包含人胚胎干细胞和其衍生物的组合物、其使用方法和制备方法[0001]发明背景[0002]本发明专利申请是国际申请号为PCT/IB2007/002292，国际申请日为2007年3月6日，进入中国国家阶段申请号为200780013128.X的发明专利的分案申请。发明领域[0003]本发明涉及含有人胚胎干(hES)细胞或其衍生物的药物组合物，所述干细胞不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，用于治疗目前无法治愈的、终末的和医学的疾病、病症或失调。更具体说，本发明涉及通过移植方法治疗临床疾病以及绝症或目前无法治愈的疾病的方法。本发明还涉及制备新型干细胞系的新方法，该干细胞系不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。本发明还涉及这类干细胞的分离、培养、维持、扩增、分化、储存和保藏。[0004]大量人类医学失调、病症和疾病目前通过现有药物、手术或移植方法无法治愈，或者说它们是绝症。[0005]干细胞能够分裂产生保持该干细胞特性的“子”细胞，或者产生开始分化为更特化的细胞类型的子代，或者产生各种类型的子代细胞。因此，干细胞在正常人生长和发育中起到核心作用，因其固有特性，它们也是患病或损伤组织再生时新细胞的潜在来源。干细胞存在于所有发育阶段和许多(可能是大多数)成人组织中。来自不同组织和不同发育阶段的干细胞通常情况下产生的细胞数量和类型不同。按照这种分类方法，主要的干细胞类型是胚胎干细胞、体干细胞和胚胎生殖细胞。[0006]受精后最早期(早至8细胞期)，所有胚细胞都是全能干细胞(即它们能够发育成完全发育所需的所有细胞类型，包括胚外组织如胎盘和脐带)。约2-5天后到达胚泡期。在这个50-100个细胞的球内产生内细胞群，它们发育成胚体。内细胞群约占此发育阶段所有细胞的四分之一，是一类独特的干细胞:胚胎干细胞。胚胎干细胞具有分化成200种左右身体细胞类型的先天能力或潜能，被称为多潜能干细胞。hES细胞在发育过程中产生所有组织类型的能力尚未 完全证实，但它们在长期培养和数量扩增时不会改变其细胞基因型或表型，并且在这些条件下维持其多潜能状态。
[0007]胚泡期后，干细胞在胚胎、胎儿和成年人体中所占比例逐步降低。胎儿和成年人中许多(如果不是大多数)组织含有干细胞，它们在其正常位置上具有分化成有限数量的特定细胞类型的潜能，以便在其正常存在的组织中起到再生作用。这些干细胞(躯体干细胞)是多能干细胞，与胚胎干细胞相比它们可能具有更受限的潜能，因为它们通常产生一些，而非全部人体细胞类型。躯体干细胞的主要来源是胎儿和成年人的骨髓和脐带血。[0008]胚胎干细胞用作研究细胞分化事件、药物筛选的重要体外系统，并用作再生性治疗应用所用的特化分化细胞的主要来源。
[0009]多潜能的胚胎干细胞具有产生任何分化的细胞类型的发育潜能。因此，可通过移植hES细胞或其衍生物置换缺陷型细胞和再生患病器官或组织，也通过刺激休眠和垂死组织治疗特定细胞类型的遗传或获得性衰竭或失调产生的疾病。
[0010]将hES细胞或其衍生物移植到人体内可能用作解决未满足的医学需要的方式。
[0011]虽然广泛认为，移植hES细胞将彻底改变各种疾病、病症和失调的治疗但迄今为止，研究仍限于小数和灵长动物的临床前研究。值得怀疑的是在动物模型上观察到的结果能否真实代表将这类细胞移植入人体后发生的事件。而且，因为该观念未临床使用，所以尚未确定和检测干细胞的药物组合物、实验方案、给药途径和给药剂量。而且，虽然临床上已经使用衍生自胚胎外来源的人类干细胞或异种移植其它物种的细胞、组织和器官；但这些尝试大部分不成功，或产生各种削弱性副作用。
[0012]本发明提供将含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物移植入患有各种目前无法治愈的或终结末的病症、疾病或失调的人。
[0013]美国专利5，453，457公开了一种包含原生殖细胞产生的非鼠哺乳动物多潜能细胞和碱性成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和白血病抑制因子的组合物。
[0014]美国专利6，800，480请求保护一种包含在细胞外基质上增殖的未分化hES细胞的
组合物。
