专利名称：逆转干细胞衰老的方案的制作方法随着年龄的不断增长，我们的黑发会逐渐变白，皮肤皱纹逐渐增多，视力、记忆力以及对微生物的抵抗力会逐渐下降，同时，癌症、糖尿病、心脑血管病的发病概率也会逐年上升，导致这种变化的罪魁祸首是个体中的成体干细胞衰老了。同时，衰老也是造成某些遗传病在特定年龄发病的原因。干细胞的自我更新潜能和多向分化与增殖潜能的不足是造成自体成体干细胞移植疗效不理想的原因，而衰老是导致自我更新潜能和多向分化与增殖潜能不足的原因。因此，如何在体外逆转成体干细胞衰老是自体成体干细胞移植成败的关键。衰老生物学的最终目的是征服衰老，但一般人都会认为，衰老是自然规律，是不可抗拒的！我却不以为然，因为在自然情况下，水只能往下流，人只能走向衰老，这就是所谓的自然规律！然而，人为用水泵能够使水往高处流，因此，人为让衰老逆转有什么不可能的呢？生物衰老的机制较复杂，众说纷纭，至今还没定论，因此，要想逆转衰老，首先必须要有一个比较完善的学说或理论作为设计逆转衰老的科学依据，为此，在提出设计逆转衰老的方案之前，本文必须要先用较大的篇幅来说明衰老的机制。即使在生理条件下很少分裂的肝细胞，估计平均200 300天更新一次(Bucher 和Malt，1971)，这是因为细胞中的DNA突变频率很高，再加上细胞垃圾和衰老等原因造成的死亡。因此，事实上，我们体内每天都有大量的细胞被免疫系统清除掉，但同时也有等量的细胞通过增殖(即自我复制、自我更新)和分化来补充，因此，个体衰老不但不是由细胞死亡造成的，而且还向我们提示个体中的任何器官组织都有负责为它补充各种细胞的干细胞。每种生物的生长发育成熟衰老都有一个相对稳定有序的时间表，因此，衰老不可能是细胞DNA突变累积中毒或磨损一类带有时空偶然性的因素造成的，而应该是一种有选择性和计划性的程序，基因是按照程序性地进行表达的。随着年龄的不断增长，不但个体中的细胞总的基因表达能力在下降，而且个体中的同一分化性状的细胞在不同发育时期(或空间分布)会相续表达和关闭不同的基因， 如人的肝细胞在胎儿期主要表达甲胎蛋白，出生后到成年期就把甲胎蛋白基因关闭，转而主要表达白蛋白，到了老年期，白蛋白基因也逐渐关闭，同时开始逐渐表达一些晚期基因，因此，细胞衰老主要表现是“基因的表达效率下降和表达的种类的改变”，这种程序性的基因表达现象称基因的顺序表达(sequential expression)差次表达(differential expression)，其本质就是一种程序。据此，我把个体的生长发育成熟衰老的一个有序的周期称为“生命周期程序”。我们知道，要使计算机中存储在硬盘中的程序运作起来，硬盘驱动器中就设置有一台电动机，由电动机产生的推力来驱动硬盘旋转。推动计算机程序运作的3动力来自电动机，那么，推动生命周期程序运作的动力来自那里呢？只有弄清这个问题才能找到彻底征服衰老的方法。为此，下面我提出了衰老的“生命周期程序驱动学说”。个体的生命周期程序的组成包括细胞分化和细胞衰老。细胞一级一级地向前分化，并表达出不同的基因，这是一种程序；细胞衰老过程，不但基因的表达效率在下降，而且不同的基因的表达也是有先后顺序的，这也是一种程序。细胞衰老与细胞分化关系密切细胞衰老能增加细胞分化率，直至某些组织中的某些成体干细胞完全消失；细胞分化时，细胞中的端粒酶(telomerase)活性会下降，从而促进细胞衰老。综上所述我认为，细胞衰老与细胞分化要结合起来研究才能解阐明个体衰老的原因。下面把个体发育中的细胞衰老和细胞分化与计算机程序的运作原理做一比较，对衰老机制进行大概描述一般来说，作为基因原件的启动子高甲基化能阻抑转录，内含子高甲基化则能促进转录，反之亦然。因此，DNA甲基化与否可以决定基因表达与否(打开/关闭)，这相当于计算机程序指令的0或1 (开/关)，因此，在受精卵重新编写细胞分化程序时，必须全部删除DNA上所有的甲基基团(指令)，为此，有一种称去甲基化酶的酶使卵裂期基因组全面去甲基。去甲基后的基因组就像一张白纸(空盘)，就可以重新刻录程序指令了，于是，大约在胚胎植入子宫的时候，有一种称构建性甲基化酶(establishment methylase)的酶使细胞内的DNA重新甲基化(R. jaenisch, 1997)，即重编程，至此，生命周期程序就编写好了。但是，细胞中已编写好的生命周期程序，如果没有一个驱动装置，就像计算机的硬盘驱动器中没有电动机一样，会使程序指令无法顺序读取的，即细胞状态只能停留在某一水平。已有很多证据表明，位于染色体两端称为“端粒”(telomere)的重复DNA，它的长度会随着细胞分裂而缩短，而且它的长度与细胞的活力(基因的表达活性)呈正相关，因此，当端粒长度发生变化时，细胞的活力也会随着发生梯度变化，这相当于产生了一股推动推力， 也就是说，端粒长度发生变化时，就会产生一股推动生命周期程序运作的推力。因此，作为生殖细胞的精子，它的端粒长度从精子干细胞的91Λ以下一次性地延伸到151Λ，以备维持将来发育成个体中的整个生命周期的消耗。为了使甲基化型式相同的受精卵在分化后产生差异，卵细胞质中就准备了几种称为“决定子”的调节分化的蛋白质，在细胞分裂过程中不均等地分配到子细胞，选择性地将子细胞中的不同的组织特异性基因的调节区低甲基化的添加甲基，或高甲基化的去甲基 (我认为这就是导致分化的细胞基因选择性表达的根本原因)，于是，子细胞的DNA各自产生了不同的甲基化型式，以此选择性地打开或关闭(遏制或活化)不同的组织特异性基因， 于是，不同的子细胞合成了不同的蛋白质，由此产生出了中胚层、内胚层和外胚层的不同类型的细胞。知识链接0ct3/4基因在胚胎干细胞有表达活性，而成体干细胞则不表达，研究发现，与胚胎干细胞相反，成体干细胞0ct3/4基因的调节区出现了 DNA甲基化；已观察到哺乳动物DNA甲基化型式是组织专一性的。由于端粒的不断缩短，就推动了细胞不断地向前分化，使这些早期的分化细胞又按照各自的分化路线(或分化程序)通过体细胞中的各种调节分化的蛋白质一步一步地修改原有的甲基化型式，即关闭上级基因并启动下级基因，使一种细胞通过级联方式不断地向前分化成200多种细胞并构成人体。知识链接造血干细胞的⑶34+细胞和⑶34-细胞的甲基化型式是不一样的，在 CD34+细胞基因组中转录起始位点附近的DNA序列的甲基化水平很低，而两侧的序列则多被高度甲基化。也就是说，CD34+细胞在调节分化的蛋白的作用下已修改了甲基化型式，不可逆地分化成了⑶34-细胞。严格地说，⑶34+和⑶34-细胞已经是不同的细胞了。在细胞增殖时，为了让子细胞保持和亲代相同的克隆，不同的甲基化型式必须要一成不变地一起复制才能保持特异的分化性状的稳定不变，为此，有一种称维持性甲基化酶(maintenance methylase)的酶，通过以“甲基化维持”的方式将新的甲基化型式传递到每个子细胞的DNA上(复印)。端粒酶的活性与细胞的活力呈正相关，由于癌细胞的端粒酶活性很高，因此，许多癌细胞的端粒虽然比正常细胞还短，但细胞活力却和胚胎细胞一样高。