专利名称：用于创伤治疗的组合物和方法成纤维细胞是普遍存在的细胞，并且构成几乎所有组织的基质。由于它们从头发到脚趾的广泛分布，不同组织中的成纤维细胞表达异质基因型(I)。除了胶原生成细胞，据报道成纤维细胞与免疫细胞、炎性细胞相互作用。癌症相关的成纤维细胞在癌症基质中具有推定的作用(2-4)。癌症相关的成纤维细胞可以固定侵袭性肿瘤细胞并积累(elaborate)血管发生，这两种情况都是转移的先决条件(3，4)。器官纤维化的典型特征在于上皮细胞或内皮细胞转化为成纤维细胞，所述成纤维细胞进ー步获得肌成纤维细胞表型(5-7)。肉芽组织(granular tissue)的成纤维细胞收缩是正常创伤愈合的过程(6,8)。在病理创伤愈合中，通过获得α-平滑肌肌动蛋白(aSMA)表型和过度收缩性激活成纤维细胞是造成纤维化或异常瘢痕(9-11)的因素，包括目前没有令人满意的治疗的瘢痕瘤和肥大性瘢痕(10，12)。除了基质细胞，成纤维细胞还在几种特化的结缔组织如韧带、腱和牙周韧带中作为实质(parenthymal)细胞。与其中成纤维细胞是基质细胞的器官纤维化中过量的胶原生物合成相反，实质成纤维细胞组织如腱和韧带非常难以再生(13-15)。实质成纤维细胞组织固有的较差愈合能力是由于稀缺作为胶原生成细胞的成纤维细胞(13-15)。最近将皮肤成纤维细胞转化为诱导的多能干细胞(iPS) (16，17)。但是重编程的收率一般很低，这导致推测成纤维细胞群体中的出生后干细胞/祖细胞而不是最终阶段成纤维细胞容易地重编程。尽管它们在细胞生物学中的广泛应用以及在疾病如癌症和纤维化中的广泛影响，但是就它们的起源和分化途径而言，成纤维细胞是没有很好研究的细胞。已提出成纤维细胞可能在称为内皮-或上皮-间充质转换(EMT)的过程中衍生自上皮细胞或内皮细胞(18-22)。转基因模型中的细胞追踪显示内皮细胞或上皮细胞转化为成纤维细胞样细胞(23)。但是EMT并未造成存在于器官纤维化中的所有成纤维细胞(24)。而且，EMT未解释实质成纤维细胞的起源，因为腱或韧带中缺乏上皮细胞或内皮细胞。最近，在腱中发现多能间充质细胞(25)，这支持成纤维细胞的间充质起源的假设(26-28)。推定的成纤维细胞的间充质起源可以是骨髄源性或结缔组织源性。在骨髄中，认为CD34+和CD45+纤维细胞是具有造血干细胞、单核细胞和成纤维细胞的特征的干细胞/祖细胞亚群，并且可以在受伤时迁移至外周出，29)。然而，⑶34+和⑶45+纤维细胞仅占总骨髓细胞的〈1%(6)，并且可能不參与整个身体的结缔组织的稳态。因此，在诸如外伤、癌症和感染的损伤时负责结缔组织的稳态和修复的成纤维细胞的起源和分化途径仍令人费解。到目前为止，尚没有可靠和方便的方法使干细胞或祖细胞分化为成纤维细胞。而且，到目前为止也未报道成纤维细胞在器官纤维化中可以衍生自上皮细胞或内皮细胞。发明概沭本发明的各方面提供用于创伤治疗的组合物和方法。本发明的一方面提供ー种药物组合物，其包含CCN2/CTGF以及药学可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含CCN2/CTGF。在一些实施方案中，所述药物组合物包含CCN2/CTGF和TGFii的抑制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含CCN2/CTGF和P38抑制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含CCN2/CTGF和酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含CCN2/CTGF，并且包含TGFβ的抑制剂、Ρ38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂中的两种或更多种。在一些实施方案中，所述药物组合物包含间充质祖细胞。在各种实施方案中，所述间充质祖细胞为α SM-间充质祖细胞。在各种实施方案中，所述间充质祖细胞为CD34-间充质祖细胞。在一些实施方案中，所述CCN2/CTGF包含CCN2/CTGF多肽或者编码CCN2/CTGF多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述组合物包含可操作地连接至载体的编码CCN2/CTGF多肽的多核苷酸。在ー些配置中，所述载体合适在创伤组织环境中表达所述CCN2/CTGF多肽。在一些实施方案中，所述CCN2/CTGF包含人CCN2/CTGF或重组人CCN2/CTGF。在一些实施方案中，所述CCN2/CTGF包含对应于登录号ΝΡ_001892的CCN2/CTGF。在一些实施方案中，所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO: I的序列，或者与SEQ ID NO: I具有至少约80%相同性并且具有CCN2/CTGF活性。在一些实施方案中，所述CCN2/CTGF包含多肽，所述多肽与 SEQ ID NO: I 具有至少约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同性并且具有 CCN2/CTGF 活性。在一些实施方案中，所述组合物包含TGFP的抑制剂。在一些实施方案中，所述TGF^的抑制剂减少从成纤维细胞形成肌成纤维细胞或者抑制纤维化。在一些实施方案中，所述TGFii的抑制剂大幅減少从成纤维细胞形成肌成纤维细胞或者抑制纤维化。在一些实施方案中，所述组合物包含TGFP I的抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含TGFii 2的抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含TGFii 3的抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的TGFii的抑制剂ANG-1122 ；AP-11014 ;美替木单抗；夫苏木单抗(fresolimumab);甘露糖-6-憐酸，BTG ;Pharmapro jects No. 6614 ；NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗体，Lilly ;LY_2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗剂，FibroGen ；1D11 ；抗 TGF β MAb-1, Genzyme ；SB-431542 ;激活素样激酶 5 抑制剂，Graceway ;抗 TGF-β 抗体，Genent ;反义寡核苷酸，Il ；TGF-^ 拮抗剂，Inflazyme ；TGF-^ 受体，Insmed ；TGF-^ 拮抗剂，Inspiraplex ;饰胶蛋白，Telios ;SX-007 JGF-β 受体抑制剂(inhibs)，J&J ;TGF_β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 ；TGF- β 抗体,Manchester ；TGF- β 拮抗剂，Sydney ;甘露糖-6-憐酸，Renovo ;癌症基因治疗，Resver JGF-β Shield ;IN_1130 ;LF_984 JGF-β 抑制剂，Mill ;以及 SB-431542。在一些实施方案中，所述组合物包含P38抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的 P38 抑制剂Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。在一些实施方案中，所述组合物包含酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的酪氨酸激酶抑制剂K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布 (Cediranib)、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼、托西尼布(Toceranib)、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、0SI-774.GW 2016、EKB-569、MC-C225、MDX-447、PKI 116、ABX_EGF、AG-82、AG_18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494, AG-825, AG-879, AG-1112, AG-1296, AG-1478, AG-126, RG-13022、RG-14620 以及 AG-555。在一些实施方案中，所述组合物包含抗生素或免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的抗生素阿莫西林、β -内酰胺酶、氨基糖苷、β -内酰胺(糖肽)、克林霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮、大环内酷、甲硝唑、青霉素、喹诺酮、雷帕霉素、利福平、链霉素、磺胺、四环素、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑以及万古霉素。