[0015]美国专利申请2003/0017587公开了利用不含饲细胞的培养基体外扩增获自流产胎儿或者新鲜或冷冻的卵裂期胚泡的未分化胚胎干细胞。一旦分离后，将胚胎干细胞加入补充有生长因子、胎牛血清、神经元生长因子、白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子或条件培养基的细胞培养基中，由于植入患者后可能产生副作用而不希望出现这些补充成分。同时，所述专利申请并未记载用于治疗遗传或临床疾病的方法，除了患者需要每种细胞类型各一剂。
[0016]美国专利申请2004/0071665提供了使用哺乳动物干细胞治疗心脏病的方法。该例提供分化形成心肌原性细胞群、在饲细胞上培养、然后注射到发生心肌梗塞的小鼠心脏的三个位点的胚胎干细胞。
[0017]美国专利申请2004/0107453公开了获得、维持和分化成人干细胞的方法和它们在治疗性治疗中的应用。
[0018]美国专利申请2005/0124003公开了获得、维持和分化胎儿干细胞的方法和它们在治疗性治疗中的应用。
[0019]具体说与本发明特别相关的是，将胚胎干细胞移植到小鼠脊髓损伤(SCI)模型中明确表明其用于急性SCI的一线治疗的潜能(McDonald等，(1999)Nature Med.5:1410 ；Kerr 等,(2003)J.Neurosc1.23:5131 ;Roy 等(2004)Nature Biotechnology, 22:297 ；Hori等(2003) Stem Cells, 21:405 ；Harper (2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.101:7123)。尽管在动物模型中具有功效，但怀疑会产生移植物抗宿主排斥问题，可能终生需要给予免疫抑制剂以及形成肿瘤和畸胎瘤拖延了对于实验性人体试验中重现临床前安全性和功效的批准。面对设计临床研究并与本发明特别相关的的其它问题是，迄今为止，尚未建立给药方法或方案，没有研究应该使用的治疗有效剂量、活性药物组合物或何种细胞类型或细胞组合。
[0020]因此，本发明目的是开发悬浮于生物相容性溶液、载体或基质，从而适合人用的药物组合物，其含有hES细胞和其衍生物，不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。
[0021]本发明的另一个目的是开发治疗目前无法治愈的疾病或绝症的方法。
[0022]本发明的另一个目的是开发治疗SCI (脊髓损伤)的方法。
[0023]本发明组合物易于制备、安全、经济、有效、易于运输、可扩大规模、具有良好的储存寿命并且不存在诸如抗体-抗原反应、异常神经支配、肿瘤原性、形成畸胎瘤或移植物抗宿主排斥等副作用。另外，本发明只需要一个胚胎，因此不需要连续供应人胚胎。同时，本发明治疗方案不需要使用免疫抑制剂，并且不依赖HLA分型，其对疾病、病症或失调的有效治疗不依赖被治疗对象的人种、性别或年龄，不会消退并且不需要对给药领域技术人员进行预先培训。因此，可以在世界上任何适当装备的临床机构根据本发明实践用药物组合物治疗对象。
[0024]出于治疗目的将人胚胎干细胞植入人体，这类细胞不含污染如细菌、病毒、朊病毒或类病毒很重要。采用标准操作实验规范如优质生产规范和优质临床规范能将这种污染的风险降低至可接受水平。
[0025]然而，通过现有细胞培养方法治疗对患者而言有风险。
[0026]主要风险是给予人对象的药品中存留的细胞培养基组分，因此代表患者发生无法通过动物水平的“安全性”研究来预测的尚未预料到的副作用的风险。
[0027]因此，需要消除这类风险。
[0028]给予人对象的胚胎干细胞培养来源的特征被鉴定为具有以下设计:它能够在延长时间内增殖而不分化，维持在培养期间忠实地保持所有供体特征的核型，在整个培养过程中维持分化成内胚层、中胚层和外胚层的衍生物的潜能，在没有外源因子的情况下培养时不会分化，不产生畸胎瘤，没有免疫原性，不会形成异常的结缔组织和异位组织，会作用于损伤组织，在体内不会连续分裂，如同在天然生命周期中它们会程序性进行这些行为。本发明所述的培养方法和细胞系中应该不存在污染物。
[0029]迄今为止研究的主要动力是开发满足这些要求的培养条件，但迄今为止，尚未通过临床试验发现或验证这类条件。具体说，迄今为止的研究关注于消除小鼠饲细胞作为培养基质和人胚胎干细胞培养物反分化的需要。通过去除饲细胞和补充“条件培养基”提供未知生长因子 的部分补救也在理想培养基中引入了不可接受的风险。饲细胞条件培养基存在下培养的人胚胎干细胞仍然保留了污染的固有风险，因此在移植入人体期间是不可接受的风险。
[0030]设计给予人的人胚胎干细胞培养条件的其它因素是对所给药物组合物中可能存在而在细胞扩增期间必需的培养基的外源性补充剂的残留的疑问。