也就是说，端粒酶能够代偿端粒的作用。但端粒酶的活性要受到端粒长度或癌基因的调控，而不能自作主张，因此，决定衰老的初始因素还是端粒，而非端粒酶。端粒长度(或端粒酶活性)变化会推动生命周期程序运作的证据β -半乳糖苷酶(晚期基因的产物)的含量在衰老的细胞内是升高的。B0rdner(1998)把端粒酶的催化亚基hTRT基因导入人视网膜色素上皮细胞和包皮成纤细胞发现，细胞中的β -半乳糖苷酶含量就会减少，同时细胞出现年轻的表形，这相当于生命周期程序开倒车了 ；终末分化细胞是不能发生进一步分化的，但在个体生命中的不同时期，基因表达也不相同，已经证明这种调节是受到端粒长度所左右，因为不分裂的终末细胞端粒也会缩短(Von Zglinicki等人， 1995 ；Von Zglinicki,1998)。因此，端粒长度的不同，基因的表达活性和表达种类也不同，随着端粒的不断缩短，基因的表达活性和表达种类也随着不断改变，即基因的程序性表达。也就是说，端粒缩短产生了一种推动力，推动着生命周期程序中的基因群进行程序性表达(顺序表达、差次表达)。或者说，不同的端粒长度(或端粒酶活性)决定着不同的基因群的表达。这种调节基因表达的调控机制与细胞分化不同，是具有高度的可逆性，而细胞分化通常是不可逆的。以肝细胞为例，在端粒最长的胚胎期，主要表达甲胎蛋白。在端粒中等长度的成年期，甲胎蛋白停止表达，转而表达白蛋白。在端粒最短的老年期，白蛋白基因逐渐停止表达， 转而表达一些对细胞有害的基因。由于白蛋白是我们正常生理不可缺少的蛋白质，因此，当白蛋白基因停止表达到一定程度，机体就会停止运作，也就是我们的死期，衰老死亡大体就是这么简单。通俗地说，当细胞衰老到一定程度，细胞就不能应付日常事务。由于个体是由细胞组成的，因此，当大多数体细胞衰老到一定程度，个体就会变得老态龙钟，直至死亡。端粒缩短导致基因总体表达能力下降的机制是因端粒缩短间接导致组蛋白乙酰化、磷酸化水平下降，从而使组蛋白与DNA结合的更紧密，以致基因转录效率下降。例如，丛羽生教授发现单单端粒酶催化亚基就可促进血管内皮生长因子基因转录。而生长因子类 (生长因子又可激活端粒酶)可激活组蛋白脱乙酰化酶或磷酸化酶。端粒缩短导致基因表达种类改变的机制是某些能够同时正调节和负调节多个基因转录的调节因子的基因，它的表达活性的变化与端粒长度(或端粒酶活性)呈正相关，这样，随着端粒的不断缩短，基因自然就会出现顺序表达。例如，myc基因的产物具有转录子作用，它的活性与端粒长度或端粒酶活性呈正相关，而且myc能够同时正调节和负调节多种基因表达，如myc可同时正调节a-胸腺素的转录、hsp70启动子转录和负调节金属硫蛋白转录、前a2胶原蛋白和neu基因启动子转录。这样，当myc表达活性上升时，a_胸腺素等基因表达活性上升，同时金属硫蛋白等表达活性下降，反之亦然。由细胞分化导致的基因的顺序表达通常是不可逆的，而由端粒缩短或端粒酶活性下降导致的基因的顺序表达是高度可逆的。例如，给成年期的肝细胞添加生长因子(可激活端粒酶)或端粒酶激活剂就会恢复表达胚胎期特有的甲胎蛋白，撤去生长因子或端粒酶激活剂，又会恢复表达白蛋白。端粒缩短所致的基因的顺序表达就是推动细胞不断向前一级一级地分化下去的推力；因此，癌细胞由于端粒不会进一步地缩短，细胞分化只能停滞不前。胚胎发育过程细胞分化最频繁，因此，胚胎期细胞端粒的缩短速度高于成人期和老年期。综上所述我认为，个体中的成体干细胞的端粒缩短就是造成个体衰老的原因。链接原生殖细胞(PGCs)的DNA不含甲基，是真正的无分化的细胞，可以诱导成胚胎干细胞(ES，ES是未分化的细胞)，据上述重编程机理，我和傅文庆等人曾经设想用去甲基方法制造PGCs (黄必录.个体发育和端粒.中国老年病杂志，2008，5(1) :57.)，也许DNA 不经去甲基化而直接全甲基化也能制造ES，原理是合子去甲基后不含甲基的DNA又在构建性甲基化酶的作用下重新甲基化会变成ES，据此可以用构建性甲基化酶把成体干细胞因细胞分化而失去甲基化的一部分DNA补上甲基，使DNA有着和胚胎干细胞相同的甲基化模式， 然后再把它诱导成各种组织干细胞。Gadd45ac是一种功能为维持基因组稳定性。DNA修复及细胞生长抑制作用的细胞核内蛋白，Gadd45ac过量表达会激活甲基化沉默报告质粒，并且使全部的DNA去甲基化(我从网上收集的)。细胞衰老或抑制DNA甲基化的药物也会使细胞DNA甲基化水平下降，但是，细胞必须设法保留DNA上与细胞分化类型有关的基因的那部分甲基，即不能完全清除DNA上的甲基，否则，细胞的特异分化性状会失真。例如，反复用能抑制DNA甲基化的5-杂氮-脱氧胞嘧啶(5-aza-dC)来降低小鼠永生细胞系C3H10T1/2的DNA甲基化水平时不可能降到零(最低到 0. 45% ) (Flatau 等人，1984)。由于细胞衰老或抑制DNA甲基化的药物也会使细胞DNA甲基化水平下降，因此有人就认为DNA甲基化水平下降是造成细胞衰老的原因，细胞衰老的分子钟有可能是DNA甲基化的丢失。我认为DNA甲基化的丢失只是细胞衰老的一种伴生现象而已，而不是造成细胞衰老的原因。依据是，用SV40感染及大T抗原(两者都会激活端粒酶)逆转细胞衰老时， 甲基化水平会重新上升(Matsumura等人，1989)。下面介绍各种与衰老争议有关的问题1、由于正常的体细胞每分裂一次，端粒就会缩短一小段，因此，很多研究者认为端粒的作用是相当于细胞分裂的计数器(时钟)。然而，癌细胞分裂时，端粒已经不会再进一步地缩短，而细胞分裂却从来没有停下来，据此，把端粒看作细胞分裂的计数器是不正确的。2、细胞的分化与增殖两者是处于对立统一的，增殖处于优势时，分化则受到抑制， 反之亦然。由于端粒和端粒酶是司增殖的，因此，端粒缩短或端粒酶活性下降可以驱动细胞衰老和细胞分化。而高度恶性的癌细胞由于端粒酶或端粒保持在较高的水平，细胞衰老和细胞分化只能停滞不前(当然，癌细胞也能分化，如胚胎癌细胞(EC细胞)可分化成多种类型的细胞，但前提是端粒酶活性必须要下降，即牺牲了增殖力)。精母细胞和成体干细胞都含有端粒酶，但只有精母细胞的端粒才能净延伸，而成体干细胞的端粒照样会不断缩短，原因是成体干细胞在每次细胞分裂时，端粒的缩短量大于延伸量，其意义是个体的正常生理需要细胞分化，如果成体干细胞端粒不会缩短，细胞分化就会停滞而会弓I起个体死亡。利用端粒酶的催化亚基hTRT基因导入细胞已经实现了细胞的长生不老，但是，这些长生不老的细胞是不能用来使个体返老还童的，原因是(1)正常生理需要细胞分化，而这些细胞由于端粒酶活性不受控制地持续保持高活性，细胞就无法分化；( 这些细胞的端粒实际上并没有因为端粒酶活性升高而得到延伸，如果撤去导入的端粒酶催化亚基基因，细胞会马上回复到之前的衰老程度。3、对于一些不分裂的终末细胞的衰老，是否与端粒有关？