在一些实施方案中，所述组合物包含选自以下的免疫抑制剂类固醇、环胞素、环胞素类似物、环磷酰胺、甲基泼尼松(methylprednisone)、泼尼松、硫唑嘌呤、FK_506、15_脱氧精胍菌素、泼尼松龙、甲氨蝶呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、来氟米特、咪唑立宾、布喹那、脱氧精胍菌素、氮杂螺烷、莫罗单抗-⑶3、山地明、Neoral、Sangdya、普乐可复、骁悉、硫唑嘌呤、糖皮质类固醇、肾上腺皮质类固醇、Deltasone、Hydeltrasol> Folex、甲氨蝶呤、甲氧沙林以及西罗莫司。在一些实施方案中，所述组合物配制为用于肠胃外、肺部、ロ服、局部、皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼部、ロ腔或直肠给药。在一些实施方案中，所述组合物配制为用于局部给药。在一些实施方案中，所述组合物配制为用于直接局部给予软组织创伤部位。本发明的一方面提供一种用于创伤治疗的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含上文所述的ー种或多种组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含上文所述的ー种或多种药物组合物。本发明的一方面提供上文所述的组合物用于治疗组织创伤的用途。在一些实施方案中，上文所述的药物组合物用于治疗组织创伤。本发明的一方面提供上文所述的组合物在制备用于治疗组织创伤的药物中的用途。在一些实施方案中，上文所述的药物组合物用于制备用于治疗组织创伤的药物。在一些实施方案中，所述组织创伤包括软组织创伤。在一些实施方案中，所述组织创伤包括慢性组织创伤或急性组织创伤中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述组织创伤包括皮肤创伤、韧带创伤、腱创伤，或者上述创伤的组合中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述组织创伤包括开放性组织创伤。在一些实施方案中，所述组织创伤包括切割创伤、撕裂创伤、擦伤创伤、穿刺创伤、穿透创伤或枪弹创伤中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述组织创伤包括分裂裂伤(split laceration)、过度拉伸、磨压、割裂或撕裂中的一种或多种。本发明的一方面提供一种用于愈合组织部位的创伤的系统。在一些实施方案中，所述系统包含医疗器械和上文所述的组合物。在一些实施方案中，所述系统包含医疗器械和上文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物适合在与组织部位接触时从所述医疗器械释放。在ー些实施方案中，所述医疗器械包括帷帘、绷带、敷料、胶带、粘结层、夹板、止血粉、免缝胶带、氰基丙烯酸酯胶、钉(staple)和缝线，或者上述器械的组合中的一种或多种。本发明的一方面提供一种治疗个体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含CCN2/CTGF的组合物给予有需要的个体的组织创伤部位。在一些实施方案中，所述方 法包括将包含a SMA-成纤维细胞(衍生自CCN2/CTGF处理的间充质祖细胞)的组合物给 予有需要的个体的组织创伤部位。在一些实施方案中，所述方法包括使包含CCN2/CTGF的组合物与间充质祖细胞接触以刺激成纤维细胞分化。在一些实施方案中，所述方法包括给予包含间充质祖细胞的组合物。在一些实施方案中，所述间充质祖细胞为a SMA-间充质祖细胞。在一些实施方案中，所述间充质祖细胞为CD34-间充质祖细胞。在一些实施方案中，所述间充质祖细胞是自体的、同种异体的、同基因的或异种的，或者它们的组合。在一些实施方案中，将分化的成纤维细胞包含在组合物中或给予个体。在ー些实施方案中，分化的成纤维细胞为α SM-成纤维细胞。在一些实施方案中，所述分化的成纤维细胞为FSP1+、波形蛋白+、Colll+和a SMA-0在一些实施方案中，所述分化的成纤维细胞存在于包含至少约80%、85%、90%、95%或99%分化的成纤维细胞的富集细胞培养物中。在一些实施方案中，所述治疗个体的方法包括给予(i)TGFi3的抑制剂、(ii)P38抑制剂、或者(iii)酪氨酸激酶抑制剂中的至少ー种或多种。在一些实施方案中，所述治疗个体的方法包括给予TGFP的抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗个体的方法包括给予P38抑制剂。在一些实施方案中，所述治疗个体的方法包括给予酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述方法包括给予组合物，所述组合物包含CCN2/CTGF，并且包含所述TGF0的抑制剂、所述P38抑制剂或所述酪氨酸激酶抑制剂中的至少ー种。在一些实施方案中，第一组合物包含CCN2/CTGF，并且第二組合物包含所述TGFii的抑制剂、所述P38抑制剂或所述酪氨酸激酶抑制剂中的至少ー种。在一些实施方案中，所述第一组合物和所述第二組合物连续给药。在一些实施方案中，所述第一组合物和所述第二組合物同时给药。在一些实施方案中，所述TGF β的抑制剂、所述Ρ38抑制剂或所述酪氨酸激酶抑制剂中的至少ー种抑制纤维化。在一些实施方案中，所述TGFii的抑制剂抑制纤维化。在一些实施方案中，所述Ρ38抑制剂抑制纤维化。在一些实施方案中，所述酪氨酸激酶抑制剂抑制纤维化。在一些实施方案中，所述方法包括给予包含TGFβ的抑制剂的组合物。在ー些实施方案中，所述TGFii的抑制剂减少从成纤维细胞形成肌成纤维细胞或者抑制纤维化。在一些实施方案中，所述TGFii的抑制剂以大幅減少从成纤维细胞形成肌成纤维细胞有效的量存在。在一些实施方案中，所述抑制剂为TGFii I的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂为TGFii 2的抑制剂。在一些实施方案中，所述抑制剂为TGFii 3的抑制剂。在一些实施方案中，所述TGFii的抑制剂选自ANG-1122 ;AP_11014 ;美替木单抗；夫苏木单抗；甘露糖-6_ 磷酸，BTG ；Pharmaprojects No. 6614 ； NAFBOOI ；NAFB002 JGF-β I 抗体，Lilly ；LY-2157299 ;胎球蛋白 JGF-β 拮抗剂，FibroGen ；1D11 ;抗丁6卩旦嫩13-1，Genzyme ；SB-431542 ;激活素样激酶5抑制剂，Graceway ;抗TGF-β抗体，Genent ;反义寡核苷酸，Il!TGF-β 拮抗剂，Inflazyme ；TGF-β 受体，Insmed ；TGF-β 拮抗剂，Inspiraplex ;饰胶蛋白，Telios ；SX-007 ；TGF- β 受体抑制剂，J&J ；TGF- β 疫苗，Neovacs ；ADMP-1 JGF-β 抗体,Manchester ；TGF- β拮抗剂，Sydney ;甘露糖-6_磷酸,Renovo ;癌症基因治疗,Resver ；TGF-β Shield ;IN-1130 ;LF_984 ;TGF_ β 抑制剂，Mill ;以及 SB-431542。在一些实施方案中，所述方法包括给予包含P38抑制剂的组合物。在一些实施方案中，所述 P38 抑制剂是 Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF860 02、PD169316、SB202190、SC68376、VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653, MW012069ASRM, SD169, RWJ67657 以及 ARRY797 中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述方法包括给予包含酪氨酸激酶抑制剂的组合物。在ー些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是K252a、阿昔替尼、波舒替尼、西地尼布、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼、托西尼布、凡德他尼、伐他拉尼、ZD 1839、CI-1033、OSI-774、Gff 2016、EKB-569、頂C-C225、MDX-447、PKI116、ABX-EGF、AG-82、AG-18、AG-490、AG-17、AG-213、AG-494、AG-825、AG-879、AG-1112、AG-1296、AG-1478、AG-126、RG-13022、RG-14620 以及 AG-555 中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述方法治疗包括软组织创伤在内的组织创伤部位。