[0031]它们包括碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子、血清、清蛋白或清蛋白补充剂、氨基酸补充剂、维生素补充剂、转铁蛋白或转铁蛋白补充剂、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素替代物、胶原前体或胶原前体替代物、痕量元素、“条件培养基”残留物、动物产品、饲细胞、生长因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂和维生素补充剂。
[0032]所述其它补充剂的残留物被视作移植人胚胎肝细胞过程中对患者安全性的不必要风险。此外，将这类因子补充到培养基中增加了环境污染的风险，并且提高了干细胞治疗应用的成本，因此限制了它在各种医学疾病、病症或失调中的实用性。
[0033]已采用许多方法降低此类风险，包括:美国专利和申请号5，843，780 ;5，690, 926 ；6，642，048 ;6，800，480 ;5，166，065 ;6，200，806 ;5，453，357 ;6，090，622 ;6，562，619 ；6，921，632，2006/0073587 和 2002/076747。
[0034]然而，这些方法都没有提供一种产生含有人胚胎干细胞和其衍生物的药品的系统，所述药品不含给予人后可能影响人胚胎干细胞和其衍生物的功效和安全性的潜在污染性因子。
[0035]因此，本发明的另一个目的是开发一种以基本不分化的状态扩增hES细胞和其衍生物，以产生易于应用于各种医学疾病的药品的简化细胞培养系统。
[0036]更具体说，本发明的目的是提供一种产生不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的干细胞系的培养技术。
[0037]发明概述
[0038]本发明提供含有hES细胞和/或其衍生物的药物组合物和hES细胞和其衍生物在治疗各种病症、疾病或失调中的应用，其中通过各种给药途径、局部施用或损伤内插入途径将所述干细胞引入人体。
[0039]本发明还提供治疗患有终末的或目前无法治愈的疾病、失调或病症的对象的方法，所述方法包括通过肌肉内、静脉内、尾侧、玻璃体内、纹状体内、实质内、鞘内、硬膜外、目艮球后、皮下、心内、囊内、关节内或鞘内注射、硬膜外导管输注、蛛网膜下腔阻滞导管输注、静脉内输注、通过喷雾器、喷雾、阴道内途径、局部的眼滴剂和耳滴剂给予治疗有效量的hES细胞或其衍生物的方案和通过局部或损伤内途径给予hES细胞和其衍生物的方案。
[0040]优选使用不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、维生素补充剂、氨基酸补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的hES细胞或其衍生物，以避免任何污染风险和副作用的可能。可通过任何已知或批准的细胞培养方法获得hES细胞和其衍生物，它不含饲细胞以及任何来源的污染物，对人移植而言是安全的。hES衍生物包括来自人体进一步分化的细胞。
[0041]本发明还提供治疗终结性或目前无法治愈的疾病、失调或病症的药物组合物，其包含悬浮于药学上可接受的生物相容性溶液或任何其它载体中的治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述hES细胞或其衍生物不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基。
[0042]本发明也包括不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，包埋自生物相容性材料或基质中的hES细胞和/或其衍生物。所述生物相容性材料或基质可选自生物聚合物，包括多肽或蛋白质，多糖，包括纤连蛋白、各种类型的胶原、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶。
[0043]本发明组合物可以装在即用型药物形式中，其中所述干细胞具有足够活力，即它们的活力足够高，以便用于本发明一种或多种方法。在一个实施方式中，所述干细胞的活力大于约40%，如大于约50%、60%、70%或80%。该组合物还可包含抗微生物剂、抗菌剂、激素产品或其它药剂。
[0044]为了制备该组合物，将约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或一种或多种衍
