专利名称：诱导肝干细胞及其制造方法、以及该细胞的用途的制作方法制药企业的新药研究开发均存在研究开发周期长且研究开发费用高的问题。并且，现状是虽然存在多个预期将来将成为新药的候补，但随着研究开发的进展而产生有效性、安全性的问题，其中的大半不得不放弃开发。通常，开发新药需要长达9 17年的较长时间和数十亿元 数百亿元的巨额研究开发费用，因此可以说，若存在能够在临床前等早期阶段缩小候补化合物范围的新药发现工具，则能够减少其开发费用。然而，在目前的非临床试验中，在药物的安全性、毒性等的评价中，必须使用动物进行试验，这也是开发费居高不下的原因之一。此外，由于人和动物的种间差异，有时药物在生物体内的动态是不同的，因而有时无法对安全性进行充分评价，进入临床试验阶段才获知候补化合物具有毒性而放弃开发。因此，非常希望建立在研究开发的早期阶段对候补化合物在人活体内的动态等进行预测及评价的评价体系，目前已经开展了以构建使用人肝细胞的评价系统来代替具有“种间差异壁垒”的界线的动物实验为目标的研究。这样的评价系统由于能够在药物开发的早期阶段准确地筛出安全性高的候补药，因此在制药企业中存在较大需求。目前的使用人培养细胞的非临床试验中，使用的是外国人的原代培养肝细胞或已有细胞株等。然而，原代培养肝细胞存在供体稀缺、批次差异非常大的问题。尤其是，日本人的原代培养肝细胞由于伦理问题及法律限制而非常难获得，无法实现稳定供给。进而，肝脏中表达的药物代谢酶发挥着催化多种药物代谢的重要作用，但存在基因多态性且其表达量及活性也存在较大个体差异，因此使得上述非临床试验中的问题更加严峻。此外，为了应对数量庞大的个体的差异，希望能够以囊括这些差异的来自多个供体的原代培养肝细胞作为代表细胞而重复用于各种试验。然而，即使在培养皿中培养原代培养肝细胞，也几乎无法进行增殖培养，因此还存在实际中无法对该肝细胞进行继代培养并反复用于各种试验的问题。另一方面，现有细胞株大多是发生了核型异常的细胞，此外，也不存在囊括数量庞大的个体的差异的多个细胞株。进而，通过现有方法长期继代培养的现有细胞株由于未显示出与原代培养肝细胞同样的药物代谢酶活性、转运蛋白诱导能力，因此无法由其结果预测临床中对人的安全性、代谢等。由上述诸多情况可知，虽然期待具有肝细胞的性质、能够长期继代培养的细胞，但尚未报道从囊括数量庞大的个体的差异的多个供体发现这样的细胞。此外，设想存在肝脏的干细胞、即具有分化为肝细胞能力的肝干细胞。然而，还不存在发现如胚胎干细胞及诱导多能性干细胞那样表达自我复制基因、具有能够长期在生物体外继代培养的性质的肝干细胞的报道。因此，在生物体外，理论上能够分化为所有组织的体细胞、生殖细胞的保持分化多能性且能够以未分化的状态几乎无限地自我复制的胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)(本说明书中以下记为“胚胎干细胞”。)是否不仅能够用于再生医疗而且可以用于 新药发现领域还在研究之中。胚胎干细胞是指由属于动物的发生初期阶段的囊胚期的胚的一部分的内部细胞块制备的干细胞株，取英语的头一个字母时也被称为ES细胞。为了建立胚胎干细胞，需要受精卵或由受精卵进一步发生至囊胚阶段的初期胚。在人的情况下，由于使用受精卵作为材料，认为存在使生命的萌芽消灭这一伦理问题。因此，存在着不允许制作和研究人胚胎干细胞的国家，此外，即使在认为具有治疗帕金森病等神经退行性疾病、脊髓损伤等目前无法根治的疾病的可能性而允许对其进行研究的国家，对人胚胎干细胞的操作也加以严格的限制。因此，胚胎干细胞的基础研究、应用研究中伦理问题是一个较大的障碍。此外，实际中为了使用胚胎干细胞，需要使胚胎干细胞分化为某种特定细胞，积极地开发了分化为肝细胞、神经细胞、心肌细胞、胰岛β细胞等的方法。然而，这样分化为特定细胞较为困难，特别是难以诱导分化为肝细胞。目前尚未建立高效分化诱导为能够用于新药发现研究的高品质成熟肝干细胞的方法。目前报告的所有分化诱导法均需要3周左右的较长时间，花费了较高费用、劳力、时间而高度分化诱导的肝细胞样细胞几乎无法增殖。最近报道了 通过导入0CT3/4基因(0CT3/4为基因名，有时也记作0CT3或4，在本说明书中以下记作POUFI基因。)、S0X2基因、KLF4基因及c_MYC基因(专利文献I)或在碱性成纤维细胞生长因子存在下导入P0U5F1基因、S0X2基因及KLF4基因(非专利文献I )，从而能够由人等的体细胞制作称为诱导多能性干细胞的与胚胎干细胞同样的未分化细胞(专利文献2)。已知的是，人的诱导多能性干细胞(induced Pluripotent Stem Cells;iPS细胞)(本说明书中，以下记为“诱导多能性干细胞”。)