在ー些实施方案中，所述组织创伤部位包括慢性软组织创伤或急性软组织创伤。在一些实施方案中，所述组织创伤部位包括皮肤创伤、韧带创伤、腱创伤，或者上述创伤的组合中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述组织创伤部位包括开放性组织创伤。在一些实施方案中，所述组织创伤部位包括切割创伤、撕裂创伤、擦伤创伤、穿刺创伤、穿透创伤或枪弹创伤中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述组织创伤部位包括分裂裂伤、过度拉伸、磨压、割裂或撕裂中的ー种或多种。在一些实施方案中，所述方法包括肠胃外、肺部、ロ服、局部、皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼部、口腔或直肠给药。在一些实施方案中，给药包括局部给药。在一些实施方案中，给药包括直接局部给予组织创伤部位。在一些实施方案中，给予所述组合物导致成纤维细胞分化的增加。在一些实施方案中，给予所述组合物导致纤维发生的増加。在一些实施方案中，给予所述组合物导致肌成纤维细胞分化的抑制。在一些实施方案中，给予所述组合物导致纤维化的抑制。在ー些实施方案中，给予所述组合物导致成纤维细胞分化的増加、纤维发生的増加、肌成纤维细胞分化的抑制或者纤维化的抑制中的至少ー种。在一些实施方案中，给予所述组合物导致成纤维细胞分化的増加、纤维发生的増加、肌成纤维细胞分化的抑制以及纤维化的抑制。在一些实施方案中，所述方法包括给予上文所述的任何组合物。在一些实施方案中，给予所述组合物包括将上文所述的任何系统给予组织创伤部位。在一些实施方案中，所述组合物通过载体递送系统给药。在一些实施方案中，所述组合物通过载体递送系统给药。在一些实施方案中，所述组合物通过包含聚合微球的载体递送系统给药，并且所述组合物包裹在所述聚合微球中。在一些实施方案中，所述组合物以约IOOmg-约500mg聚合物比约I-约100 μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些实施方案中，所述组合物以约250mg聚合物比约10μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些实施方案中，给予所述组合物包括将约I-约50mg包裹CTGF的微球弓I入组织创伤。本发明的一方面提供ー种形成a SMA-成纤维细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使a SMA-、⑶34-间充质祖细胞与CCN2/CTGF接触，其中CCN2/CTGF刺激的间充质干细胞分化为a SMA_、FSP1+、波形蛋白+、Colll+成纤维细胞。本发明的其他目的和特征会部分地显而易见，并且部分地在下文中指出。 本领域技术人员会理解下文所描述的图仅为了说明目的。这些图不是为了以任何方式限制本发明的教导的范围。图I是示出CCN2/CTGF介导的间充质细胞的成纤维细胞分化的一系列图像和条形图。图IA是分离和培养扩增的骨髓间充质干细胞(MSC)的图像。比例尺ΙΟΟμπι。图IB是三色染色的分离和培养扩增的用CCN2/CTGF(100ng/mL)处理的骨髓间充质干细胞的图像，其提示大量的胶原合成(与示出没有CCN2/CTGF处理的MSC的图IA相比)。比例尺100μπι。图IC是示出I型胶原的条形图，而图ID是示出CCN2/CTGF处理的MSC细胞的生腱蛋白-C含量的图，在测试的2和4wk其显著高于没有CCN2/CTGF处理的MSC (η=5, *:ρ〈0· 05，**:ρ〈0· 01)。图 IE 是示出胶原沉积随 CCN2/CTGF 剂量从 O-lOOng/mL增加而增加的一系列图像。图IF是示出MSC表面标记(包括⑶29、⑶44、⑶105、⑶106、CD117、BMPR和Seal)在2和4wk的CCN2/CTGF处理时逐渐减弱(ρ〈0· 05)。图IG是条形图，其示出平行地，在2和4wk的CCN2/CTGF处理时，成纤维细胞标记逐渐增加，包括I和III型胶原、Tn-C、纤连蛋白、基质金属蛋白酶I (MMP-I)、成纤维细胞特异性蛋白I(FSPl)以及波形蛋白。在图IG中，成软骨标记(II型胶原)和肌成纤维细胞标记(a SMA)不可检测，而成骨标记(骨桥蛋白)极少表达。图2是示出CCN2/CTGF处理的MSC的克隆分化以及减弱的CCN2/CTGF处理的MSC分化为其他间充质谱系的能力的一系列图像。CCN2/CTGF处理的MSC(MSC-Fb) (4wk)表现出进ー步分化为用茜素红染色的成骨细胞(图2A)、用番红-O染色的软骨细胞(图2B)或用油红O染色的脂肪细胞(图2C)的最小能力。相比之下，没有CCN2/CTGF处理的相同MSC亚群容易地分化为成骨细胞(图2D)、软骨细胞(图2E)和脂肪细胞(图2F)。为了解决MSC的异质性，建立单克隆(B7、B12和E3)，并且分化为成纤维细胞(图2G、图2H、图21)、成骨细胞(图2J、图2K、图2L)、成脂细胞(图2M、图2N、图20)、成软骨细胞(图2、图2Q、图2R)。比例尺50μπι(图2C、图2F、图2Μ-0) ; 100 μ m(所有其他)。图3是示出通过TGF β I的MSC衍生的成纤维细胞的肌成纤维细胞分化的一系列图像以及线和散点图。未分化的MSC或CCN2/CTGF处理的MSC表达极少α -平滑肌肌动蛋白(a SMA)(图3Α、图3C)。当TGF β I处理时，MSC或MSC衍生的成纤维细胞容易地表达a SMA+微丝(图3B、图3D)。流式细胞术证实在MSC或MSC衍生的成纤维细胞(MSC-Fb)中不存在a SMA表达(图3Ε、图3G)。相比之下，31. 9%的CCN2/CTGF处理的MSC或MSC-Fb获得a SMA表型(图3Η)。引人注目的是，仅I. 8%的未分化的MSC在TGF β I刺激后获得a SMA表型(图3F)。胶原凝胶收缩测定显示，与未分化的MSC的CCN2/CTGF単独刺激(图3J)或TGF β I单独刺激(图3Κ)的中度收缩相比，顺序给予CCN2/CTGF和TGF β I的MSC产生最显著的收缩(图31)，没有CCN2/CTGF或TGF β I刺激的MSC产生最少的收缩(图3L)。定量地，通过CCN2/CTGF和TGF β I顺序刺激MSC产生最显著的胶原凝胶收缩(图3Μ) (ρ〈0. 05)。比例尺100 μ m。图4是示出CCN2/CTGF在体内促进纤维发生代替异位骨发生的一系列图像以及线和散点图。在图4A中，在代表性3D重建μ CT图像上，切除骨性联结的颅骨缝后异位矿化容易地发生(方框)。在图4Β中，当CCN2/CTGF控释时，颅骨缝的解剖形态学恢复，不存在异位矿化。包裹CCN2/CTGF的PLGA微球直径为120±64 μ m每SEM图像(图4C)，并且在体外表现出长达测试的6wk的缓释(n=6)(图4D)。H&E染色显示与没有CCN2/CTGF递送的异 位矿化(图4E、图4G)相比，颅骨缝的显微形态学在CCN2/CTGF控释时恢复(图4F、图4H)。一些包裹CCN2/CTGF的微球(μ s)在操作后(post-op) 4wk保持存在(图4F、图4H)。丰富的FSPl和波形蛋白表达(分别为图4J、图4L)表明在再生的颅骨缝中存在成纤维细胞样细胞。相比之下，FSPl和波形蛋白表达仅限于没有CCN2/CTGF递送的闭塞骨的骨髄(图41、图 4K) ο 比例尺:1mm(图 4A、图 4B)，500 μ m(图 4E、图 4F)，200 μ m(图 4G、图 4H、图 4I-L)。图5是示出CCT2/CTGF促进器官培养中颅骨缝的离体形态发生的一系列图像和条形图。Sprague Dawley大鼠的额间缝(IFS)在出生后第10天(plO)明显(图5A),显示矿化骨之间的成纤维细胞软组织。IFS在大约出生后第25天(p25)进行异位矿化或骨性联结。代表性P35的颅骨缝的特征在于成纤维细胞软组织实际上消失并且其被现有的矿化骨之间致密的矿化组织代替(图5B)。将50ng/mL的CCN2/CTGF递送至plO外植体保持25天使得颅骨缝以免发生异位矿化(图5C)，表明矿化骨之间存在成纤维细胞、软组织界面。b :骨，s :缝。与没有CCN2/CTGF的微弱FSPl表达和波形蛋白的几乎不存在(分别为图5E和图5H)相比，FSPl和波形蛋白在代表性plO先天颅骨缝和代表性CCN2/CTGF处理的颅骨缝中表达(图邪、图5F为FSP1，而图5G、图51为波形蛋白)。与用CCN2/CTGF处理的p35的宽阔的明显缝(图5K)相比，代表性的没有CCN2/CTGF递送的p35的颅骨缝的宽度在3Dμ CT重建样品上是狭窄的(图5J)。定量地，CCN2/CTGF处理的缝的平均宽度显著宽于没有CCN2/CTGF的(图5L) (ρ〈0· 05;Ν=8)。从CCN2/CTGF处理的缝收获的软组织表现出显著多于无CCN2/CTGF的缝的Tn-C含量(图5Μ) (ρ〈0· 05)。比例尺60 μ m。