生物如造血干细胞祖细胞、神经元干细胞祖细胞、间充质干细胞祖细胞、产胰岛素干细胞祖细胞、肝细胞干细胞祖细胞、心脏干细胞祖细胞、上皮干细胞祖细胞或其混合物悬浮于约0.25-100ml载体中。在一个实施方式中，将约750，000-80, 000, 000个hES细胞悬浮于约0.25-10ml载体中。群体中优先富集特定分化的干细胞祖细胞类型，但组合物中将保留一定比例未分化的干细胞。在一个实施方式中，全部细胞群体中未分化干细胞的比例不超过约80%。在另一实施方式中，全部细胞群体中未分化干细胞的比例不超过约40%。
[0045]可按照本发明治疗或改善的终结性疾病和其它失调或病症包括但不限于:癌症、肝病和肾病、神经系统疾病、皮肤病、自身免疫病、遗传疾病、眼病、肌骨骼病、生育和生殖疾病、以及心血管病、包括但不限于:急性髓性白血病、腺癌、关节炎、星形细胞瘤、听觉神经萎缩、孤独症、自身免疫病、阿耳茨海默病、强直性脊柱炎、贝克尔肌营养不良、脑损伤、烧伤、脑血管损伤、脑性麻痹、昏迷、角膜溃疡、角膜移植片排斥、神经系统的皮质-基底变性、冠心病、糖尿病、痴呆、唐氏综合征、杜兴肌营养不良、晚期肾病、欧勃麻痹、面肩肌营养不良(Fascio Scapular Muscular Dystrophy)、生育病、弗里德赖希共济失调、心力衰竭、肝细胞癌、遗传性脊髓运动神经元病、亨廷顿舞蹈症、克腊比病、肢带肌营养不良、肝硬化、黄斑变性、智力低下、多发性硬化、运动神经元病、心肌梗塞、肾病综合征、尼曼-皮克病、不愈合性皮肤溃疡、橄榄体脑桥小脑萎缩、视神经萎缩、帕金森病、电击后脑病、狂犬病疫苗后脑病、褥疮、进行性核上性麻痹、牛皮癣、眼球痨、限制型心肌病、视网膜色素变性、右束支传导阻滞、结节病、窦性心动过缓、脊髓性肌营养不良、脊髓小脑共济失调、史-约综合征、系统性红斑狼疮、血小板减少、珠蛋白生成障碍性贫血、溃疡性结肠炎、植物状态、囊性纤维化病、间质性肺病、无精子症、原发性卵巢功能衰竭、口疮性溃疡、激素失调、骨关节炎、霍纳综合征和成骨不全，以及通道病和低丙球蛋白血症。
[0046]更具体说，本发明提供了治疗对象的SCI的方法，所述方法包括:
[0047]a)通过皮下注射给予约750，000-80, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物；
[0048]b)在预定时间后重复步骤(a)，然后通过肌肉内注射给予hES细胞和/或其衍生物；
[0049]c)通过静脉内注射或输注给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干 细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞；
[0050]d)通过硬膜外注射给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞，在预定时间后根据临床和/或神经学检测评估的对象状况重复所述剂量；
[0051]e)通过尾侧注射给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物,其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；
[0052]f)通过鞘内注射或蛛网膜下腔阻滞导管给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；
[0053]g)通过硬膜外注射或硬膜外导管给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括神经元干细胞祖细胞；
[0054]h)通过深度脊髓注射在脊髓任一侧给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物；和
[0055]i)通过静脉内输注给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物；
[0056]其中步骤(a)和(b)首先进行，其余步骤以任意顺序进行。在一个实施方式中，步骤(f)后进行步骤(g)，重复至少一次，直到对象表现出由所述SCI恢复的临床迹象。
