专利名称：一种羟基酪醇的制备方法许多疾病的发展都牵涉到大量的饮食脂肪。动脉粥样硬化、冠心 病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌以及结肠癌等疾病各自都与饮食脂肪 有关，然而，证据表明某些癌症的病原学中重要的不仅是饮食脂肪的 数量，还包括饮食脂肪的类型。橄榄油是地中海饮食的主要油脂成分，与冠心病和某些癌症的较 低发病率有关， 一些实验显示，橄榄油酚类油橄榄苦苷和其它同族物 质的水解能够产生具有强抗癌活性的小酚类组分，特别地油橄榄酚类羟基酪醇能防止低密度脂蛋白(LDL)氧化、血小板凝集并抑制5-和 12-脂肪氧合酶；此外，我们已经发现羟基酪醇对过亚硝酸盐决定的 DNA碱基修饰和酪氨酸硝化反应产生抑制作用，而且它能够在各种人 类细胞系统中解除自由活性氧类引起的细胞毒性；最后，研究显示， 羟基酪醇消化后在人体内剂量依赖性的吸收，显示出其生物利用率。羟基酪醇具有消炎作用，扩张血管和抗菌作用，能够防止动脉粥 样硬化，能降低某些癌症(如乳腺、前列腺、子宫内膜、消化道)的 发病率；由于羟基酪醇具有很强的抗氧化活性和降低癌症发病率的作 用，因此具有巨大的医疗作用前景。(三)
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种以对羟基苯乙醇为 原料，生物合成羟基酪醇的制备方法。 本发明是通过如下技术方案实现的一种结构如式(I )所示的羟基酪醇的制备方法，其特征在于 包括如下步骤(1) 以溶解在pH值为2 7.5的缓冲液中结构如式(II)所示的 对羟基苯乙醇为原料，加入结构如式(III)所示的抗坏血酸，在多酚 氧化酶的催化下与氧反应，得到含有羟基酪醇(I )的反应液；
(2) 将反应液通过截留分子量为200Da 1000Da的纳滤膜，分离 反应物中大分子成分；
(3) 将反应液通过苯乙烯类树脂或聚酰胺层析柱，用纯化水洗 脱，收集含羟基酪醇的洗脱液；
(4) 将洗脱液浓縮，用乙酸乙酯萃取，将萃取的乙酸乙酯相脱 水，浓縮回收乙酸乙酯，得到淡黄色膏状的羟基酪醇粗品；
(5) 使羟基酪醇粗品经柱层析，采用洗脱剂洗脱，收集含羟基 酪醇部分，回收溶剂后得高纯度羟基酪醇(I )产品。
OH
OH HO
0 J
I II
本发明的反应原理如下所示
OH
对羟基苯Z0
HO OH ，讽血酸
本发明所述的制备方法，步骤(1)中，所述多酚氧化酶为非固 定酶或固定化酶。非固定酶是指通过向反应原料内添加的方式进行催化剂的加入；固定化酶是指用物理的或化学的方法使酶与水不溶性 大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中 制成的，如表面担载、交联、包埋等；酶固定化后一般稳定性增 加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。在本 发明中优选使用固定化酶。
多酚氧化酶是一种蛋白体，在物质的加工过程中参与一系列 由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂；多酚氧 化酶主要来源于土壤微生物、植物根系分泌物及动植物残体分解 释放的酶，它是一种复合性酶；多酚氧化酶主要来源于土豆、苹 果、香蕉、菌菇等。
步骤(1)中，对羟基苯乙醇的浓度为10mg/L~1000mg/L，优选 50 200mg/L ; 抗坏血酸的浓度为 10mg/L 1000mg/L ， 优选 100mg/L 500mg/L;缓冲液的pH优选4 7;步骤(2)中，纳滤膜的 截留分子量优选200Da 500Da。
步骤(3)中层析柱采用的洗脱液为纯化水， 一般是采用蒸馏法、 离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的水，不含任何附加剂。
步骤(4)中，将洗脱液浓縮10倍，用等体积的乙酸乙酯萃取3 5 次，浓縮回收乙酸乙酯得到羟基酪醇粗品。
步骤(5)中，柱层析所用的吸附剂为硅胶或中性氧化铝；洗脱 剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、醋酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、 石油醚、汽油中的一种或几种的混合液；最终羟基酪醇产品为无色透 明粘稠状物质。
本发明中采用的柱层析方法为吸附柱层析，它以固体吸附剂为固 定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱，用于吸附反应液中的杂 质，对反应液进行洗脱；本发明中还涉及一种聚酰胺层析柱，聚酰胺 对极性物质的吸附作用在于它能和被分离物之间形成氢键，这种氢键 的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