图6是证实颅骨缝间充质细胞表现出多谱系分化能力的一系列图像。分离自p7的天然的明显颅骨缝的细胞容易地分化为成纤维细胞样细胞，所述成纤维细胞样细胞在100ng/mL的CCN2/CTGF刺激时高度三色阳性(图6A)。相比之下，分离的没有CCN2/CTGF处理的颅骨缝细胞继续呈现MSC形态并合成很少的胶原(图6E)。与分离的没有成骨刺激的细胞(图6F)相比，将在20-30天内进行骨性联结的来自p7颅盖的缝细胞在有或无CCN2/CTGF的成骨刺激下容易地分化为成骨细胞(图6B、图6C)。而且，与分离的没有成脂刺激的缝细胞(图6G)相比，分离的颅骨缝细胞在允许的条件下进行成脂分化(图6D)。比例尺100 μ m(图 6A、图 6D-G),50ym(图 6B、图 6C)。图7是示出CCN2/CTGF处理的细胞不是成骨的或成软骨的一系列图像和条形图。冯库萨(Von Kossa)染色在CCN2/CTGF处理的MSC中为阴性(图7B)，正如没有CCN2/CTGF处理的MSC(图7A)。相比之下，接受成骨刺激的MSC容易地分化为积累(elaborate)矿物的成骨细胞(图7C)。番红O染色在CCN2/CTGF处理的MSC中为阴性(图7E)，正如没有CCN2/CTGF处理的MSC (图7D)。相比之下，接受成软骨刺激的MSC容易地分化为番红O阳性的成软骨细胞(图7F)。定量地，成骨刺激下的MSC积累比有或无CCN2/CTGF处理的相同细胞亚群显著更多的钙(图7G) (n=5，*:p〈0.05，林:p〈0.01)。平行地，成软骨刺激下的MSC产生比有或无CCN2/CTGF处理的相同细胞亚群显著更多的糖胺聚糖(GAG) (H)(η=5, *:ρ〈0· 05, **:ρ〈0· 01)。比例尺100 μ m。图8是来自用CTGF (100ng/ml)处理的人骨髓MSC的磷光体-p38和磷光体-TrKA的一系列凝胶图像。图9 是用 100ng/ml CTGF (图 9A) ;0· 2 μ M ρ38 抑制剂和 lOOng/mlCTGF (图 9B)； Iμ M ρ38 抑制剂和 100ng/ml CTGF (图 9C)；以及 5 μ M ρ38 抑制剂和 100ng/ml CTGF (图9D)处理的人骨髓MSC的一系列图像。图10是用抗坏血酸和100ng/ml CTGF (图10A);抗坏血酸、0. 2 μ M ρ38抑制剂和100ng/ml CTGF (图 10B);抗坏血酸、I μ M ρ38 抑制剂和 100ng/mlCTGF (图 10C);以及抗坏血酸、5 μ M ρ38抑制剂和100ng/ml CTGF(图10D)处理的人骨髓MSC的一系列图像。图11是染色的用抗坏血酸和100ng/ml CTGF (图11A);抗坏血酸、50ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (图 11B);抗坏血酸、100ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF(图 11C);抗坏血酸、200ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (图 11D);抗坏血酸、500ng/mlK252a/DMS0和100ng/ml CTGF (图I IE)处理的人骨髓MSC以及对照MSC (图11F)的一系列图像。图12是染色的用抗坏血酸和100ng/ml CTGF (图12A);抗坏血酸、50ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (图 12B);抗坏血酸、100ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/mlCTGF (图 12C);抗坏血酸、200ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (图 12D);抗坏血酸、500ng/mlK252a/DMS0 和 100ng/ml CTGF (图 12E)处理的人骨髓 MSC 以及对照 MSC (图 12F)的一系列图像。图13是示出P38抑制剂减少瘢痕瘤细胞基质合成的一系列图像。图13A示出用O μ M P38抑制剂处理的细胞。图13Β示出用0. 2 μ M Ρ38抑制剂处理的细胞。图13C示出用I μ M Ρ38抑制剂处理的细胞。图13D示出用5 μ M Ρ38抑制剂处理的细胞。图14是示出Κ252Α抑制剂抑制瘢痕瘤细胞基质合成的一系列图像。图14Α示出用 DMSO处理的细胞。图14Β示出用0ng/ml K252A处理的细胞。图14C示出用50ng/ml K252A处理的细胞。图14D示出用100ng/mlK252A处理的细胞。图14E示出用200ng/ml K252A处理的细胞。图14F示出用500ng/ml K252A处理的细胞。图15是示出图14的细胞的4X放大的一系列图像。图15A示出用DMSO处理的细胞。图15B示出用0ng/ml K252A处理的细胞。图15C示出用50ng/ml K252A处理的细胞。图KD示出用100ng/ml K252A处理的细胞。图15E示出用200ng/ml K252A处理的细胞。图15F示出用500ng/mlK252A处理的细胞。图16是示出图14的细胞的10X放大的一系列图像。图16A示出用DMSO处理的细胞。图16B示出用Ong/ml K252A处理的细胞。图16C示出用50ng/ml K252A处理的细胞。图16D示出用100ng/ml K252A处理的细胞。图16E示出用200ng/ml K252A处理的细胞。图16F示出用500ng/mlK252A处理的细胞。发明详沭本文提出的方面至少部分基于怎样从间充质细胞衍生成纤维细胞的发现；特别是成纤维细胞可以衍生自四肢(appendicular)骨髓和颅骨间充质干细胞(MSC)的发现。CCN2/CTGF刺激的MSC可以形成成纤维细胞。本文示出从多能MSC衍生FSP1+、波形蛋白+、Colll+和aSMA_成纤维细胞。
因此，CCN2/CTGF可以用来将创伤中的祖细胞如间充质干细胞转化为具有最小瘢痕的參与正常创伤愈合的α平滑肌肌动蛋白阴性成纤维细胞。还发现CCN2/CTGF和TGF3 I的轴可以指定成纤维细胞承担(commitment)、纤维发生和纤维化的逐步和独特的过程。TGF^ I刺激CCN2/CTGF衍生的成纤维细胞可以形成肌成纤维细胞，所述肌成纤维细胞牵涉癌症基质、病理性瘢痕和器官纤维化，包括心脏、肺、肾和肝。因此，抑制TGFii I可以减少或消除从创伤中的CCN2/CTGF刺激的MSC形成肌成纤维细胞，其中这类水平升高的α平滑肌肌动蛋白阴性成纤维细胞可以參与创伤愈合，具有进ー步减小的瘢痕。此外，据发现P38抑制剂可以用作纤维化抑制剂。并且已发现酪氨酸激酶抑制剂可以用作纤维化抑制剂。本发明的一方面涉及组合物，其包含CCN2/CTGF和纤维化抑制剂，例如TGFβ的抑制剂、Ρ38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激间充质祖细胞分化为成纤维细胞，从而提高纤维发生的水平并帮助创伤愈合。此外，TGFii的抑制剂可以减少或消除成纤维细胞分化为与愈合过程中的消极结果有关的肌成纤维细胞。并且Ρ38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂可以用作纤维化抑制剂。本文所述的组合物可以用来促进或加速组织创伤的愈合，特别是软组织创伤。本文所述的组合物可以是药物组合物。如下文进ー步详细描述的，本文所述的药物组合物可以包含药学可接受的载体或赋形剂。本文所述的药物组合物可以进一歩配制为包含其他活性物质，包括但不限于抗生素或免疫抑制剂。药物组合物可以配制为用于各种给药途径，包括局部。这类组合物可以诱导纤维发生，促进或加速创伤愈合，減少肌成纤维细胞形成，減少纤维化，或者減少瘢痕，连同本文所述的其他益处。本发明的另一方面涉及用于创伤愈合的系统。这类系统可以包含用于创伤愈合的常规医疗器械，例如绷带、止血粉或缝线，所述医疗器械包含本文所述的组合物。这样的系统可以通过诱导纤维发生，促进或加速创伤愈合，減少肌成纤维细胞形成，減少纤维化，或者減少瘢痕(例如，异常、瘢痕瘤和肥大性瘢痕)，连同本文所述的其他益处来放大所述器械的愈合效果。本发明的另一方面涉及ー种治疗个体的方法。如上文简要描述和下文更深入描述的，CCN2/CTGF可以诱导纤维发生，促进或加速创伤愈合，減少肌成纤维细胞形成，減少纤维化，或者減少瘢痕，连同本文所述的其他益处。因此本文所述的方法可以帮助组织创伤的愈合，例如，急性或慢性创伤；皮肤、韧带或腱创伤；开放性或闭合性创伤；切割、撕裂、擦伤、穿刺、穿透或枪弹创伤；或者分裂裂伤、过度拉伸、磨压、割裂或撕裂创伤；或者上述创伤的各种组合。本发明的另一方面涉及ー种形成a SMA-成纤维细胞的方法。使a SMA-、⑶34_间充质祖细胞与CCN2/CTGF接触可以导致CCN2/CTGF刺激的间充质干细胞分化为a SMA-、FSP1+、波形蛋白+、Colll+成纤维细胞。例如，可以将这样的a SMA-成纤维细胞引入创伤部位或者包含在用于创伤治疗的组合物中。