[0057]本发明也提供一种患有疾病、失调或病症的对象的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、硬膜外注射、硬膜外导管、眼球后注射、皮下注射、心内注射、囊内注射、鞘内注射或者局部施用或损伤内施用给予治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，它们是用不含动物产品、饲细胞、条件培养基、生长因子、白血病抑制因子、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子或可溶性青灰因子的培养基中培养的。在一个实施方式中，所述疾病、失调或病症是终末的或目前无法治愈的疾病、失调或病症。
[0058]本发明也提供一种治疗发育疾病、变性疾病、家族性疾病以及外伤性神经系统疾病和脑血管疾病的方法，所述方法包括给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞，通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、鞘内注射、硬膜外导管输注和蛛网膜下腔阻滞导管输注。
[0059]本发明也提供一种治疗皮肤病的方法，所述方法包括通过皮下或静脉内注射给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。
[0060]本发明也提供一种治疗褥疮的方法，所述方法包括通过局部或局部施用和肌肉内注射给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。
[0061]本发明也提供一种治疗自身免疫病的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射或关节内注射或者静脉内输注或其组合给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。
[0062]本发明也提供一种治疗遗传疾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、鞘内注射、硬膜外导管输注或蛛网膜下腔阻滞导管输注或其组合给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。
[0063]本发明也提供一种治疗坏疽的方法，所述方法包括通过静脉内注射、肌肉内注射或在活和死的组织连接处局部施用或其组合给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。
[0064]本发明也提供一种治疗与衰老相关的疾病的方法，所述方法包括以悬浮液或混合在生物相容性载体如凝胶、油膏剂、基质、糊剂或气溶胶喷雾中的形式通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或局部施用给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。
[0065]本发明也提供一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括通过静脉内或肌肉内注射或其组合给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括产胰岛素祖细胞。
[0066]本发明也提供一种治疗心血管疾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、心内注射、血管造影或手术中的直接注射给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。
[0067]本发明也提供一种治疗肝病和肾病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、静脉内输注或局部注射给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞、产清蛋白干细胞祖细胞和产胆红素干细胞祖细胞。
[0068]本发明也提供一种治疗生育病或生殖病的方法，所述方法包括通过局部肌肉内注射、睾丸内注射或附睾附近皮下注射给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞祖细胞。
[0069]本发明也提供一种治疗肌骨骼病的方法，所述方法包括通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射或静脉内导管输注给予约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞。