我认为在探讨个体衰老的原因时，并不需要完全了解终末细胞等非干细胞衰老死亡的确切机制，因为从个体水平来说，无论这些细胞是怎样衰老死亡的，也不是导致个体衰老的原因，因为由衰老等原因而导致死亡掉的非干细胞可以由成体干通过细胞分化来补充；同样，成体干细胞因各种原因死亡也不是造成个体衰老的原因，因为死亡掉的成体干细胞也可以由成体干细胞通过自我复制来补充。事实上，人体每天都有大量的干细胞和非干细胞因各种原因而死亡，同时也有相应数量的细胞补充。也就是说，个体的衰老与细胞死亡无关；或者说人体的衰老不是像机器那样是由磨损造成的。造成终末细胞老化死亡的原因有(1)已发现端粒不经细胞分裂也会缩短；(2) DNA突变；(3)代谢废物积累，例如，某些神经元的脂褐素(LF)可随年龄增长而恒定地增多， 而且它的增多到一定水平时可使RNA含量减少，这样会使蛋白质合成功能下降，结果和端粒缩短造成的衰老是等效的。4、随着个体越来越衰老，组织中的成体干细胞的数量就会越来越少，直到某些成体干细胞完全消失(据此，对于高龄的老人，在治疗衰老时必须补充已经消失的某种成体干细胞)。这是因为端粒缩短会导致成体干细胞的自我更新率逐渐低于分化率。但成体干细胞数量下降不是造成个体衰老的原因，因为通过射线杀死动物组织中的成体干细胞，并不会加速动物衰老速度，而只能使动物变得虚弱。如果射线剂量低于致死量，动物的寿命反而会延长。造成这种现象英文称hormesis。5、随着人的年龄的增加，组织中成体干细胞的各种潜能会逐渐缩小，这是造成老年人组织的修复能力不如年轻人的原因，同时也是造成用成体干细胞移植治疗心脏病等疾病并不能分化成完备的心肌细胞等细胞的原因。导致成体干细胞各种潜能缩小的原因与基因的表达活性和表达谱系的改变有关， 而这又与端粒的缩短有关。例如，造血干细胞的端粒越短，端粒酶的活性就越低，重构造血能力和增殖能也越低。当然，只要端粒再度延伸，这种退化是可逆转的。6、清除自由基的抗氧化剂不能改变动物的最大寿限，原因是虽然抗氧化剂会增加细胞分裂次数，但同时会缩短分裂时间。因此，自由基不是导致衰老的真正原因，而仅仅是加速衰老的一个因素而已。细胞衰老时，清除自由基的酶的基因会逐渐关闭，从而导致自由基猖獗为害。如果衰老的细胞逆转年轻，自由清除酶的基因也会重新打开，例如，癌细胞中清除自由基的酶的活性和胎儿细胞一样高。已证明自由基是通过加速端粒缩短速度来降低细胞分裂次数的。7、在年轻人的细胞中，突变的线粒体DNA是不会累积的。此外，在复制旺盛的干细胞中，突变的线粒体DNA会发生复制分离(implicative segregation)现象，使突变的DNA 逐渐减少。因此，线粒体DNA突变累积不是造成衰老的真正原因，而仅仅是加速衰老的一个继发或伴生现象而已。8、在个体水平中，突变的细胞核的DNA :(1)可以修复；(2) —旦修复不好就会启动细胞凋亡；(3)如果既修复不好也不发生凋亡，最终会被免疫细胞清除，因此，年轻的个体是不存在突变的细胞累积的问题。也就是说，造成个体突变的细胞的累积的真正原因是免疫系统的衰老，从而导使突变的细胞不能有效地清除。而造成免疫系统的衰老的真正原因是成体干细胞的衰老；脂褐素被认为是不能降解的细胞垃圾，已发现也能降解。对已堆积脂褐素的小鼠给药50天，结果脂褐素含量显著下降(曾南等，1997)；年轻的细胞会旺盛地分泌胶原酶等酶来更新细胞间质，因此，细胞间质成分的堆积也不是造成衰老的真正原因。此外，内分泌功能退化或紊乱学说、神经系统退化学说等等等等都不是导致衰老的真正原因， 而只能算是衰老的继发因素或衰老的伴生现象而已，因为生物在长期进化的过程中，已进化出了一套完善的防御和净化系统，只因细胞衰老才导致这套防御和净化系统的功能发生退化，从而使一些能够加速衰老的因素猖獗为害。当然，如果能够使人体内的多能成体干细胞的端粒长度恢复到年轻人的水平，这些防御系统的功能也会恢复到年轻人的水平，各种衰老的伴生、继发现象也会不攻自破。9、生物进化需要基因突变，因此，精子不但能够突变，而且还能够把突变株保留下来，睾丸屏障就是为了使精子能够与免疫系统保持隔绝，以防止突变的细胞株被免疫细胞清除(即纯化)。然后精子通过赛跑竞争，优胜劣汰，只有强壮的精子才能与卵子结合。由于生殖细胞是彻底返老还童的细胞，据此可说明，突变不是导致衰老的原因之一，或者说生殖细胞是通过修复基因突变来实现返老还童的理论是错误的。10、许多教科书把癌细胞看作未分化、无分化、去分化或异分化的细胞都是错误的，因为癌细胞还保留着起源组织的特有分化标志，例如，成人的肝癌细胞仍然会表达胎肝细胞特有的代谢谱和酶的量分布谱，而且一旦除去致癌因素，就会恢复成正常的成人肝细胞。据此我认为，把癌细胞看作是逆转衰老的超年轻化或幼稚化的细胞才是正确的。11、许多教科书把免疫球蛋白基因和T细胞受体基因的重排现象视为是细胞分化中基因选择性表达的原因是错误的，因为免疫球蛋白基因和T细胞受体基因的重排只涉及到翻译成蛋白质部分的DNA进行与抗原对应匹配的调整，而并没有涉及到这些基因的转录与否(开/关)的调控。12、有人把染色质特异部位的组蛋白的甲基化、乙酰化以及转录、翻译和加工等过程的特异调控因子视为细胞分化中基因选择性表达的第一因素是错误的，因为参与这些环节的特异调控因子本身是不稳定和易降解的，为此，这些特异调控因子还需要依赖基因的选择性表达才能把分化性状长期稳定地维持下去，这样问题又来了 是什么因素使这些特异调控因子的基因发生选择性表达？问题又绕回到原地，无限循环。13、入选驱动生命周期程序运作的驱动物质必须要满足6个要求(1)细胞分裂时它必须能复制一份，以便每个子细胞都有一份；(2)它必须在生殖细胞中预先储备，而且储量在个体的所有细胞中须最多，以便足够将来个体的整个生命周期的消耗(如果是单纯为了解决染色体“末端隐缩问题”，在体细胞分裂的同时，端粒丢失多少可以补充多少，而无需在生殖细胞中作一次性的补充。例如，单细胞的生物在细胞分裂时，端粒丢失多少就可以同时补充多少。据此，在生殖细胞中大幅度延伸端粒的现象反而可以证明端粒与衰老有关)； (3)体细胞每分裂一次，它必须消耗掉一部分，而且不能同时等量地一边消耗和一边补充， 而只能单向消耗或消耗量大于补充量。这是因为如果同时消耗量和补充量一样多，就不能产生“浓度差信息”(计算机程序是靠电动机驱动的，生命周期程序是靠化学浓度差来驱动的)，基因也就无法进行差次表达(顺序表达)，而基因无法顺序表达，个体发育也就不能进行，生物只能停滞在单细胞水平(这就是返老还童药至今没有出现的原因)。单细胞生物不会发生分化和衰老就是因为这个原因。据此，要使衰老个体逆转年轻，端粒只能以单向一次性方式净延伸。即衰老不能停滞在某一水平，要么进行衰老，要么逆转衰老(例如，水母类、 海鞘类等众多的低等生物利用了长时间饥饿的单向一次性的方式来实现返老还童；据报道，2011年科学家发现“灯塔水母”(Turritopsis Nutricula)够返老还童，在达到性成熟年龄完成交配之后会以单向一次性的方式实现返老还童。