专利名称：培养肝脏干细胞的方法以往，肝癌及晚期肝硬化的终末期治疗为肝移植，但供体来源紧缺且移植后不良反应较多。干细胞移植技术应用于临床后，给广大患者带来了生存的希望。最初，临床应用的是自体骨髓干细胞，但骨髓质量受患者年龄，身体状态等条件影响，往往使得干细胞数量及活性减弱。目前，利用早期(流产)胎儿的组织干细胞治疗相关疾病已进入临床。2003年科学技术部、卫生部印发的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》指出，在知情同意的原则下，允许使用自然或自愿选择流产的胎儿细胞。这为利用流产胎儿的组织细胞进行干细胞培养和研究的合法性提供了依据。现有技术中，已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞，用于治疗肝硬化及糖尿病的先例，并取得了良好疗效。现有的肝脏干细胞的培养方法，包括双酶消化法，灌注法，差速离心法，筛网过滤寸。双酶消化法及灌注法，是使用两种酶分阶段消化肝组织、或向肝组织中灌注，使干细胞从组织中分离出来。此种方法处理肝组织的时间长、处理步骤多，易造成污染和对细胞损伤。差速离心法，是不用消化酶而是组织剪碎后通过不同速度剔除组织碎片留下细胞，但这种方法混有的红细胞较多，培养使影响肝脏干细胞的贴壁和生长。
本发明的主要目的在于，针对现有技术中培养肝脏干细胞的方法存在处理组织时间长、细胞损伤大及混杂细胞多等不足，提供一种提取时间短、培养质量高的肝脏干细胞的培养方法，以增强肝脏干细胞治疗疾病的疗效。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种培养肝脏干细胞的方法，其步骤如下a.在无菌条件下，取经提供者自愿捐献并知情同意、且肝炎病毒标志物、梅毒、HIV 检测均为阴性的流产胎儿的肝脏组织，用含有双抗的PBS(WK)Sphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)冲洗3遍；b.将肝脏组织剪碎，用0. 25% g/mL的胰蛋白酶溶液(可以是水溶液或PBS溶液)， 消化30分钟；c.用完全培养基中和消化液；d.将经过步骤b消化和步骤c中和后的肝脏组织在消化液和中和液的混合液体中吹打混勻，以500转/分钟离心5分钟，取上层清液，之后再以1500转/分钟离心5分钟；e.弃去上层清液，将沉淀用完全培养基悬起，接种于培养瓶中，在37°C下、5% CO2的环境中培养；f.培养4天后，洗去未贴壁的细胞，用完全培养基进行换液；g.每隔4天用完全培养基换一次液，待细胞生长扩增达到占培养瓶底面积80 %以上，1 2传代，即由一瓶分装至两瓶，当每瓶细胞又扩增达到占培养瓶底面积80%以上时， 再分别传代，以此类推。其中，所述双抗为在PBS中的终浓度为1 % g/mL的青霉素和1 % g/mL的链霉素。其中，所述完全培养基为含IOwt%胎牛血清的α -MEM培养基。其中，在步骤g的传代操作之前，将细胞用胰蛋白酶-EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)混合液消化。所述的胰蛋白酶-EDTA的混合液是由0. 25 % g/mL的胰蛋白酶和0. 02wt % EDTA 以1 1的体积比混合得到的。本发明的有益效果是本发明有益效果在于，应用本发明的技术方案对胚胎肝脏干细胞进行分离培养， 细胞活力好，原代组织处理时间及步骤缩短，减少污染机会及对组织细胞的损伤。接种后细胞增殖较快，传代细胞生长较好。经过形态学观察及流式细胞术等检测均符合干细胞特性。 本发明方法适用于大量培养用于肝脏疾病的干细胞治疗。显示出本发明的分离培养方法相对于现有技术具有显著的进步。图1为采用本发明方法进行培养的细胞原代培养至第3天的形态学观察照片。图2为采用本发明方法进行培养的细胞原代培养至第11天的形态学观察照片。图3为采用本发明方法进行培养的细胞传代培养至第5代的形态学观察照片。图4为采用本发明方法培养的肝脏干细胞的生长曲线。图5为采用本发明方法培养的肝脏干细胞表面抗原标志的流式细胞术检测结果。图6为采用本发明方法培养的肝脏干细胞体外成骨诱导的碱性磷酸酶染色检测结果。本发明提供一种培养肝脏干细胞的方法，可用从人及其他哺乳动物肝脏提取肝脏干细胞。在本发明中，是采用胰酶消化肝组织结合差速离心法提取肝脏干细胞再进行培养扩增。其具体过程如下无菌取胎儿肝脏组织，用含双抗的PBS (所述双抗为在PBS中的终浓度为g/mL 的青霉素和g/mL的链霉素)冲洗数次，剪碎后用0. 25% g/mL胰酶消化30分钟，用完全培养基(所述完全培养基为含10wt%胎牛血清的α-MEM培养基)中和。将经过消化和中和后的肝脏组织在消化液和中和液的混合液体中吹打混勻，后在离心机内以每分钟500 转的速度离心5min，令组织沉于管底。将上清液转入另一无菌管内，在离心机内以每分钟 1500转的速度离心5min，使细胞沉于管底，弃去上清。向沉淀中加入PBS，吹打混勻洗涤一遍，再以每分钟1500转离心5分钟。