[0070]本发明也提供一种治疗眼病的方法，所述方法包括通过局部静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、眼球后注射、玻璃体内注射或局部施用给予约750，000-160，000，000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或组合的神经元干细胞祖细胞、造血干细胞祖细胞和间充质干细胞祖细胞。在一个实施方式中，通过眼球后注射给予包括神经元干细胞祖细胞在内的约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。在另一实施方式中，通过玻璃体内注射给予包括神经元干细胞祖细胞在内的约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。在另一实施方式中，将包括间充质干细胞祖细胞在内的约750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物施加于接触镜片，放在眼球上治疗角膜擦伤(如用hES细胞和/或其衍生物培育该接触镜片，以便用细胞包被该接触镜片，然后将该镜片放在眼球上约24小时)。
[0071]本发明也提供一种治疗肺病的方法，所述方法包括通过肌肉内注射、静脉内注射、喷雾或喷雾器给予750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括单独或与神经元干细胞祖细胞组合的造血干细胞祖细胞。在一个实施方式中，通过加入2ml生理盐水的喷雾器给予750，000-160，000，000个造血干细胞祖细胞。在另一实施方式中，通过喷雾(烟雾)给予750，000-160, 000, 000个造血干细胞祖细胞。
[0072]本发明也提供一种治疗激素疾病的方法，所述方法包括通过肌肉内和静脉内途径给予750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括造血干细胞和神经元干细胞。
[0073]本发明也提供一种治疗口疮性溃疡和其它溃疡的方法，所述方法包括通过肌肉内和静脉内途径给予750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物，其中所述细胞包括组合或单独的造血干细胞和神经元干细胞。
[0074]本发明也提供一种治疗膝关节和髋关节骨关节炎的方法，所述方法包括通过肌肉内、静脉内或关节内注射给予750，000-160, 000, 000个hES细胞和/或其衍生物。在一个实施方式中，通过关节内途径给予750，000-160, 000, 000个造血干细胞祖细胞。
[0075]本发明提供一种可用于培养hES细胞和其衍生物的细胞培养方法，所述hES细胞和其衍生物可用于移植给人，而不会引起任何副作用如形成畸胎瘤、形成肿瘤、抗原性问题或移植物抗宿主排斥。
[0076]该培养方法的设计特别用于产生移植入人体后可获得最佳治疗活性的足够活力和合适特性的hES细胞和其衍生物。
[0077]在优选实施方式中，用该细胞培养方法培养、扩增、分化和储存hES细胞。此外，本发明涉及立即注射型组合物，其含有在适合解冻后直接移植的储存条件下储存的hES细胞和/或其衍生物。
[0078]与将hES细胞维持于基本不分化状态的现有细胞培养方法相反，该培养基不含补充剂，如碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子、血清、清蛋白或清蛋白补充剂、氨基酸补充剂、维生素补充剂、转铁蛋白或转铁蛋白补充剂、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素替代物、胶原前体或胶原前体替代物、痕量元素、“条件培养基”残留物、动物产品、饲细胞、生长因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂和维生素补充剂。
[0079]与扩增hES细胞的其它细胞培养方法相反，实施本发明不导致形成胚状体，从而避免了需要进行手术切除。此时值得注意的是，本发明产品完全是人产品，不需要进行异种移植(如动物检测)。第一次体外受精(IVF)怀孕的情况是必然的结果(corollaryexample)。
[0080]不像其它细胞培养方法，本发明细胞培养技术能够在基本不分化的情况下几乎无限制地扩增hES细胞。本发明的主要优点是一个胚胎足以提供治疗有效量的hES细胞和/或其衍生物，以治疗多个患者。因此，不需要重复获取人胚胎，可避免与施用人胚胎有关的许多伦理问题。