(4)各种导致细胞衰老的因素必须最终都是通过消耗它的储量起作用的，例如，自由基会加速端粒缩短速度；细胞中各种DNA 突变、细胞垃圾中毒等等导致细胞死亡，干细胞为了补充死亡的细胞就会提高分裂频率，而细胞分裂会导致端粒缩短；限食可减缓端粒缩短速度；女性比男性长寿是因为耗能比男性少，故女性端粒缩短速度低于男性；目前已发现60多种基因与衰老有关，如抑癌基因P53、 P21、Rb等等，如P53、Rb等高表达时细胞端粒缩短加速；( 分子的稳定性要极好，没有半衰期，因为个体的寿命长达百年，它必须要能陪衬终身；(6)它的储量的多少能够左右基因的转录速率，例如，Daniel Gottschling(1994)发现端粒会影响附近基因转录；丛羽生教授发现单单端粒酶催化亚基就可促进血管内皮生长因子基因转录。已知端粒完全能够满足上述的6个要求。有一个称重复基因利用枯竭的衰老假说认为，编码阻遏DNA抑制剂基因表达的基因有许多拷贝，细胞每分裂一次，它就会丧失一份或数份拷贝，随着分裂次数的增多，拷贝越来越少，最后阻遏物浓度下降到不足以阻遏DNA抑制剂产生时，DNA抑制剂就大量表达， 最终导致细胞分裂停止。该假说与端粒学说的模式是相类似的，可以说端粒学说是该假说的修正版。14、果蝇和其它双翅目昆虫中的DNA不发生甲基化，它们细胞分化基因的选择性表达的机制只能与DNA序列的改变有关，比如靠改变基因调节区中某些重复DNA序列的重复次数或插入转座子等元件来决定基因的开或关的。但采用DNA甲基化与否的调节方式更具灵活性，故会被生物普遍采用。15、采用DNA甲基化或改变DNA序列都能符合细胞分化的4个要求(1)在细胞分裂时它能复制一份，以便每个子细胞都有一份；( 能受到调节分化的蛋白质的调节；(3) 具有基因开关的作用。(4)分子的稳定性极好，这样才能保持细胞分化后其性状具有很好的稳定性，例如，神经细胞寿命几乎与人相当，其分化性状也能保持终身不变(多数教科书认为细胞分化后其性状是通过正反馈机制来保持稳定的，但实验却否定了这一假说)。16、兄弟姐妹的排行，老大寿命往往相对比较长，身材比较矮小，排行越小寿命就9越短，这种现象规律性很明显，因此不可能是基因突变造成的。造成排行越小寿命就越短的原因可能是年龄较大的父母的生殖细胞因为衰老使构建性甲基化酶不足，致使某些基因的 DNA甲基化不足，以及生殖细胞端粒长度的不足所造成的。例如，克隆动物出生前往往体型过大、易早衰、易患病和夭折，为此，英国罗斯林研究所的科学家发现，造成这种现象是一种称为Igf2r蛋白质的基因上缺乏甲基而导致过表达。Igf2r过表达会引起胎儿过度生长和死胎。此外，克隆羊多莉的端粒也比同龄羊短20%。17、细胞衰老并非只发生在生命的末期，而是贯穿整个生命周期，因为细胞衰老可以启动细胞分化和个体发育，例如，松果体释放的激素会抑制性腺活动，人到了 10 14岁， 松果体因衰老而发生退化，于是性腺就开始发育了 ；胚胎中的胰岛素样生长因子因细胞衰老导致合成下降，可使胚胎肾脏的一部分细胞凋亡，以此使肾脏管道化。18、关于癌症发生的前因后果的解释比较混乱，为此我必须要梳理一下2008年初，《细胞》(CELL)杂志有一专刊，认为把端粒长度控制在细胞分裂20次左右可保持不生癌。我认为这一设想是错误的。癌基因是正常细胞不可缺少的基因，在细胞的正常增殖过程起到关键作用，据此可以说没有什么癌基因，而应该把癌基因改称为“细胞增殖基因”。大多数的癌基因被激活时，端粒酶的活性会升高。儿童患癌的几率比老年人低很多，且儿童的癌基因和端粒酶的表达活性比老年人高得多；已知再生过程癌基因表达会升高。把蝾螈的眼睛的晶体剔除，把很强的致癌物质注入眼球中，结果没有生癌，而出现晶体再生(江口吾朗、渡边宪二，1986)。 因此，癌基因表达活性的高低与癌症的发病率无关，因为在癌基因和端粒酶活性高的细胞中，细胞的抗氧化能力和DNA的修复能力显著高于癌基因表达活性低的细胞。同样，论端粒长度，儿童比老年人长，癌基因表达活性、端粒酶活性也高于老年人，细胞的抗氧化能力、 DNA修复能力及免疫力也比老年人高，故癌症发生率」L童比老年人低。此外，有很多可以激活癌基因和端粒酶的物质反而是很好的抗癌药，如植物血凝素(PHA)。所谓的衰老基因已经发现了几十个，大多数是抑癌基因，这些基因是通过影响端粒长度来影响细胞寿命的，据此可以说这些都不是决定衰老的基因或说没有什么衰老基因。但是，各种能够促进细胞增殖的因素确实会提高癌症的发生概率，如激素、生长因子、蛋白激酶C激活剂等等，这些因素主要是通过激活端粒酶来促进细胞增殖的，但端粒酶仍然不是导致癌症的真凶，而是细胞在增殖过程中，染色体和DNA在复制时更容易发生损伤。而一些致癌的化学物质或物理因素则是通过增加染色体和DNA的损伤率来增加癌症发病概率的。抑癌基因P53较特殊，不能把它看成一般的抑癌基因，它是通过修复和清除突变的细胞来降低癌症发病率，延长个体寿命。而非通过抑制端粒酶来降低癌症发病率的， 相反，P53在修复细胞因放射线辐射等因素而导致的DNA损伤时，端粒酶的活性反而显著升尚ο知识链接细胞中产生微核是染色体出现损伤的标志，目前国际专家还在争议手机产生的电磁辐射能否致癌？我认为这要看看手机用的电磁波的频段能否诱发细胞产生微核？以及微核数量。作为抗氧化剂的维生素E能降低微核率，这也许是抗氧化剂能抗癌的缘由。在细胞水平上，引起细胞癌变的基本原因是癌基因因各种原因而导致持续地过表达。而导致个体生癌的主要原因是免疫系统功能低下或有缺陷。在同一环境下，某些人容易患上癌症，某些人却不容易患上癌症，这是遗传易感性，即基因出了问题，使细胞容易突变， 或/和免疫系统功能低下。19、如果说端粒只起到保护染色体基因组稳定性的作用，而与衰老无关，那么，当端粒缩短到一定程度时，染色体基因组就会变得不稳定而导致细胞死亡或癌变。据此，即使端粒与衰老无关，要想逆转细胞衰老和防止细胞癌变，就必须要先延伸端粒，否则任何措施都无法挽救衰老与癌变。20、不但个体中的不同器官的衰老速度不一致，而且同一器官或同一组织的不同部位的细胞衰老速度也不一致，例如，人头部的不同部位的头发变白的时间是不一致的；眉毛、毫毛和头发都是毛发，但长度与直径却各不不相同，这说明同样是生长毛发的干细胞， 分化性状只有相似而没有完全相同。造成这一现象的原因可能与细胞分化性状的细微差异有关，而这些差异又进一步决定相应细胞的端粒的缩短速度。这和再生区域编码理论差不多，该理论认为，个体由众多区域镶嵌而成，每一区域具有自己特定的遗传编码(Slack， 1980)。因此，来自个体同一部位的间充质干细胞，能否完全分化和替代个体的所有的器官组织的功能还是未知数。21、一般认为鼠类的衰老与端粒或端粒酶无关，我认为鼠类的衰老也与端粒缩短或端粒酶活性降低有关(黄必录.端粒衰老学说具有普适性.中国老年病杂志，2006， 3(2) :101.)。2011年中央电视台10套《科技之光》报道，美国斯坦福大学科学家成功用端粒酶激活剂使相当人80岁的小鼠发生返老还童，这如果是真实的，就可以证明鼠类的衰老与端粒是有关的。