将细胞沉淀用ImL完全培养基悬起混勻，计算细胞浓度。将细胞悬液加入到25cm2培养瓶中，再补充5mL完全培养基，置于37°C下、5% CO2浓度的培养箱中培养。4天后，用PBS洗去未贴壁细胞，加入完全培养基，进行首次换液。在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。每隔4天换一次液，待细胞生长至10天左右、达到 80%以上融合后，亦即细胞生长扩增达到占培养瓶底面积80%以上，加入胰蛋白酶-EDTA 混合液进行消化，所述胰蛋白酶-EDTA的混合液是由0. 25% g/mL的胰蛋白酶和0. 02wt% EDTAWl 1的体积比混合得到，消化后进行1 2传代培养，记为Pl代，待细胞生长再次达80%以上融合后，用相同的操作进行胰酶消化传代，记为P2。以此类推，各代细胞依次记为Pl PlO代细胞。2、细胞的验证(1)生长曲线的测定取生长良好的P3、P7、P10代细胞，用含Immol (浓度为0. 02wt % ) EDTA的0. 25wt % 胰酶消化后，以2X 104/mL的密度接种于标准M微孔板，每孔ImL消化液。每天各取3孔消化计数细胞，取平均值，连续培养7d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。(2)细胞表面抗原标志的测定取生长良好的P5代细胞，用含lmmol EDTA的0. 25wt%胰酶消化。用PBS洗涤2 次，制备成终浓度为lX106/mL的细胞悬液，分装入试管中，每管0. lmL。分别加入FITC标记(Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)的小鼠抗人 CD34、CD44、CD 105、CD 13、HLA-ABC、HLA-DR单抗，同时以加入α -MEM培养液作为阴性对照。黑暗中孵化15min后， 用流式细胞仪检测。(3)向成骨细胞的诱导及鉴定取生长良好的P4代细胞，用含lmmol EDTA的0. 25wt%胰酶消化后，以4X 104/mL 的密度接种于预置多聚赖氨酸预处理盖玻片的6微孔板内。M小时加入含有lX10_8mol/ L地塞米松、1 X 10_2mol/L β -甘油磷酸钠和1. 5 X 10_4mol/L维生素C的α -MEM培养液诱导培养，同时以仅加入α-MEM培养液作为阴性对照，每3天换液1次。诱导2周左右取出细胞爬片，进行碱性磷酸酶染色。3、验证结果(1)细胞的形态学观察结果图1为原代培养第3天的细胞形态学观察照片，采用倒置相差显微镜，放大100倍。如图1所示，原代细胞接种3天后可见少量贴壁细胞，细胞大小形态不均，呈圆形、纤维样或内皮细胞样，均为单个细胞。6天后，细胞开始快速增长，形成多处快速生长的细胞集落，集落内细胞多为较宽的梭形细胞，呈漩涡状或放射状平行排列，且随着培养时间的延长，细胞集落伸展增大。原代培养至11天左右时细胞达80% 90%融合，此时细胞排列紧密，多呈纤维样，而内皮样细胞少见，圆形细胞消失。如图2的原代培养第11天的细胞形态学观察照片所示，其是采用倒置相差显微镜，放大100倍。细胞传代培养2 3代后，维持纤维样形态，较紧密。如图3的传代培养至第5代的细胞形态学观察照片所示，其是采用倒置相差显微镜，放大100倍。(2)细胞的生长曲线分析传代细胞的生长较原代细胞要快，一般4 5天左右即能达到90%以上融合。观察如图4所示的P3、P7、PlO代细胞的生长曲线，发现具有以下共同特征传代培养的潜伏期约为M 48h，对数增殖期约为3 4天，对数增殖期后为平台期，大约第5 6天开始进入平台期。(3)表面抗原标志的鉴定结果。如图5的对肝脏干细胞表面抗原标志的流式细胞术检测结果所示，流式细胞仪的检测结果为，肝脏干细胞表面抗原标志⑶34(上左)、HLA-DR(上中)均呈阴性表达， CD44(上右)、⑶105(下左)、CD 13 (下中)均呈阳性表达，HLA-ABC (下右)呈弱阳性表达，表明采用本发明方法培养出的细胞具有干细胞的表面分子特点。(4)成骨诱导鉴定结果图6为肝脏干细胞体外成骨诱导的碱性磷酸酶染色检测结果。采用倒置相差显微镜放大400倍。如图6所示，成骨诱导培养2周后，进行碱性磷酸酶染色，可见细胞核染成均一的淡蓝色，阴性对照则未见细胞染色，证实人胎儿肝脏来源的干细胞有成骨分化潜能。


本发明涉及一种培养肝脏干细胞的方法，其步骤如下a.在无菌条件下，取肝脏组织，用含有双抗的PBS冲洗3遍；b.将肝脏组织剪碎，用0.25％g/mL的胰蛋白酶溶液，消化30分钟；c.用完全培养基中和消化液；d.将经过消化和中和后的肝脏组织在消化液和中和液的混合液体中吹打混匀，以500转/分钟离心5分钟，取上层清液，之后再以1500转/分钟离心5分钟；e.弃去上层清液，将沉淀用完全培养基悬起，接种于培养瓶中，在37℃下、5％CO2的环境中培养；f.培养4天后，洗去未贴壁的细胞，用完全培养基进行换液；g.每隔4天用完全培养基换一次液，待细胞生长扩增达到占培养瓶底面积80％以上，1∶2传代。