下文提供这些和其他方面和特征的进ー步讨论。CCN2/CTGF本文所述的组合物、方法、系统和试剂盒的各种实施方案包含CCN2/CTGF。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激a SMA-⑶34-间充质祖细胞分化为a SMA-成纤维细胞。还如本文所示，CCN2/CTGF可以减弱多能干性(sternness)基因，增加I型胶原的合成并刺激成纤维细胞标志，包括FSP1、波形蛋白、纤连蛋白和生腱蛋白-C。此外，如本文所示，从CCN2/CTGF刺激a SMA-间充质祖细胞分化的成纤维细胞可以保留a SMA-特征。CCN2/CTGF是36-38kDa的富含半胱氨酸的CCN家族蛋白。CCN2/CTGF可以单独或者与其他生长因子或物质联合包含在本文所述的组合物、方法、系统和试剂盒中。在一 些实施方案中，所述CCN2/CTGF为人CCN2/CTGF或重组人CCN2/CTGF。例如，所述CCN2/CTGF可以是对应于登录号NP_001892的CCN2/CTGF或其变体。CCN2/CTGF可从各种商业来源获得(例如，BioVendor, Chandler, NC ;合成 CCN2/CTGF 肽 RANCLVQTTEWSAC SKT, SynPepCorporation, Dublin, CA)。在一些实施方案中，CCN2/CTGF包含SEQ ID NO: I的多肽，或者包含与SEQ ID NO: I具有至少约80%序列相同性并且具有CTGF活性的序列的多肽。例如，所述CCN2/CTGF可以包含多肽，所述多肽包含与SEQ IDNO: I具有至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列相同性并且具有 CTGF 活性的序列。CCN2/CTGF可以作为例如分离的多肽或多核苷酸在制剂中给药。CCN2/CTGF的多核苷酸组合物包括但不限于包含编码CCN2/CTGF的多核苷酸的基因治疗载体。基因治疗方法需要可操作地连接或关联至启动子的编码CCN2/CTGF的多核苷酸，以及靶组织表达CCN2/CTGF所必需的任何其他遗传元件。这类基因治疗和递送技术是本领域已知的(參见例如，Smyth Templeton (2003) Gene and Cell Therapy, CRC, ISBN 0824741048)。合适的基因治疗载体包括但不限于不整合入宿主基因组的基因治疗载体。或者，合适的基因治疗载体包括但不限于整合入宿主基因组的基因治疗载体。CCN2/CTGF多核苷酸可以在质粒制剂中递送。质粒DNA或RNA制剂一般包含游离于任何递送媒介物的编码CCN2/CTGF的序列，所述递送媒介物用来辅助、推动、或促进进入细胞，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体(liposome)制剂、脂质体(Iipofectin)或沉淀剂等。任选地，所述实施方案的基因治疗组合物可以在脂质体(liposome)制剂和脂质体(Iipofectin)制剂中递送,其可以通过本领域技术人员公知的方法制备(參见例如，SmythTempleton(2003)Gene and Cell Therapy, CRC, ISBN 0824741048)。基因治疗载体还可以包括合适的腺病毒载体，包括但不限于例如Curiel and Douglas (2002) Adenoviral Vectorsfor Gene Therapy, Academic Press, ISBN0121995046 所述的腺病韋载体。上文所述的CCN2/CTGF可转录多核苷酸分子序列可以在构建体中提供。构建体一般包含可操作地连接至如上文所述的CCN2/CTGF及其变体的可转录多核苷酸分子的启动子。启动子选择可以允许在各种条件下表达CCN2/CTGF。启动子还可以在它们的调控特征的基础上选择。这类特征的实例包括增强转录活性以及诱导性。所述启动子可以是诱导型启动子。例如，所述启动子可以根据温度、pH、激素、代谢物(例如，乳糖、甘露醇、氨基酸)、光(例如，波长特异性)、渗透势(例如，盐诱导)、重金属或抗生素来诱导。许多标准诱导型启动子是本领域技术人员已知的。术 语“构建体”理解为指任何重组多核苷酸分子，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或者线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其衍生自任何来源，能够基因组整合或自主复制，包含多核苷酸分子，其中ー个或多个多核苷酸分子以功能上有效的方式连接，即可操作地连接。CCN2/CTGF可以通过转化宿主细胞以表达CCN2/CTGF并将转化的细胞引入个体来递送至所述个体。可以利用本领域已知的各种标准技术转化宿主细胞(參见，例如，Sambrook and Russel (2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879697717;Ausubel et al. (2002)Short Protocols in Molecular Biology,5th ed. , Current Protocols, ISBN-10:0471250929;Sambrook and Russel(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879695773;Elhai, J.and ffolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167，747-754)。这类技术包括但不限于病韋感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、受体介导的吸收、细胞融合、电穿孔等。可以将转染的细胞加以选择并增殖以提供包含稳定整合在宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。纤维发生物质的多肽组合物包括但不限于CCN2/CTGF多肽。纤维发生物质的多肽组合物包括但不限于分离的全长蛋白、其片段和变体。纤维发生物质的多肽片段可以包含分离的全长多肽的前肽形式，或者可选地由分离的全长多肽的前肽形式組成。生长因子物质的多肽片段可以包含分离的全长多肽的成熟形式，或者可选地由分离的全长多肽的成熟形式組成。本发明还提供编码CCN2/CTGF的前肽和成熟多肽的多核苷酸。CCN2/CTGF的变体包括但不限于设计来增加CCN2/CTGF活性在体内的持续时间的蛋白变体。例如，变体纤维发生物质包括缀合至聚こニ醇(PEG)部分以增加它们的体内半衰期(也称为聚こニ醇化)的全长CCN2/CTGF蛋白或其片段。CCN2/CTGF可以作为融合蛋白提供在制剂中。例如，CCN2/CTGF可以是与人IgG的F。部分的融合蛋白。作为另ー实例，CCN2/CTGF可以是异源ニ聚体或同源ニ聚体或者多聚体。融合蛋白的实例包括但不限于成熟CCN2/CTGF多肽与人免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分之间的配体融合。制备融合蛋白的方法和编码融合蛋白的构建体是本领域公知的。各种实施方案还包括使用可以促进纤维发生或刺激成纤维细胞分化的多核苷酸和多肽，其与本文所述的分离的CCN2/CTGF的多核苷酸和多肽具有至少80%序列相同性。例如，多核苷酸和多肽可以与本文所述的分离的CCN2/CTGF的多核苷酸和多肽具有至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%序列相同性。CCN2/CTGF 可以约 O. lng/ml-约 100mg/ml 的浓度给药。例如，CCN2/CTGF 可以约O. lng/ml、lng/ml、10ng/ml、100ng/ml、lmg/ml、10mg/ml 或 100mg/ml 的浓度给药。作为另一实例，CCN2/CTGF 可以约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300叩/111し的浓度给药。作为另ー实例，CCN2/CTGF 可以约 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950或1000ng/mL的浓度给药。作为进ー步的实例，CCN2/CTGF可以约100ng/ml给药。技术人员会认识到这样的有效量可以反映在存在于药物组合物中的CCN2/CTGF的量，例如每剂量水平。在一些实施方案中，可以将CCN2/CTGF并入递送媒介物。下文讨论各种递送媒介物。在一实施方案中，将包含CCN2/CTGF的组合物包裹在聚合微球中。CCN2/CTGF可以约IOOmg-约500mg聚合物比约I-约100 μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。