我把这一消息告诉福建师大傅文庆教授，傅教授说“我购买了这篇文章的原文并已阅读。意思是在生命早期就阻止端粒酶基因表达，青年期小鼠就像老年期小鼠一样衰老(早衰)；然后用4-羟基三苯氧胺重新激活端粒酶基因，早衰小鼠又重新回到青年期”。鼠类端粒较人类长，而且在细胞衰老过程端粒缩短幅度较小，但寿命反而比人类短，这可能是鼠类基因的表达活性与端粒长度的剂量关系比人类高效，就像同一种药物，同一剂量，有的人对它敏感，有的人对它不敏感。22、限制能量的摄入可以延长小鼠最大寿命一倍，由于线粒体在进行能量代谢时会产生大量的氧自由基，已证明自由基可使端粒缩短，作为自由基清除剂的维生素E也能使培养的细胞分裂次数增加一倍，于是科学家就认为限制能量摄入导致动物寿命延长的机制是通过减少自由基对端粒的破坏。但自由基清除剂并不能延长动物的最大寿限(Harman， 1960)，因此，把限制能量的摄入的延寿机制归结于是减少自由基对端粒的破坏是不完全正确的。由于各种DNA合成抑制因素都会加速端粒的缩短、衰老的细胞也会产生DNA合成的抑制剂、用促进DNA合成的物质也能显著提高动物的寿命。据此我认为(黄必录.衰老的机理意义及治疗.燕京医学通讯，1998 ；66 :1056，本文约3万字，介绍了许多衰老领域的前沿理论，是内部刊物，要索取本文请到燕京函授医学院，地址北京市海淀区复兴路21号(公主坟西北侧卫国中学内))能量代谢主要是通过4个抑制DNA合成的途径来缩短动物寿命的，举例(1)摄入能量越多，能量代谢也越快，产生的三磷酸腺苷(ATP)也越多，ATP能反馈性地抑制其它核苷酸的磷酸化，从而产生阻抑DNA的合成效应。造成自由基清除剂如维生素E能使培养的细胞分裂次数增加一倍但却不能使个体的寿命提高一倍的原因是(1)维生素E在提高细胞分裂次数的同时又提高了细胞分裂频率，以致在一定时期内提高了细胞的分裂次数；(2)个体内的维生素E的浓度不能像培养液那样高。23、在细胞水平，缺乏端粒酶活性的细胞，端粒缩短速度比端粒酶活性高的细胞更快。但在个体水平，胚胎期端粒缩短速度比成人期和老年期快一倍以上，而且胚胎期的(胚胎体细胞有端粒酶活性)端粒酶活性比成人期和老年期高，这与一般认为端粒酶活性高， 端粒缩短速度就慢相违背。由于端粒酶活性的高低与细胞分裂频率呈正相关，而且细胞有丝分裂是造成端粒缩短的原因，因此，胚胎细胞因端粒酶活性比较高，在一定时期内细胞分裂次数就多，这样就会造成胚胎端粒缩短速度比成人期和老年期快。此外，端粒酶活性和端粒结合蛋白 (TRFl)的活性是呈正相关的。因此，端粒酶虽可延伸端粒，但TRFl却会抑制端粒延伸，两功互相抵消甚至端粒缩短的更快，这也是导致胚胎细胞端粒酶活性虽高，端粒却缩短的更快。上述的美国斯坦福大学用端粒酶抑制剂使小鼠早衰，然后用端粒酶激活剂又使它恢复年轻，其原因也是抑制端粒酶活性时，个体在同一时间下端粒缩短速度并没有加快，因此，重新激活端粒酶时，小鼠就会恢复青春。这也是一些人根据实验误认为端粒或端粒酶与鼠类衰老无关的原因。既然端粒酶活性升高对延缓端粒缩短速度作用不大，那干细胞为什么还要保持端粒酶的活性？我认为端粒酶的主要作用是因不同类型的细胞需要不同的分裂活性和不同的端粒长度，而保持不同类型细胞端粒酶的不同活性就可以调制出不同的细胞分裂活性和不同的端粒长度。下面介绍几种延伸干细胞端粒的途径1、用体细胞制造全能干细胞，再把全能干细胞诱导分化成多能成体干细胞，如具有多向分化潜能的造血干细胞、间充质干细胞等，然后把多能成体干细胞移植入人体内。2007年，日本和美国科学家把0Ct3/4、SOX2、C-myC等基因传染小鼠成纤细胞后出现重编程，转化的细胞具有类似ES的功能特点，称为诱导全能干细胞(iPS)，iPS可能是由 0ct3/4, Sox2等基因通过间接激活去甲基化酶、构建性甲基化酶、端粒延伸有关的酶等基因，使基因组经历了全面去甲基化和重新甲基化，即重新编制细胞分化程序(重编程)，并延伸端粒(储备足够长度的端粒)。c-myc已证明可以直接诱导端粒酶催化亚基基因表达。基因传染法转化的iPS效率很低，有致癌风险，2010年，美国哈佛大学科学家用人工合成的0ct3/4，SoX2等基因的mRNA诱导体细胞重编程，转化iPS的效率比基因传染方法提高了 40 100倍，速度提高2倍，也没有至癌风险。原生殖细胞癌(畸胎癌)可多方向分化，例如在瘤内可以见到许不产同的组织。原生殖细胞癌中能够诱导细胞重编程的0ct4基因有表达，而体细胞该基因是处于关闭状态， 细胞中的DNA也是非甲基化的。因此，用原生殖细胞癌的胞质体(Cytoplast)与体细胞的核体(Karyoplast)融合也有可能诱导细胞重编程。如果能从培养的畸胎癌中抽提出脱分化物质和各种决定子，先把体细胞脱分化(去甲基化)，然后往脱分化后的细胞添加相应的决定子来制造我们所需要的细胞，如添加造血干细胞决定子，就分化成造血干细胞……。我曾经(黄必录.燕京医学通讯，1998 ；66 =1058,1060)提出，转化(年轻化)的干细胞可能会表达胎儿免疫没有识别的胚性抗原，会引发免疫排斥。《参考消息》报2011. 5. 16 日第七版题为“人工干细胞动物实验失败”，的报道英国科学家把iPS移植到小鼠体内遭到排斥，原因是0ct3/4基因的产物是胚胎干细胞独有的，没有经过胎儿免疫识别，在成人没有表达，并且用病毒载体诱导转化的iPS遭到排斥的强度比mRNA诱导转化的iPS强。我认为刚诱导转化的iPS需要培养一段时间，使0ct3/4基因停止表达后再移植到个体内就可避免免疫排斥。2、抽提老年人衰老的多能成体干细胞(如具有几乎具有全能性的造血干细胞和间充质干细胞)，在体外培养的条件下设法让它的端粒长度延伸到141Λ左右，然后再把成体干细胞的悬浮液注回老年人体内，成体干细胞会通过血液循环并自动迁移和定居到相应的器官组织中。在器官组织中的少量幼稚的多能成体干细胞，一方面通过细胞自我复制以增加组织中年轻的多能成体干细胞的基数，另一方面通过细胞分化以替代组织中衰老的非干细胞。细胞分化是个体正常生理所必须的，而端粒缩短是驱动细胞不断向前分化的推力。因此，体细胞必须要想出一套防止端粒净延伸的办法，以防止体胞端粒因各种问题而发生净延伸所造成的细胞分化的停滞或倒开车(即癌变)。曲于成体干细胞含有能够延伸端粒的端粒酶，因此，就必定有相应的抑制端粒延伸的负调控因子。我认为只要设法打破与端粒长度有关的的正调节因子与负调节因子的平衡，使正调节水平大于负调节水平，人类也能像水母类、海鞘类等低等动物在一定条件下实现实质性的返老还童。瑞士科学家Q011)发现，端粒会以自身的DNA作为模板合成RNA，细胞处于这种状态时会影响端粒的延伸，因此，这也算是端粒长度的负调控因子。前苏联曾经有人用能抑制 RNA合成而不抑制DNA合成的橄榄霉素喂养果蝇，使果蝇寿命延长20 30%，这可能与抑制端粒合成RNA有关吧。很多低等动物都有很强的再生能力，水螅身体的碎片能再生为完整的个体；涡虫身体1/100的切片也能再生成完整的个体；蜗牛饥饿时，可自消化内部器官及肌肉作为营养，一旦获得食物，各器官可再生复原。