[0081]本发明方法的另一个优点是从免疫学角度看，hES细胞和其衍生物是普遍接受的产品，因此不需要患者和细胞的交叉匹配,不需要免疫抑制。
[0082]本发明一方面涉及分离hES细胞的方法，所述方法包括:
[0083](a)将2-7日龄胚胎收集到最低必需培养基中，
[0084](b)通过机械手段由胚胎获得hES细胞。
[0085]本发明一方面涉及扩增不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的人胚胎干细胞的方法，所述方法包括以下步骤:
[0086](a)将人胚胎干细胞引入由最低必需培养基、孕激素和β_人绒毛膜促性腺素(β hCG)激动剂组成的细胞培养基中；和
[0087](b)在约34°C -38°C的温度下、约3.5%_6% 二氧化碳的环境中培育所述干细胞约12-48小时。
[0088]本发明另一方面涉及一种培养hES细胞的方法，该方法使细胞处于部分分化状态之前的状态，且不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基，该方法包括以下步骤: [0089](a)将hES细胞引入由最低必需培养基组成的细胞培养基中；和
[0090](b)在约34°C -38°C的温度下、约3.5%_6% 二氧化碳的环境中培育所述干细胞约12-48小时。[0091]本发明另一方面涉及一种制备用于人类移植的即用型人胚胎干细胞制剂的方法:
[0092](a)获得不含动物产品、饲细胞、生长因子、白血病抑制因子、补充性矿物质组合、氨基酸补充剂、维生素补充剂、成纤维细胞生长因子、膜结合青灰因子、可溶性青灰因子和条件培养基的人胚胎干细胞，
[0093](b)离心所述干细胞获得沉淀，和
[0094](C)将所述沉淀悬浮于生物相容性溶液。
[0095]本发明另一方面涉及以活条件储存人胚胎干细胞的方法，所述方法包括:
[0096](a)取本发明方法制备的干细胞，
[0097](b)加入冻存剂，和
[0098](c)于-4至-80 V冷冻所述细胞。[0099]按照本发明实践在不存在这类补充剂的条件下培养hES细胞的目的是降低将细菌、真菌、病毒或其它污染物引入培养物的风险。这降低了感染和细胞特征变化的风险。
[0100]本发明另一目的是提供一种以不含任何污染性残留物且人用安全的形式产生和扩增hES细胞和其衍生物的简单、经济、可扩大规模的方法。
[0101]因此，本发明目的是提供一种给予所有共同污染物的风险降低且补充因子的残留污染被消除的药品。
[0102]本发明另一目的是提供一种降低染色体畸变或遗传不稳定性的风险的细胞培养方法。
[0103]本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中畸胎瘤形成风险降低的细胞培养方法。
[0104]本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中肿瘤形成风险降低的细胞培养方法。
[0105]本发明另一目的是提供一种使移植所述培养物的患者中抗原性问题或移植物抗宿主排斥问题的风险降低的细胞培养方法。
[0106]本发明特别提供了含有hES细胞和其衍生物和生物相容性培养基的组合物，其形式与安全性和质量的国际规章标准相容，因此可立即注射给人患者进行治疗。
[0107]本发明也提供一种包含悬浮于生物相容性溶液的hES细胞和/或其衍生物悬浮液的制品，该制品包含在容器中以便储存、运输或直接移植给人。
[0108]本发明也提供一种扩增hES细胞和其衍生物的方法。
[0109]本发明也提供一种扩增hES细胞和其衍生物以及抑制其分化的方法。
[0110]本发明也提供一种培养hES细胞和其衍生物的方法，所述方法使hES细胞和其衍生物在移植入患有疾病、病症或失调的人后能对其进行有效治疗。
[0111]发明详述
[0112]定义
[0113]本文在以下说明书和实施例中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书，包括所述术语的给定范围的明确和一致的理解，提供以下定义。
[0114]可注意到，以保持其本领域普通技术人员公知含义的方式使用总体描述本发明的术语。[0115]“胚胎干细胞”指人的多潜能细胞(即hES细胞)。在一个实施方式中，由前胚泡期胚胎分离hES细胞。在另一实施方式中，通过使至少部分分化的细胞(如多能细胞)去分化，制备hES细胞，它们实际上是全能细胞。制备hES细胞的方法是熟知的，参见例如，美国专利 5，843，780,6, 200，806,7, 029，913,5, 453，357,5, 690，926,6, 642，048,6, 800，480、5，166，065,6, 090，622,6, 562，619,6, 921，632 和 5，914，268，美国公开申请 2005/0176707和国际申请W02001085917。