具有如下两个特征(1)分化多能性能够分化为形成个体的所有细胞的三胚层，(2)自我复制能力在特定的条件下，能够维持其未分化性状态地在培养皿中无限地继代培养。并且，该人诱导多能性干细胞在形态、基因表达、细胞表面抗原、长期自我复制能力、畸胎瘤(良性肿瘤)形成能力方面与人胚胎干细胞非常类似(非专利文献2、非专利文献3)，进而，报道指出HLA的基因型与其来源细胞即体细胞完全相同(非专利文献3)。通常认为，在该诱导多能性干细胞的制作中，仅仅向细胞中导入P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因、c-MYC基因这4个基因或P0U5F1基因、S0X2基因、KLF4基因这3个基因，即可使已经分化的体细胞“初始化·复位”成未分化的多能性干细胞。然而，人细胞的情况下，用4个基因时仅能以O. 1%-0. 01 %、用3个基因时仅能以O. 01%-0. 001%的效率由体细胞制作诱导多能性干细胞。因此，99. 9%-99. 999%的细胞无法通过基因导入而复位为诱导多能性干细胞。进而，在胚胎干细胞中特异性表达的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因等为对维持多能性干细胞的未分化性而言很重要的因子，可以认为其抑制了细胞的分化。因此，在已分化的细胞中，随着分化基因(分化细胞的性质)的表达，作为对维持未分化性而言很重要的因子的NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因的表达则消失。也即，通常认为，使对维持未分化性而言很重要的因子NANOG基因、P0U5F1基因、S0X2基因、ZFP42基因、SALL4基因、LIN28基因及TERT基因以及分化细胞的多种性质(多个分化基因的表达)一起进行表达的细胞是无法制作的。现有技术文献专利文献 专利文献I :日本特开2008-283972 专利文献2 日本特开2008-307007非专利文献非专利文献I Nakagawa M et al. , Nat Biotechnol. , 2008, 26, 101-6非专利文献2 :Takahashi K, Yamanaka S et al.，Cell, 2007，131，861-872非专利文献3 =Masaki H, Ishikawa T et al.，Stem Cell Res.，2008，I, 105-115因此，本发明人等对于能否制作使对维持未分化性而言很重要的基因和肝细胞的多种性质共存的细胞进行了深入研究，结果发现能够获得不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞，并且发现该诱导肝干细胞在安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验，高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验、新药发现靶标筛选、动物模型的制作、肝脏合成蛋白的生产、及再生医疗中有用，从而完成了本发明。
发明要解决的问题因此，本发明的第I目的在于提供不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞。本发明的第2目的在于提供不仅表达胚胎干细胞特异性基因而且表达肝细胞特异性基因的诱导肝干细胞的制作方法。本发明的第3目的在于提供使用本发明的诱导肝干细胞的安全性试验方法、毒性试验方法、代谢试验方法、药物相互作用试验方法、抗病毒活性试验方法、高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验方法、新药发现靶标筛选方法、动物模型制作方法、肝脏合成蛋白的生产方法、及再生医疗等方法。用于解决问题的方案S卩，本发明的第I发明为特征在于至少具备下述(I) (3)的特征的诱导肝干细胞(权利要求I)。(I)表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的下述表I的基因群中的至少15种基因。[表 I]本发明为在安全性试验，毒性试验，代谢试验，药物相互作用试验，抗病毒活性试验,高脂血症药、高血压治疗药、低分子化合物药物、抗体药物等药物的筛选试验，新药发现靶标筛选，动物模型制作，肝脏合成蛋白的生产及再生医疗中有用的下述诱导肝干细胞、其制造方法及该细胞的用途。一种诱导肝干细胞，其特征在于，至少具备下述(1)～(3)的特征，(1)表达选自作为胚胎干细胞的标志基因的特定基因群中的至少15种基因，(2)具有肝细胞的性质，(3)能够增殖培养或继代培养3天以上。