这是因为在这些动物的组织中含有“全能成体干细胞”。如果人体也含有能分化成所有器官组织中的干细胞的全能成体干细胞，那么只要让这一种全能成体干细胞返老还童，个体就会跟着发生返老还童，这样，逆转个体衰老将变得非常容易。小鼠用致死量的放射线照射时，包括骨髓在内的全身所有的器官组织中的成体干细胞都会被射线杀死，但只要移植骨髓就可以让小鼠活下来，这提示骨髓中也许有一二种干细胞可以分化成个体所有器官组织中的成体干细胞。幸运的是，在鼠类、人类骨髓和皮肤中，美国和日本科学家分别发现两种相当于全能成体干细胞，称迈阿密细胞(Miami)和缪斯细胞(Muse)，它们也能分化为具有内脏中胚层、神经外胚层和内胚层特征的细胞。缺点是这些全能成体干细胞的数量太少，增殖缓慢， 而且老年人更少。细胞中的端粒酶的活性越高，细胞增殖活性越大，而且端粒酶在细胞增殖过程起到决定性的因素，因此，可以向培养的Muse中添加端粒酶催化亚基试剂，促使Muse大量扩增，当扩增到一定数量时停止供应端粒酶催化亚基，细胞马上会停止分裂。导致正常细胞癌13变的机制是因为基因突变、癌基因插入、以及病毒的寄生等造成端粒酶不可控地持续高表达，使细胞不停地分裂。因此，用端粒酶催化亚基试剂即能扩增干细胞，又不会引起细胞癌变。由于细胞分裂次数与端粒长度呈正相关，因此，端粒越长，干细胞的用量可以越少。据此，我们可以把自体衰老的Muse分离出来，在离体培养的条件下设法把端粒延伸到 141Λ，然后只要把含有少量Muse的悬浮液从血管注入到自体，Muse随着血液循环移居回骨髓等组织中并自我复制，以增加骨髓等组织中的Muse基数，同时年轻的Muse再分化成造血干细胞、间充质干细胞等干细胞，再由造血干细胞等干细胞通过迁移和分化来更新个体所有的器官组织的细胞，使整个个体逐渐返老还童。精子的端粒长度是151Λ，受精卵分裂成多能成体干细胞端粒会缩短一些，因此， iPS的端粒必须要设法延伸到151Λ ；儿童成体多能干细胞的端粒长度为131Λ，经过增殖后会缩短，因此，治疗用的Muse的端粒长度至少要达到141Λ。体细胞包含有很多DNA正常株和突变株，由于突变株是无法鉴定和分离出来的， 因此必须同时向患者体内注射由许多个自体细胞转化成的iPS所分化的多能成体干细胞或年轻化的自体多能成体干细胞，其中的突变株会被人体的免疫系统清除而得到纯化。3、直接在人体内把组织中的多能成体干细胞的端粒延伸到我们想要的长度(即设定逆转的目标年龄)。4、我曾经设想(黄必录.燕京医学通讯，1998 ；66 :1063)用老年人自身的体细胞克隆出的克隆人胚胎，在胚胎发育到几百克并形成免疫耐受时，且又还未产生意识时分离出各种多能成体干细胞(包括免疫细胞)移植入人体内。本方案优点是不存在免疫排斥问题，又能恢复免疫力，也省去对胚胎干细胞进行诱导分化成多能成体干细胞的工序。下面是比较容易延伸端粒的方案1、激活癌基因激活癌基因可以激活端粒酶，同时也会降低cAMP和升高cGMP，使各种成体干细胞自我复制率大于分化率，从而增加组织中的成体干细胞数量，使衰老的组织细胞逐渐逆转年轻(黄必录.燕京医学通讯，1998 ；66 1058 1060)。2010年8月8日《参考消息》报第7版标题为“新技术能使肢体再生梦成真？，， 说美国斯坦福大学一研究小组用激活癌基因方法成功的使小鼠肌肉细胞逆转年轻。我把这一消息告诉福建师大傅文床教授，傅教授告诉我，我的1998年的文章的观点，是在我国童坦君院士的实验性文章0篇)寄到《生物化学杂志》之后(尚未发表)提出的。激活癌基因可以通过激活端粒酶来延伸端粒的，也可以通过同源重组来延伸端粒。例如，科学家发现抑制抑癌基因P16表达可使端粒缩短减缓，但并没有出现端粒酶活性升高；已知无端粒酶的肺癌也有P16基因突变。抑制P16基因延伸端粒的机制与抑癌基因Rb有关。由于P16和Rb之间有代偿作用，据此我认为P16和Rb要同时抑制。黄芪碱 (HDTIC)可使P16基因表达下降。同样是空心菜(蕹菜)，不同的品种在对能激活逆转衰老的措施时的反应灵敏度也不一样，如大叶空心菜扦插株不会逆转衰老，而小叶空心菜(又称藤蕹)扦插株会完全逆转衰老。大叶空心菜是小叶空心菜突变种，因为基因突变而失去返老还童的能力；某些低等动物靠分身繁殖或长时间饥饿会逆转衰老，而高等动物却不能。这可能是小叶空心菜或低等动物响应返老还童的信号通路比高等生物更灵敏。据此，可用药物抑制抑癌基因的方法来激活人体细胞内的癌基因，并使激活强度超过能够使端粒发生净延伸的阈值。但不要去抑制抑癌基因P53。2、抑制TRFl活性已发现人类端粒有2种结合蛋白质，TRFl和TRF2，以及几种具有调节端粒结合蛋白作用的端粒相关蛋白。TRFl会与端粒DNA结合在一起，使端粒酶或DNA重组酶无法接近端粒末端发挥作用，因此，TRFl是端粒延伸的负调控因子。早期卵裂胚胎中可见一种称为Rad50的DNA结合蛋白与TRFl共区域化，此时端粒酶活性虽然丧失，但端粒却通过了同源重组而得到快速延伸。在囊胚期，Rad50减少，而端粒酶活性增加，但端粒却缓慢延长。我国黄河教授等发现， TRFl表达量与肿瘤端粒酶活性呈正相关。因此，多数癌细胞的端粒比正常细胞还短的原因与TRFl高表达有关。而合成TRFl突变体的细胞株端粒则较长。精母细胞的端粒DNA是裸露的DNA，没有端粒结合蛋白，因此，端粒酶可以充分地接近端粒末端并高效地延伸端粒，因此，精子的端粒最长。Susan Smith等人报道，在人细胞中发现了一种称之为tankyrase的酶，该酶可以修改TRFl，使TRFl不能与端粒DNA结合，从而使端粒延伸。tankyrse在胞浆和胞核都有分布。据此，可用TRFl的反义寡核苷酸、抗体、或tankyrase及tankyrase的基因质粒来抑制或修改体内或体外培养的多能成体干细胞的TRF1，并同时激活端粒酶(起增效作用)， 使端粒发生净延伸。本方具有专一性，只针对具有端粒酶活性的各种干细胞起作用。TRFl的反义寡核苷酸和TRFl的抗体一起使用效果更好，反义寡核苷酸抑制表达 TRFl基因表达，抗体与已有的TRFl结合，以达到彻底消除TRFl的效果。向培养的多能成体干细胞注入tankyrase的基因和端粒酶的催化亚基hTRT基因构建的一个质粒表达载体、或人工合成的tankyrase与hTRT的mRNA、或tankyrase与hTRT 的蛋白也许是延伸端粒最好的办法。注意，由于TRFl是端粒延伸的负调控因子，据此，很多人很容易想到用TRFl的抑制物质来延伸成体干细胞端粒，但是，如果没有同时激活端粒酶，端粒延伸的效果还是微乎其微的。3、向细胞转染预合成的端粒DNA片断大约有2%的癌细胞不含端粒酶(I hySu，1999)。因此，生殖细胞有可能是靠同源重组来快速延伸端粒的，否则，体细胞中不会存在这种延伸端粒机制的基因组合，以致不会突变出这种癌细胞。