例如，CCN2/CTGF 可以约 10:10、约 50:10、约 100:10、约 150:10、约 200:10、约 250:10、约 300:10、约350:10、约400:10、约450:10或500:10的mg聚合物μ g的CCN2/CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一实施方案中，组合物以约250mg聚合物比约10μ g的CTGF的比例包裹在聚合微球中。在一些实施方案中，可以通过将约I-约IOOmg的包裹CTGF的微球引入组织创伤 来将包含CCN2/CTGF的组合物给予组织创伤。例如，可以将约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约76、约75、约80、约85、约90、约95或约IOOmg的包裹CTGF的微球引入组织创伤。CCN2/CTGF可以在约3-8的pH下给药。CCN2/CTGF或CCN2/CTGF制剂可以是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜(例如，0. 2微米膜或滤器)过滤容易地实现。本领域技术人员会认识到，CCN2/CTGF或其他纤维发生物质的浓度可以基于促进成纤维细胞分化或纤维发生的期望长度或程度变化。相似地，本领域技术人员会理解缓释的持续时间可以通过操纵包含缓释制剂的组合物来改变，例如，改变缓释聚合物中的生物稳定聚合物的百分比。为本文所述的目的确定CCN2/CTGF的有效量在本领域的普通技术内。MSC在一些实施方案中，所述组合物、方法、系统或试剂盒可以包含间充质祖细胞。据发现成纤维细胞可以衍生自间充质起源的祖细胞。如本文所示，CCN2/CTGF可以刺激⑶34-、a SMA-间充质祖细胞分化为a SMA-成纤维细胞。从而在含有CCN2/CTGF的组合物中提供间充质祖细胞(例如，CD34-间充质干细胞)可以提供将α SMA-成纤维细胞递送至创伤部位，在那里这样的成纤维细胞可以例如増加纤维发生并帮助创伤愈合。如本文所用，间充质祖细胞或间充质起源的祖细胞为CD34—祖细胞，例如CD34—间充质干细胞。通常，间充质起源的祖细胞是成纤维细胞的前体，并且在CCN2/CTGF的存在下分化。成纤维细胞可以衍生自⑶34_祖细胞。⑶34_细胞实质上与造血谱系的⑶34+不同(37，38)。成纤维细胞可以衍生自a SMAli细胞。成纤维细胞可以衍生自⑶34_、a SMA_祖细胞。例如，并且如本文所证实的，成纤维细胞可以衍生自中胚层起源的四肢骨髓以及神经嵴起源的颅骨缝。在一些实施方案中，用作衍生成纤维细胞的起始原料的祖细胞不是CD34+和a SMA+纤维细胞，据认为其从骨髓迁移至癌症基质或外周创伤(6)。用于分化为成纤维细胞的间充质祖细胞可以获得自各种来源。用于分化为成纤维细胞的间充质祖细胞可以是个体自体的(即，来自相同个体)、同种异体的(即，来自相同物种的遗传上不相同的供体)、同基因的(即，来自遗传上相同的供体)或异种的(即，来自不同物种)。例如，间充质祖细胞可以分离自待根据本文所述的方法治疗的个体。间充质祖细胞可以通过本领域已知的各种方法分离、纯化和/或培养。分离和培养祖细胞的方法在例如 Vunjak-Novakovic and Freshney (2006)Culture of Cells forTissue Engineering, ffiley-Liss, ISBN 0471629359 中讨论。例如，MSC 可以分离自骨髄。细胞分离可以通过本领域公知的方法进行，例如骨髓穿刺。间充质祖细胞可以来源于相同或不同物种作为移植受体。例如，间充质祖细胞可以来源于动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物和禽类，更优选马、牛、狗、猫、羊、猪和鸡，并且最优选人。成纤维细胞本文提供CCN2/CTGF诱导(derived)的a SMA-成纤维细胞。在一些实施方案中， CCN2/CTGF诱导的成纤维细胞为FSP1+、波形蛋白+、Colll+和a SMA-。这类成纤维细胞可以參与例如正常创伤愈合，具有最少的瘢痕。如本文所示，CCN2/CTGF可以用来促成纤维发生而不是骨发生。36-38kDa的富含半胱氨酸的CCN家族蛋白CCN2/CTGF可以用于间充质分化为成纤维细胞。CCN2/CTGF刺激的MSC可以减弱多能干性基因。CCN2/CTGF刺激的MSC可以具有増加的I型胶原合成。CCN2/CTGF刺激的MSC可以表达成纤维细胞标志，包括FSP1、波形蛋白、纤连蛋白和生腱蛋白-C。CCN2/CTGF刺激的MSC可以为a SMA阴性。CCN2/CTGF刺激的MSC可以具有稳定谱系。例如，CCN2/CTGF诱导的成纤维细胞可以具有减弱的分化为其他间充质非成纤维细胞谱系(包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞)的能力。根据本文所述的各种实施方案，可以使CCN2/CTGF与间充质祖细胞接触以刺激形成成纤维细胞。培养祖细胞的方法是本领域公知的，并且可以改变这类方法以提供与CCN2/CTGF接触的间充质祖细胞分化的最佳条件。在一些实施方案中，CCN2/CTGF诱导的a SMA-成纤维细胞作为富集的细胞培养物存在。例如，用CCN2/CTGF处理的间充质干细胞的培养物可以包含至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或者至少约99%的a SMA-成纤维细胞。TGF^ 抑制剂在一些实施方案中，组合物、方法、系统和试剂盒包含TGF β抑制剂。如本文所示，尽管CCN2/CTGF处理的MSC为α SM-,但是用TGF β I进ー步刺激可以将所述细胞转化为a SMA+细胞特征的肌成纤维细胞，其在体外显著收缩胶原凝胶。TGF0抑制剂可以防止从成纤维细胞形成肌成纤维细胞。TGFii抑制剂可以抑制纤维化。肉芽组织的成纤维细胞收缩是正常皮肤创伤愈合必需的(6)。但是肌成纤维细胞(a SMA+细胞类型)过剩以及相关的过量胶原生成、混乱和过度创伤收缩可以导致病理性皮肤创伤愈合和瘢痕。a SMA+肌成纤维细胞牵涉侵袭性肿瘤(癌症基质)、异常皮肤愈合、病理性瘢痕和器官纤维化，包括心脏、肺、肾和肝。通过减少肌成纤维细胞形成，可以减少这类消极的相关影响。因此，抑制或降低TGFP (例如，TGF^ I)的水平可以减少或消除CCN2/CTGF处理的成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，从而避免与a SMA+肌成纤维细胞相关的消极并发症。TGFβ抑制剂可以包含在与CCN2/CTGF相同的组合物或另ー组合物中。TGFP抑制剂和CCN2/CTGF可以连续或同时给予个体。例如，当第一组合物包含CCN2/CTGF和TGF3抑制剂时，则给药可以是连续的。作为另ー实例，当第一组合物包含CCN2/CTGF并且第二組合物包含TGFii抑制剂时，则给药可以是连续的。或者，当第一组合物包含CCN2/CTGF并且第ニ组合物包含TGFii抑制剂时，给药可以是同时的。应当理解除了包含两者的制剂，CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGFii抑制剂、P38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂)可以独立地给药，例如，以便进ー步调整创伤部位存在的各物质的量。在一些实施方案中，TGFP的抑制剂可以减少或消除从成纤维细胞形成肌成纤维细胞。例如，TGF^的抑制剂可以减少或消除从a SMA-成纤维细胞形成a SMA+肌成纤维细胞。所述抑制剂可以是TGF β I的抑制剂。所述抑制剂可以是TGF β 2的抑制剂。所述抑制剂可以是TGFβ 3的抑制剂。例如，TGFβ I的抑制剂可以减少或消除从CCN2/CTGF刺激的a SMA-、⑶34-间充质祖细胞分化为a SMA+肌成纤维细胞。作为另ー实例，TGFβ I的抑制剂可以減少或消除从a SMA-成纤维细胞分化为aSMA+肌成纤维细胞。 在一些实施方案中，TGFβ的抑制剂可以减少从a SMA-成纤维细胞形成a SMA+肌成纤维细胞约5%。例如，TGFβ的抑制剂可以减少从a SMA-成纤维细胞形成a SMA+肌成纤维细胞约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 30%、约 35%、约 40%、约 45%、约 50%、约 55%、约 60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%。在一些实施方案中，TGFβ的抑制剂可以大幅减少从a SMA-成纤维细胞形成a SMA+肌成纤维细胞。本文所用的TGFβ抑制剂(例如，TGFβ I抑制剂)一般包括抗体、作为竞争性或不可逆拮抗剂的小分子、反义寡核苷酸、蛋白适配体、核苷酸适配体以及小干扰RNA。用于本文所述的组合物和方法的TGF0抑制剂可以包括但不限于描述于Saunierand Akhurst 2006 Current Cancer Drug Targets 6 (7)565-578;Callahan et al. 2002 JMed Chem 45 (5) 999-1001 和 Border et al. 1992 Nature360, 361-364 的那些 TGF β 抑制齐 。