞/ml至2X 10~5细胞/ml之间；(2)将神经干细胞悬液加入细胞培养容器中，盖上盖子；C3)平放细胞培养容器，轻轻摇晃使细胞分布均勻；(4)将细胞培养容器放置于细胞培养箱中进行细胞培养。实施例1采用模具和POLY HEMA材料(购自Sigma-aldrich公司)在六孔板底部构建含有密集排列的深度为0. 2mm、直径为0. 5mm的凹坑的凝胶层，制成神经干细胞培养容器(图 4)。[0027]从ICR鼠脑组织皮层获取神经干细胞(经免疫荧光鉴定表达神经干细胞标志物巢蛋白 nestin)，用 DMEM细胞培养液(添加 1 XB27 添加剂，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF, IOng/ ml LIF，均购自hvitrogen公司)调至1 X 10"5细胞/ml的浓度。实验组将上述神经干细胞悬液一部分小心加入本实施例专门制作的神经干细胞培养容器中，每孔2ml (细胞数为2 X 10~5细胞)，共六孔，盖上盖子，平放细胞培养容器，轻轻摇晃使细胞分布均勻，放置于细胞培养箱中，37°C、5% C02条件下培养，每隔3天更换1/3体积培养液。对照组将上述神经干细胞悬液另一部分加入超低吸附平底六孔板(购自Corning公司) 中，每孔2ml (细胞数为2X 10~5细胞)，共六孔，后续操作与实验组相同。培养6天后收获培养物，酶消化成单细胞，细胞计数，实验组各孔细胞数分别为 (单位:10~5细胞)9. 1，9·3，9·5，9·5，9·6，10·2 ；对照组各孔细胞数分别为(单位10"5 细胞)6.8，7.0，7. 1,7. 1,7. 4,7. 4 t检验表明实验组细胞增值率明显高于对照组(P < 0. 001)。将两组细胞分别合并，免疫荧光法检测神经干细胞特异性标志物巢蛋白nestin 的表达，实验组nestin表达阳性率93%，对照组nestin表达阳性率90%，说明培养过程中两组细胞均保留了神经干细胞特征。