一篇发表在《Nature Cell Biology》杂志上的一篇报道“卵母细胞和精原细胞的端粒比体细胞短，但通过减数分裂端粒长度会大幅度增加，在端粒酶缺失的小鼠的早期分裂胚胎中发现端粒竟然也会延伸，在成熟卵母细胞和卵裂期胚胎中，端粒酶活性降低或消失，端粒长度却大幅度增加，之后胚泡中又重新恢复端粒酶活性，同时伴随着端粒酶活性的增加，端粒延伸却减慢。为此科学家们得出结论，认为在早期卵裂时，端粒延长可能是由于同源重组机制，而从囊胚期开始，端粒酶仅是维持已经确定的端粒的长度”。在受精卵中，端粒的延伸是靠端粒DNA的同源重组；在无端粒酶活性的永生化癌细胞中，其端粒长度的维持也是靠一种特殊的染色体外端粒重复序列DNA。在这类癌细胞中，已发现一种核小体的特殊形式(包括端粒DNA，端粒特异结合蛋白，参与重组的蛋白)通过同原源重组来延伸端粒。据此，可向干细胞内输入外来的端粒重复序列DNA，如人工合成的长度达到IlAd的端粒DNA片段，在一些能连接端粒DNA片段的酶的作用下把端粒DNA片段连接到染色体端粒DNA的末端，使多能成体干细胞的端粒跳跃式地净延伸。4、向干细胞内输入端粒酶RNA组分(TR)端粒酶是以TR为模板利用逆转录酶活性来延伸端粒的。人类细胞永生化后的端粒酶活性可上升100 2000倍，但hTR mRNA最多仅提高2倍。在HeLa细胞中表达hTR的反义分子，将导致细胞衰老。屈艺等人设计并合成了针对端粒酶RNA组分的锤头状核酶基因，导入HeLa细胞后使端粒酶活性降至原来的1/8 1/10，传至19 20代时出现95%凋亡。这说明TR是端粒延伸的主要限制因子。据此，可向干细胞内输入外来的TR，并激活端粒酶(起增效作用)，使端粒净延伸。5、激活端粒酶和同时阻滞细胞周期来延伸端粒激活端粒酶时，TRFl的活性也会上升，因此，虽然端粒酶会延伸端粒，但因TRFl会抑制端粒酶延伸端粒，因此，端粒延伸非常困难，再加上激活端粒酶会启动细胞分裂，而细胞分裂可使端粒DNA丢失，因此，癌细胞虽含高活性的端粒酶，但多数的癌细胞的端粒短于正常细胞，以及含有端粒酶的成体干细胞，端粒照样会地不断缩短。精母细胞(含有高活性的端粒酶)到转化成精子的过程是长期停在Gl期的，这可能是使精子端粒长达151Λ的原因；致死量以下的X射线等辐射可激活细胞内端粒酶和同时抑制细胞分裂，使老鼠、果蝇寿命延长。日本的广岛和长崎两市的居民平均寿命高于全国的原因也许与原子弹爆炸余留下来的核辐射有关。辐射延长寿命的机制是射线使DNA损伤，损伤的DNA会激活“DNA损伤感应蛋白”， 然后再由DNA损伤感应蛋白使蛋白激酶ART和ATM磷酸化并激活下游的Chk2激酶，再由 Chk2激酶告诉抑癌基因P53，再由P53激活抑癌基因P21而抑制细胞分裂，使细胞周期阻滞在^广或&/M期。以便细胞赢得时间去修复受损的DNA。因此，被认为是衰老基因的P53 和P21在有些条件下表面上看似乎会使细胞变老，实际是在逆转衰老。据此我们可设法使成体干细胞内的蛋白激酶ART和ATM磷酸化或直接导入磷酸化的蛋白激酶ART和ATM来蒙骗DNA修复系统，在不损伤DNA的情况下，使成体干细胞以为是 DNA发生了损伤，以此来激活多能成体干细胞的端粒酶和P53基因，使多能成体干细胞的周期停滞，端粒发生净延伸。从上知道，在激活端粒酶的同时，让细胞周期处于阻滞状态，就可以使端粒发生净延伸。据此，可向离体培养的多能成体干细胞里加入非细胞毒性的细胞周期阻滞剂(1992 年，Holt发现，有毒的细胞周期阻滞剂会使端粒酶活性丧失，而无毒的周期阻滞剂则不会) 和端粒酶激活剂，使端粒发生净延伸。在细胞周期中,G1和(；2期端粒酶活性升高，S期最高，而在期，其活性受到抑制， G2/M期完全丧失，据此，可将细胞周期阻滞在G1期、S期或(；2期。以上的各种方案也可以组合使用，以增强效果，争取实现端粒延伸速度超过缩短速度，使端粒达到净延伸水平
本发明的目的是提供逆转干细胞衰老的方案，使个体中衰老的器官组织逆转年轻，从而使各种与增龄有关的疾病不治而愈。按此目的提供的逆转干细胞衰老的方案，包括1、用癌细胞的胞质延伸干细胞的端粒，把端粒较长的癌细胞的胞质体和衰老的多能成体干细胞的核体融合，利用癌细胞中高效的端粒修复系统使干细胞的端粒净延伸；2、同时激活端粒酶和抑制细胞分裂，其特征是，用端粒酶激活剂激活个体中的成体干细胞的端粒酶，同时绝食，使细胞中的端粒酶活性升高，细胞又不能分裂，使成体干细胞的端粒净延伸。所述的癌细胞的胞质体来自端粒比正常体细胞端粒还长的有端粒酶活性的癌细胞，如HeLa细胞，或一些无端粒酶的肺癌细胞。所述的端粒酶激活剂是蛋白激酶C的激活剂，如植物血凝素(PHA)。本发明延伸干细胞端粒的方法比较简单，技术是现成的。端粒长度在4-39岁时每年平均减少84bp，40岁以后，每年只平均减少41bp (Iwana等1998)。因此，只要把老年人体内的成体干细胞的端粒长度从8 91Λ延伸到101Λ，就可以使衰老的器官、组织甚至个体年轻大约20年，进而使各种与增龄有关的疾病不治而愈。下面对本发明做进一步详细描述。逆转干细胞衰老的方案，包括1、用癌细胞的胞质体延伸干细胞的端粒以HeLa 细胞延伸造血干细胞端粒为例，(1)癌细胞胞质体制备，用细胞松弛素WCytochalasin B， CB)处理HeLa细胞，然后再通过离心力使核体与胞质体分离，从而得到HeLa细胞的胞质体；( 造血干细胞核体制备，用细胞松弛素B处理造血干细胞，然后再通过离心力使核体与胞质体分离，从而得到造血干细胞的核体；(3)融合，采用电融合技术，融合率高达80%。 把HeLa细胞的胞质体与造血干细胞的核体以2比1混合进行融合，得到“癌细胞质-干细胞核的杂种细胞”。(4)把癌细胞质-干细胞核的杂种细胞培养150小时；(5)制备癌细胞质-干细胞核的杂种细胞的核体，再与HeLa细胞的胞质体再融合，培养和融合重复3次，然后把癌细胞质-干细胞核的杂种细胞制成细胞悬浮液注回造血干细胞供应者体内。细胞性状是由细胞核上的染色体的基因决定的，因此，待癌细胞的胞质成分被细胞核表达的成分更新后，癌细胞质-干细胞核的杂种细胞的性状会回复为干细胞的。造血干细胞在体内可以分化成多种组织的细胞，从而使衰老的器官组织发生返老还童。由于造血干细胞比较稀缺，为了提高融合率，所述的融合用的HeLa细胞的胞质体与造血干细胞的核体的比例为2比1。将失去分裂能力的鸡红细胞核与HeLa细胞(宫颈癌细胞)融合，可以看到癌细胞中有的蛋白质向红细胞核中转移，使红细胞核重新开始DNA复制和RNA合成(Harris等 1965，1974)。因此，癌细胞有使衰老的细胞恢复青春的能力。多数癌细胞端粒的长度比正常细胞短，但有少数的癌细胞的端粒比正常细胞长， 如有端粒酶活性的HeLa细胞和少数无端粒酶活性的肺癌细胞。据此，可以选用端粒较长 (如果有长达151Λ以上的癌细胞则最好)的癌细胞的胞质体和衰老的多能成体干细胞的核体融合，使多能成体干细胞的端粒发生净延伸。由于胞质因子存在半衰期，因此，融合后的多能成体干细胞的核体，即所述的癌细胞质-干细胞核的杂种细胞的核体要多次再与癌细胞的胞质体再融合，重复数次，才能把干细胞的端粒延伸到目标长度。