用于本文所述的组合物和方法的TGFP抑制剂可以包括但不限于 ANG-1122(Angion Biomedica) ;ΑΡ_11014(Antisense Pharma);美替木单抗(AstraZeneca);夫苏木单抗(AstraZeneca);甘露糖-6_ 憐酸，BTG (BTG) ； Pharmapro jectsNo. 6614 (Celgene) ；NAFBOOI (Digna Biotech) ；NAFB002 (Digna Biotech) JGF-βΙ 抗体，Lill バ Eli Lilly) ;LY_2157299 (Eli Lilly);胎球蛋白(Eli Lilly) JGF-β 拮抗剂，FibroGen (FibroGen) ； IDlI (Genzyme)；抗 TGF β MAb-I, Genzyme (Genzyme)；SB-431542(GlaxoSmithKline);激活素样激酶 5 抑制剂，Graceway (Graceway)；抗 TGF-β 抗体，Genent (Hoffmann-La Roche);反义寡核苷酸，Il (Il-Yang)；TGF- β 拮抗剂，Inflazyme (Inflazyme) ；TGF- β 受体，Insmed (Insmed) ；TGF- β 拮手几剂，Inspiraplex (Inspiraplex);饰月父蛋白，Telios (Integra LifeSciences)；SX-007(Johnson &Johnson) ；TGF-β 受体抑制剂，J&J(Johnson & Johnson) ；TGF-β疫苗，Neovacs (Neovacs) ;ADMP_1 (NIH) ；TGF- β 抗体，Manchester ;TGF_ β 拮抗齐[J，Sydney ;甘露糖-6-憐酸，Renovo (Renovo);癌症基因治疗，Resver (Resverlogix)；TGF-β Shield(Resverlogix) ；IN-1130 (SK Chemicals) ；LF-984(Solvay) JGF-β 抑制剂，Mill(Takeda);饰胶蛋白;以及 SB-431542 (Sigma)。用于本文所述的组合物和方法的其他TGFβ抑制剂可以获得自本领域已知的来源，例如 Angion Biomedica;Antisense Pharma;AstraZeneca;AVIBioPharma;Biogeη Idec;BTG;CeIgene;Digna Biotech;Eli Lilly;FibroGen;Genzyme;GlaxoSmithKline;Graceway;Hoffmann-La Roche;丄l_Yang;Inilazyme;Insmed;Inspiraplex;IntegraLifeSciences;Johnson & Johnson;Neovacs;Renovo;Resverlogix;Solvay;Takeda;以及^igma0为本文所述的目的确定TGF β抑制剂的有效量在本领域的普通技术内。纤维化抑制剂在一些实施方案中，组合物、方法、系统和试剂盒包含纤维化抑制剂。据发现Ρ38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂可以抑制纤维化。Ρ38抑制剂可以減少来自间充质祖细胞的成纤维细胞分化，減少瘢痕瘤细胞胶原合成，减少瘢痕瘤细胞生长，或者它们的组合。Ρ38抑制剂的实例包括但不限于Tocriset、SD282、SB239063、SB203580、SB220025、SKF86002、PD169316、SB202190、SC68376、 VX702、VX745、R130823、AMG548、BIRB796、SCI0469、SCI0323、FR167653、MW012069ASRM、SD169、RWJ67657 以及 ARRY797。给予包含p38抑制剂的组合物或制剂可以抑制结缔组织的形成。在一些实施方案中，使包含P38抑制剂的组合物或制剂与间充质祖细胞接触。酪氨酸激酶抑制剂可以減少来自间充质祖细胞的成纤维细胞分化，減少瘢痕瘤细胞胶原合成，减少瘢痕瘤细胞生长，或者它们的组合。酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于K252a、AGO13736 (阿昔替尼)、SKI-606 (波舒替尼)、AZD2171 (西地尼布)、BMS-354825(达沙替尼)、0SI-774(厄洛替尼)、ZD1839 (吉非替尼)、STI_571(伊马替尼)、GW572016 (拉帕替尼)、CEP-701 (来妥替尼)、AMN107 (尼洛替尼)、SU5416 (司马沙尼)、SUl 1248 (舒尼替尼)、托西尼布、ZD6474(凡德他尼)、伐他拉尼(PTK787)、ZD 1839、CI-1033,0SI-774,Gff 2016、EKB_569、頂C_C225、MDX_447、PKI 116、ABX_EGF、AG-82、AG_18、AG-490、AG-17、AG-213, AG-494, AG-825, AG-879, AG-1112, AG-1296, AG-1478, AG-126,RG-13022,RG-14620以及AG-555。给予包含酪氨酸激酶抑制剂的组合物或制剂可以抑制结缔组织的形成。在一些实施方案中，使包含酪氨酸激酶抑制剂的组合物或制剂与间充质祖细胞接触。制剂和载体在各种实施方案中，组合物、方法、系统和试剂盒包含配制的组合物。本文所述的组合物可以例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro, Ed. ), 21stedition, ISBN: 0781746736 (2005)所述，使用一种或多种药学可接受的载体或赋形剂通过任何常规方式配制，该文献整体援引加入本文。这类制剂包含治疗有效量的本文所述的生物学活性物质，优选为纯化的形式，连同适量的载体以提供适当给予个体的形式。所述制剂应当适合给药模式。与本发明一起使用的物质可以通过已知的方法配制，用于利用几种途径给予个体，所述途径包括但不限于局部、肠胃夕卜、肺部、ロ服、皮内、肌肉内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、眼部、口腔以及直肠。単独的物质还可以联合一种或多种其他物质给药，或者与其他生物学活性物质或生物学惰性物质一起给药。这类生物学活性物质或惰性物质可以在液体中，或者与所述物质机械上联系，或者通过离子、共价、范德华、疏水、亲水或其他物理力连接至所述物质。
本文所述的组合物和制剂可以任选包含抗生素，所述抗生素可以共给药以预防被过程中引入个体的专性或机会致病菌感染。可与生长因子制剂使用的抗生素包括但不限于阿莫西林、β -内酰胺酶、氨基糖苷、β -内酰胺(糖肽)、克林霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星、红霉素、氟喹诺酮、大环内酷、甲硝唑、青霉素、喹诺酮、雷帕霉素、利福平、链霉素、磺胺、四环素、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑以及万古霉素。本文所述的组合物和制剂可以任选还包含免疫抑制剂。可以与生长因子制剂联合给药的合适的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、环胞素、环胞素类似物、环磷酰胺、甲基泼尼松、泼尼松、硫唑嘌呤、FK-506U5-脱氧精胍菌素以及通过抑制应答T细胞的功能来发挥功能的其他免疫抑制剂。可以与生长因子制剂联合给药的其他免疫抑制剂包括但不限于泼尼松龙、甲氨蝶呤、沙利度胺、甲氧沙林、雷帕霉素、来氟米特、咪唑立宾(bredinin )、布喹那、脱氧精胍菌素、和氮杂螺烷(SKF 105685)、Orthoclone 0ΚΤ 3(莫罗单抗-CD3)、Sandimmune 、Neoral 、Sangdya (环胞素)、Prograf (FK506、他克莫司)、Cellcept (麦考酚酸酷，其活性代谢物为麦考酚酸)、Imuran (硫唑嘌呤)、糖皮质类固醇、肾上腺皮质类固醇如Deltasone (泼尼松)和Hydeltrasol (泼尼松龙)、Folex 和Mexate (甲氨蝶 呤)、Oxsoralen-Ultra (甲氧沙林)和 Rapamuen (西罗莫司)。本文所述的组合物和制剂可以任选还包含载体媒介物如水、盐水、林格氏液、基于磷酸钙的载体或葡萄糖溶液。非水性媒介物如不挥发性油和油酸こ酷，以及脂质体也可用于本文。本文所述的组合物和制剂可以还任选包含增强等渗性和化学稳定性的物质。这类物质在采用的剂量和浓度对个体无毒，并且包括缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸以及其他有机酸或它们的盐；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、ニ糖以及碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剤，如EDTA ;糖醇，如甘露醇或山梨醇；平衡离子，如钠；和/或非离子型表面活性剤，如聚山梨酷、泊洛沙姆或PEG。可以配制控释(或缓释)制剂以延长物质的活性并降低剂量给药频率。控释制剂还可以用来影响作用起效的时间或其他特征，如物质的血液水平，并且因而影响副作用的发生。控释制剂可以设计为最初释放产生期望的疗效的量的物质，而且逐渐并持续释放其他量的所述物质以在延长的时间中保持疗效水平。为了保持体内接近恒定水平的物质，所述物质可以代替代谢或从身体排泄的物质的量的速率从剂型释放。物质的控释可以通过各种诱导物刺激，例如，PH的变化、温度的变化、酶、水或者其他生理条件或分子。本文所述的组合物和制剂可以制备为即释制剂、缓释制剂或两者。本领域技术人员可以确定个体会受益于即释制剂或缓释制剂。即释制剂包括液体制剂，其包含施用于靶区域的物质，如CCN2/CTGF。液体制剂可以由液体制剂的流体特性決定的速率提供生物可利用形式的CCN2/CTGF，例如在施用部位的扩散速率、内源流体的影响等。合适的液体制剂的实例包括水、盐水或者不会诱导宿主免疫应答的其他可接受的流体介质。技术人员会认识到CCN2/CTGF需要在缺陷的部位存在足够长的时间以促进纤维发生，并且优选不应当滲透至周围区域。利用本文提供的指导，本领域技术人员能够设计合适的制剂用于递送。