[0116]“胎儿干细胞”指由胚儿组织，即将胚胎植入子宫后发育的人组织的产生的干细胞。
[0117]“多能”指只能产生密切相关细胞家族的细胞的干细胞。
[0118]“多潜能”指作为全能细胞后代的干细胞，可以生长成除全能干细胞以外的任何细胞类型。
[0119]“全能”指卵细胞和精子融合产生的干细胞。受精卵细胞前几次分裂产生的细胞也是全能的。这些细胞也可生长成任何类型的细胞。
[0120]本说明书中用“治疗有效量”描述在实施本发明一个或多个方面中能有效产生所需结果的组分如胚胎干细胞、神经祖细胞、神经元细胞、造血干细胞祖细胞、心脏干细胞祖细胞、或干细胞的任何其它衍生物、或其它物质或其混合物的浓度或用量。
[0121]本说明书中通篇使用“移植”来描述将本发明胚胎干细胞和/或其衍生物递送至人体部位的过程，所述部位是需要产生有益效果来治疗或改善本文所述疾病、失调或病症的细胞所处位点，这些有益效果包括但不限于，修复对象中枢神经系统的损伤、治疗神经变性疾病或治疗中风、心血管病、心脏病发作或物理损伤或外伤或者遗传损伤或环境刺激引起的(例如由事故或其它活动引起的)脑和/或脊髓或其它器官的神经损伤、肝损伤、自身免疫病、性或生殖功能障碍、眼睛的不同部分变性、肾损伤等。
[0122]本说明书中用“生物相容性溶液”指其中悬浮有hES细胞和/或其衍生物，用于移植或任何其它后续使用方案的溶液。这类生物相容性溶液包括盐水，还可包含其它成分如防腐剂、抗微生物剂等以及其它药学试剂。
[0123]本说明书中用“生物相容性载体”指其中悬浮有hES细胞和/或其衍生物用于局部治疗、移植或任何其它后续使用的固体载体、溶液和混合物。这类生物相容性载体包括凝胶剂、油膏剂、糊剂和气溶胶喷雾剂。
[0124]本说明书中，“生物相容性容器”指其中装有hES细胞和/或其衍生物并且不会妨碍细胞用于移植，即不会用不能给予对象的化合物污染细胞的容器(如细胞培养或储存容器)。生物相容性容器材料的例子包括但不限于:玻璃、不锈钢和聚苯乙烯。
[0125]“孕激素”是任何具有孕酮样活性，即在一种已知的生物学活性测定中具有至少25%的孕酮活性的天然或合成激素。例子包括但不限于:孕酮、地屈孕酮、甲羟孕酮、炔诺酮、左炔诺孕酮、炔诺孕酮、孕二烯酮和屈螺酮。其它孕激素的例子参见美国专利 7，091，234,7, 084，151,7, 081，457,7, 071，205,6, 562，857,6, 319，911,6, 245，757、6，043，235 和 6，028，064。
[0126]〃β_人绒毛膜促性腺激素(PhCG)激动剂〃被定义为在一种已知的生物学活性测定中具有至少25%天然PhCG活性的任何天然产生的或合成的PhCG或者其片段或衍生物。β hCG激动剂的 例子包括但不限于:β hCG和美国专利6，635，445、6，585，982、6，583，109,6, 469，139 和 5，997，871 所述的化合物。
[0127]在本说明书中，用“最低必需培养基”指含有氨基酸、盐、葡萄糖和维生素的细胞培养基。例子包括RPM1、DMEM、EMEM和GMHM。
[0128]“喷雾”指通过喷雾器将药物或物质递送至肺中。
[0129]关节内指给药至关节内空间。
[0130]眼球后指给药至眼球后空间。
[0131]静脉内输注指将含有产品或药品的iv液体给入静脉。
[0132]“硬膜外”注射或导管输注指给药至脑膜的硬脑脊膜外部区域。
[0133]“鞘内”注射或导管输注指给药至脑膜的最内层，即蛛网膜内与脑连通的脑脊液中。
[0134]“尾侧”注射指通过骶骨膜，即尾骨顶端上方约三厘米处给药，它与硬膜外空间相连通。
[0135]“深度脊髓注射”指注射到脊椎任一侧的竖脊肌内。
[0136]“肌肉内”注射指给药至肌肉片层之间。
[0137]“静脉内”注射指给药至静脉内。
[0138]“急性SCI”指SCI之日后至多三个月。
[0139]“亚急性SCI”指SCI之日后三个月至损伤日后至多九个月。
[0140]“慢性SCI”指SCI之日后九个月以上。
[0141]hES细胞的“衍生物”包括多能干细胞、多潜能干细胞、成人干细胞和组织特异性干细胞，不包括完全分化的细胞。组织特异性干细胞的例子可参见下表。