每次再融合的间隔大约是150小时，这是因为150小时后癌细胞的胞质成分的活性开始降低。Muse细胞、造血干细胞至今在体外培养的条件下还难于增殖，用癌细胞的胞质体与Muse细胞、造血干细胞的核体融合就可以启动DNA合成，使Muse细胞、造血干细胞增殖。如果癌细胞的线粒体DNA与患者差异较大，为了使多能成体干细胞的线粒体DNA 不混有癌细胞的线粒体DNA，融合所用的癌细胞要换上融合所用的核体的线粒体。方法可用线粒体毒素若丹明(rhodamine 6G，R-6G)除去癌细胞的线粒体，然后再与融合所用的胞质体融合，就可以使癌细胞的线粒体DNA换为融合所用的核体的线粒体DNA。干细胞分离、干细胞移植、细胞培养、细胞排核、细胞融合、替换线粒这些方法都是现成的，不详细赘述，请参看相关文献。2、延伸成体干细胞端粒的配方植物血凝素40 60mg，溶于生理盐水60ml中静脉缓慢推入，每日一次；同时口服维生素C 40mg、维生素E 20mg、维生素B12 ang、叶酸 0. 5mg、肌醇40mg，氧化锌0. 8mg、硫酸镁40mg、硫酸亚铁5mg，每日2次。使用延伸成体干细胞端粒的配方期间不要运动，并绝食(只喝点含有多种维生素和矿物质，但不含能量的饮料，即饥饿疗法)，每次治疗时间根据各人的体质不同而已，一般 30天左右，因为人只要有水，可以挨饿50 60天。植物血凝素是蛋白激酶C(H(C)的激活剂。激活蛋白激酶C能促生长因子分泌，生长因子能激活myc表达，而myc可激活端粒酶(Wang等，1998)。肌醇是肌醇磷脂第二信使系统中的一个成员，它可使该系统代谢增强，生成更多的二酰基甘油(DG)，而DG也是蛋白激酶C的激活剂。植物血凝素可增强免疫，用来治疗急性白血病、多种癌症、再生障碍性贫血，也能使老年神经细胞逆转年轻(Zs-Nagy，1979)。在体外，植物血凝素可使人T细胞端粒酶活性增高 500 1000 倍(Bodnar, 1998)。干细胞比非干细胞幼稚，更容被端粒酶激活剂如PHA激活。这是我们所期望的。培养的细胞在缺乏能量物质葡萄糖时，细胞周期会被阻滞。在一些抑制细胞周期的因素存在时，细胞周期完全受阻，此时myc会促使细胞凋亡。因此，在同时激活端粒酶和使细胞周期阻滞时，有些情况下必须要阻止细胞发生凋亡。已发现自由基可加速端粒缩短速度，而维生素E(Ve)和维生素C(Vc)作为抗氧化剂不但能够显著降低端粒的缩短速度， 而且能够抑制细胞凋亡。细胞凋亡的第一步是各种病理或生理刺激对线粒体渗透性转换 (permeability tranaition PT)的作用，使PT孔开启，这是凋亡发生的初始和限速事件，而抗氧化剂能抑制线粒体PT孔开启，从而抑制细胞凋亡发生。Ve与Vc合用，抗氧化效果则更好，因为Vc对Ve受自由基破坏后有再生复活作用。 维生素B12、叶酸0. 5、氧化锌、硫酸镁有利于DNA合成、硫酸亚铁可有利于提高红细胞功能， 缓解因细胞分化受到抑制所引起的红细胞生成的不足。体细胞有两种状态功能态和增殖态。为了维持个体的正常生理，绝大多数的体细胞都必须处于功能态。与端粒延伸有关的基因被激活时，体细胞会由功能态切换为增殖态。 如果大部分细胞处于增殖态，不但器官组织的功能会严重下降(这对个体是有害的，是长生不老药至今没有出现的原因之一)，而且细胞在分裂时端粒DNA片段会发生丢失。此外，处于增殖态的细胞，细胞分化就会停滞，终未细胞如红细胞等有一定寿限，细胞停滞分化时它照样死去，而人体又不能没有红细胞。肝切除再生或肝中毒导致肝细胞生长因子升高(可升高到正常水平的13-17倍) 时，会使肝细胞超微结构改变，白蛋白合成下降，原来很少或不合成的甲胎蛋白上升。同时胆汁分泌及清除能力也下降。因此可以说，大量的体细胞在大幅度地激活端粒酶时，虽然可以让细胞长生不老，却会要个体的命，也可以说，虽然我们能够使细胞长生不老，但是却不能使个体长生不老。据此，在激活端粒酶的同时，必须要降低个体的代谢强度，如少运动，绝食。由于代谢率下降，产生废物就会减少，就可以缓解肝脏的工作压力。据说气功大师在修炼某些气功达到高级阶段时，会自发产生绝食，称“辟谷”，他们认为辟谷可以延寿。据报道，台湾有人让不再产蛋的鸡进行辟谷，结果恢复了产蛋。我认为饥饿不但可通过降低动物的代谢强度，从而降低了个体对正常生理的要求，如产生代谢废物减少，以缓和肝脏处理废物能力下降的矛盾，而且会使细胞周期停滞，例如，在培养基在适当缺乏能量物质(葡萄糖)或某些必须的营养成份时，细胞就会停在G1期，而此时处于其它周期的或突变和过度衰老的细胞却会死亡(已发现饥饿会清除体内突变的细胞，由此会降低癌症发生率)，因此，在给药期间必须要绝食。绝食的主要目的是让细胞周期停滞。衰老并不是不可逾越的自然规律，很多低等动物如水母类、海鞘类、扁形动物三肠类等在长时间饥饿时会发生了反向发育，发生了实质性的返老还童。可能是这些低等动物在长时间饥饿时，会使附着在组织细胞外的细胞间质成分和细胞内的垃圾成分降解，以及使衰老和病变的细胞发生凋亡和降解，这些降解物又作为干细胞的营养物质使细胞恢复分裂(蒋松柏，1994)。我认为饥饿引起细胞周期停滞的同时，会启动与端粒延伸有关的基因大量表达(细胞间隙成分的降解会降低细胞的接触抑制，而接触抑制会使端粒酶活性下降)，从而使多能或全能的成体干细胞的端粒延伸量大于缩短量，随着端粒不断地净延伸， 衰老的细胞和个体就自然会发生逆转，从而使个体发生了反向发育和返老还童。如果在治疗时能够抑制TRF1，端粒延伸效果则会更好。知识链接细胞融合证明细胞衰老过程会产生DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂会抑制端粒DNA的延伸。作为细胞的能量物质ATP会间接抑制DNA的合成，而脱氧胞嘧啶核苷(dcd R)、限食可解除这种抑制。降低cAMP或和升高cGMP的物质也能提高DNA的合成 (如N-甲基酪胺等)。如果能够适当服用与DNA合成有关的各种维生素、微量元素及氨基酸，DNA合成前物质如核苷酸等则有辅助所述的饥饿疗法。激活蛋白激酶C可使T细胞增殖，原因是PKC能促IL-2分泌作用。PDGF也有激活PKC作用。DG、佛波脂A(PMA)十二癸豆寇(TPA)属单纯促癌剂(Promotor)。即只有促癌而无诱癌作用。它也是PKC激活剂。RNA 酶抑制剂(如黄芪多糖等)能够防止mRNA的降解，这也会提高端粒酶活性和细胞活力。由于意识不能自我本位地复制，因此，虽然衰老问题解决了，每个人还是只能活一次，这是由意识的本质决定的。所谓的意识是什么？的机器人和人身上有都有各种传感器， 机器人的电脑和人的大脑都会通过运算再发出各种指令，但大脑能够知道自己在干什么， 能够知道自我和外界的存在，这种现象称“意识”，而电脑却不知道自己在干什么，不知道自我和外界的存在，因此，电脑不具备意识。也就是说，意识就是大脑中产生的一种能够知道自我和外界存在的神经