本文所述的组合物和制剂，包括那些包含CCN2/CTGF的组合物和制剂，可以包裹在各种载体递送系统中并在各种载体递送系统中给药。载体材料可以包含、包衣或注入本文所述的组合物和制剂，例如包含CCN2/CTGF的组合物或制剂。可以这样的方式使用的载体材料的实例包括但不限于聚合递送系统(例如，生物可降解的聚合物材料、胶原海绵)。如本文所示，从生物相容性微球控释的CCN2/CTGF在体内恢复间充质/纤维发生颅骨缝的形态发生，否则其注定发生异位矿化。换句话说，微包裹的CCN2/CTGF在体内促使出现后(postnatal)的结缔组织进行纤维发生而不是异位矿化。控释制剂可以包含CCN2/CTGF和其他物质(例如，TGF β抑制剂)以及载体递送系统。从缓释制剂释放的持续时间由制剂的性质和其他因素决定，例如，与体液的接近性，以及制剂施用的密度、生物可降解的聚合物的降解速率和其他因素。然而，缓释制剂可以设计为在延长的时间中以相对一致的浓度和生物可利用的形式提供制剂中的CCN2/CTGF (和其他物质，如TGFii抑制剤)。 载体递送系统一般包裹活性物质，如CCN2/CTGF，并且在延长的时间中提供该物质的控释。通常，载体包含缀合至活性物质(如CCN2/CTGF)、与活性物质混合或用于包裹活性物质的分子。用于生物分子物质递送的基于载体的系统可以调整生物分子/物质释放速率；提高到达其作用部位的生物分子的比例；增进药物转运至其作用部位；允许与其他物质或赋形剂共定位沉积；提高所述物质的体内稳定性；通过降低清除率来延长所述物质在其作用部位的停留时间；減少所述物质非特异性递送至非靶组织；減少所述物质引起的刺激；降低由于所述物质的高初始剂量的毒性；改变所述物质的免疫原性；降低剂量给药频率，改善产物的味道；和/或延长产物的保质期。聚合释放系统可以用来递送本文所述的组合物或制剂(參见WhittleseyandShea(2004)Experimental Neurology 190，1-16)。聚合系统还可以设计为递送可以在细胞进程上协同或顺序作用的多种生物分子。聚合递送系统可以保持本文所述的生长因子如CCN2/CTGF的治疗水平，减少有害副作用，减少所需的生物分子的量，减少剂量的数目，并且促进体内半衰期短的物质的递送。释放速率可以通过改变孔径、结构和合成聚合物(如不可降解的合成聚合物EVAc和可降解的合成聚合物聚酯PLGA)的聚合物含量来控制。此外，材料本身的降解控制释放曲线，提供对释放速率的额外水平的控制。本文所述的聚合递送系统可以为了例如数分钟、数小时、数天、数周甚至数年的释放持续时间而调整，这取决于递送的分子的物理和化学特性、采用的聚合物以及制备期间所用的加工条件。天然(例如，胶原)和合成聚合物(例如，硅氧烷、聚乳酸-こ醇酸共聚物(PLGA)和聚こ烯-醋酸こ烯共聚物(EVAc))均可以用于CCN2/CTGF的局部递送。对于生物分子递送，优选生物可降解的聚合物，因为该装置可以随时间消失，消除外科手术取回的需要。PLGA是广泛使用的生物聚合物，因为其可商购、可控制的降解速率、证实的生物相容性以及FDA 批准(參见例如，Lu et al. (2000)Biomaterials 21,1837-1845)。聚酐是可以用于生物分子递送的相似类型的可降解的聚合物。聚合微球可以促进本文所述的包含CCN2/CTGF或其他物质如TGFP抑制剂的组合物或制剂的递送。例如，持续递送微球可以立体定向注射以在靶部位(例如，创伤或颅縫)释放生长因子的多肽或多核苷酸。微球可以利用天然存在或合成的聚合物制备以制备大小范围为O. 1-500 μ m的颗粒系统。通常，微球在物理和化学上比脂质体更稳定，并且允许更高的物质负荷。聚合微团和聚合体(polymerome)是具有与微球相似的特征的聚合递送媒介物，并且也可以促进包裹和递送本文所述的物质，如CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGF^抑制剂、P38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剤)。用于如CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGF^抑制剂、P38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂)的生物分子有效载荷的微球的制备、包裹和稳定在本领域的技术内(參见例如，Varde & Pack(2004)Expert Opin.Biol. 4(1)35-51)。可用于形成微球的聚合物材料包括PLA、PLGA、用DPPC包衣的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG, SDLMs、PEG (例如，ProMaxx)、透明质酸钠、哌嗪ニ酮衍生物(例如，Technosphere)、磷酸I丐-PEG颗粒以及寡糖衍生物DPPG (例如，Solidose)。包裹可以例如利用水/油单乳化方法、水_油-水双乳化方法或冷冻干燥来完成。几种商业包裹技术是可用的(例如，ProLease ,Alkerme)。微球的释放速率可以通过聚合物的类型、聚合物分子量、共聚物组成、加入微球制剂的赋形剂和微球大小来调节。由亲水聚合物如胶原、纤维蛋白和藻酸盐组成的聚合水凝胶也可以用于加入的包含CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGF β抑制剂、Ρ38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂)的组合物或制剂的缓释(參见例如，Sakiyama et al. (2001)FASEB J. 15，1300-1302)。加入水凝胶的生物分子可以直接从基质或在释放后刺激细胞功能。毫米至厘米级别的三维聚合植入物可以装载包含CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGF0抑制剂、P38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂)的组合物或制剂(參见例如，Teng etal (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99，3024-3029)。这些聚合植入物可以为细胞粘附提供结构功能，同时还提供生物分子的控释。聚合植入物通常提供生物活性因子的较大储库。所述植入物还可以制备在结构支持物中，调整施用的几何形状(例如，形状、大小、孔隙度)(例如，符合创伤或颅缝)。用于生物分子递送的三维聚合植入物可以本领域已知的各种方法配制，包括但不限于乳化方法、溶剂浇铸和ニ氧化碳发泡方法(參见例如，Whittleseyand Shea(2004)Experimental Neurologyl90, 1-16)。各种大小和递送曲线的基于可植入的基质的递送系统也可商购(例如，Innovative Research of America, Sarasota, FL)。作为释放的替代选择，包含CCN2/CTGF或纤维化抑制剂(例如，TGFβ抑制剂、Ρ38抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂)的组合物或制剂可以固定在聚合递送系统之上或其中。这种方法包括底物介导的递送和固相递送。通常，聚合底物的功能是支持细胞粘附并将生物分子货物直接放置在细胞微环境中(參见例如，Whittlesey and Shea(2004)ExperimentalNeurology 190, 1-16) 底物介导的递送可以用来递送非病毒和病毒载体。这种方法对于病毒载体特别优选，因为其模拟有多少这样的载体与胞外基质关联来作为促进细胞结合和内化的方法。例如