本发明以对羟基苯乙醇为原料，以多酚氧化酶为催化剂，在氧的 参与下，发生氧化反应，并通过抗坏血酸抑制多酚氧化酶双酚活性，控制反应进程，得到富含羟基酪醇的反应液，然后再经过膜分离、大 孔吸附树脂吸附分离、萃取、柱层析，得到高纯度的羟基酪醇产品。
本发明具有原料易得、操作连续化、环境友好、产物易纯化、收 率高等优点，适用于工业化生产。
实施例1:
称取2. 5kg对羟基苯乙醇，溶于100kg 0. 1M pH二6. 5磷酸盐缓冲 液中，加入5kg抗坏血酸，加入酶液1L (比活500U/mg)，于5(TC搅 拌反应60分钟，反应液通过纳滤膜，透析液通过苯乙烯类树脂柱(约 100kg树脂)，用水洗至流出液用TLC检测无羟基酪醇斑点，此水洗液 浓縮至50kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液浓縮回收溶剂， 得2.5kg淡黄色粘稠物，羟基酪醇含量88. 3%。
实施例2:
取纯化的多酚氧化酶液包埋在壳聚糖中用戊二醛交联成形，测定其 活力50U/mg;取5kg对羟基苯乙醇溶于2000L 0. 05mol/L磷酸盐缓冲 液(pH值6.5)，加入10kg抗环酸，搅拌溶解，加入lkg固定化酶， 于5(TC搅拌反应60分钟，得到的反应也用离心法回收固定化多酚氧 化酶，将反应液通过纳滤膜，透析液通过苯乙烯类树脂柱(约200kg 树脂)，用水洗至流出液用TLC检测无羟基酪醇斑点，此水洗液浓縮 至100kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液浓縮回收溶剂， 得4kg淡黄色粘稠物，羟基酪醇含量91.2%。
实施例3:
取纯化的多酚氧化酶液包埋在海藻酸盐中用无水丁稀二酸-乙烯交 联成形，测定其活力35U/mg;取5kg对羟基苯乙醇溶于2000L 0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值6.5)，加入10kg抗环酸，搅拌溶解， 加入1.5kg固定化酶，于50。C搅拌反应60分钟，得到的反应也用离 心法回收固定化多酚氧化酶，将反应液通过纳滤膜，透析液通过苯乙 烯类树脂柱(约200kg树脂)，用水洗至流出液用TLC检测无羟基酪 醇斑点，此水洗液浓縮至100kg，用100kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液浓縮回收溶剂，得4.2kg淡黄色粘稠物，羟基酪醇含量87.6%。 实施例4:
取纯化的多酚氧化酶液包埋在壳聚糖中用戊二醛交联成形，测定 其活力50U/mg;取2kg固定化酶珠于装入夹套玻璃柱中(① 20*2000cm)，夹套用50。C热水循环；取10kg对羟基苯乙醇溶于3000L 0. 05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值6. 5)，加入20kg抗环酸，该反应液 以10L/min的流速通过酶柱，并连续通过苯乙烯类树脂柱(约400kg 树脂)，反应液流完后加入100L0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH值6.5) 冲洗酶柱，完成后将酶柱接口与树脂柱接口分离，树脂柱继续用纯化 水冲洗至流出液用TLC检测无羟基酪醇斑点，此水洗液浓縮至200kg， 用200kg乙酸乙酯萃取5次，乙酸乙酯液浓縮回收溶剂，得8. 5kg淡 黄色粘稠物，羟基酪醇含量92.4%。
实施例5:
取实施例4中羟基酪醇粗品lkg，硅胶吸附后，用乙酸乙酯石 油醚(1 : 1)洗脱，收集含羟基酪醇部分，回收溶剂，得950g粉色 透明粘稠物，羟基酪醇95.7%。
实施例6:
取实施例4中羟基酪醇粗品lkg，硅胶吸附后，用氯仿甲醇(8 : 2)洗脱，收集含羟基酪醇部分，回收溶剂，得908g无色透明粘稠物， 羟基酪醇含量98. 6%。
实施例7:
取实施例4中羟基酪醇粗品lkg，氧化铝吸附后，甲醇洗脱，收 集含羟基酪醇部分，回收溶剂，得920g无色透明粘稠物，羟基酪醇 含量98. 2%。


本发明属于生物工程技术领域，特别公开了一种羟基酪醇的制备方法。该方法特征是以对羟基苯乙醇为原料，以多酚氧化酶为催化剂，在氧的参与下，发生氧化反应，并通过抗坏血酸抑制多酚氧化酶双酚活性，控制反应进程，得到富含羟基酪醇的反应液，然后再经过膜分离、大孔吸附树脂吸附分离、萃取、柱层析，得到高纯度的羟基酪醇产品。本发明具有原料易得、操作连续化、环境友好、产物易纯化、收率高等优点，适用于工业化生产。