专利名称：一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法弧菌作为水产养殖中一种常见的条件性致病菌，每年都带来较大的危害。条件致病菌又称为机会致病菌，在某种特定条件下可致病的细菌，称为条件致病菌。在机体内条件致病菌的集聚部位改变、机体抵抗力降低或菌群失调时则可致病。在水体内水质条件恶化， 水体条件性致病菌浓度增加，养殖动物免疫功能降低，均可以导致疾病。因此利用弧菌噬菌体降低水体宿主菌体浓度，就成为水产经济动物病害生物防控的新技术。海水弧菌包括很多种，主要分为5群副溶血性弧菌，溶藻性弧菌 (V. alginolyticus)，伤口弧菌(V. vulnificus)，梅契尼柯夫弧菌(V. Mechnikov) (CDC 肠群 16)，F群弧菌(⑶C EF-6)。这5群嗜盐性弧菌生活于海水和海洋鱼、蟹、贝壳和甲壳类动物中，通常引起胃肠道感染，也可引起肠道外感染。每一种弧菌有多种菌株，而每一菌株对应有噬菌体，噬菌体对非宿主菌株，裂解效率低或没有，不同区域的菌株的噬菌体也不具备相互裂解性。因此对特定地区，特定菌群需要分离特定噬菌体。目前，利用分子生物学手段， 噬菌体裂解酶分离手段等并不能为广大的养殖业服务。在养殖环境中，噬菌体或游离病毒普遍存在，但是各种噬菌体或游离病毒以不同方式混杂存在，我们采集的水样量少，涉及的范围小，增加了分离特定噬菌体的难度。大多数情况是找到宿主而不能分离到噬菌体，能够分离到噬菌体的几率为0.1-洲。从已有的研究可知，海洋滩涂弧菌的噬菌体在动物肠道有大量保留，其次为排污口。暴露的环境，宿主弧菌及其噬菌体易于产生、爆发，并迅速消失，而环境动物体内，如贝类可以长期保留，这为我们分离特定宿主菌的噬菌体奠定了基础。一个区域，如果长期有一种菌株存在，其噬菌体将逐渐增加数量，但是往往局限于小范围。由弧菌病原菌的流行病学可知，长期的积累，增加了分离到噬菌体的这种机率。本发明设计养殖场所保留宿主菌与噬菌体的专用池，并利用养殖区贝类长期保留宿主，并及时更替保留宿主，控制宿主菌浓度和贝类浓度，减少保留贝类疾病，对于积累宿主菌及其噬菌体有重要意义。进一步分析将提出，保留的宿主菌还是当年当时的病原菌，还是当前产生的宿主菌？由于养殖池和养殖场所保留宿主菌与噬菌体的专用池，其海水和养殖动物来源一致，只是后者随时间变化，有部分更替，所以两者的菌株将有很大程度的一致性。养殖水体浮游藻类浓度和生长周期，对同一生态系统的菌群种类、数量，通过占据生态位产生重要影响。因此，维护菌群的生存、发展又不能让其繁殖到高浓度，对保留菌株的动物产生病害，就必须有效调节水体藻类的数量、种类以及生长状况。在动物和人体实验的研究证明，噬菌体进入动物或人体以后在4 或数天内被全部清除，同时噬菌体生物防治认为在感染病原体后必须立即使用相应的噬菌体，延迟使用则无效或低效。必须在“有效时机”或提前用药问题使养殖现场使用噬菌体生物防治的可操作性极差，极大地限制噬菌体的应用。因此保持环境中一些致病弧菌的噬菌体浓度，具有一定意义。贝类和甲壳类属于无脊椎动物，在其免疫系统中没有发现特异性抗体免疫机制， 这导致它们对体内异物有不同的反应。从我们的实践工作看，噬菌体可以在对虾体内持续存活2个月或更长时间，而在贝类，也发现可以越冬存在的噬菌体。在人类，研究者制作了长循环噬菌体，使其在体内存活时间延长，超过48h，(C R Merri 1, B Biswas, R Carlton, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 April 16; 93(8) : 3188 - 3192)我们的研究证实，从已感染噬菌体的贝类甲壳类体内分离噬菌体，在宿主同时存在的条件下，在已经实验的近2年的时间内，可以长期存活。这些事实，建立了本发明的基础。比较以下专利申请号201010271452. 5取污水样品制备耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体；专利2005100189 . 5取 IL医院污水用PEG-8000沉淀，离心分离浓缩而得超广谱b-内酰胺酶大肠杆菌的噬菌体； 专利申请号02257415. 8公开一种水中f2噬菌体浓集分离装置，利用滤膜过滤原理从水中分离f2噬菌体(表示水体受污染的情况)；专利申请号201010271452. 5耐药绿脓杆菌宽噬噬菌体的制备方法，取污水样品制备裂解液；申请号02257415. 8利用一种水中过滤分离装置浓集分离f2噬菌体，这些噬菌体富集分离方法，与本发明方法于海区或养殖现场建立养育体系，以贝类和桡足类作为保留宿主，长期地累积性地得到致病弧菌及其噬菌体的富集库，这种方式与所有已知富集分离噬菌体的方法技术是不同的，是特有的。利用噬菌体抑制水产动物宿主病原菌，已经有多个专利。专利200710078116. 7利用多种噬菌体处理净化环境病原菌，其中包括霍乱弧菌，副溶血弧菌；专利200910038392. X分离副溶血弧菌噬菌体并用以杀菌，用于水体环境，包括养殖环境；专利申请号 201110050243. 2分离哈维氏弧菌，利用分离得到的病原菌进行噬菌体的分离，防治刺参腐皮综合症。本发明专利针对特定海区或养殖场的致病弧菌，包括可以在特定环境中致病的全部弧菌致病菌，因此属于养殖环境下的适用技术，适合于所建立的特定环境种群，但其技术也适用于大多数养殖环境。已有的实验证实，投放噬菌体，将有效地把宿主菌在水体浓度限制在1 lOXlOMcfu/mL。就绝大多数弧菌而言，水体浓度1 10 X 102cfu/mL是不能导致水产经济动物疾病，此时即使经济动物体内有少量弧菌，也被进入体内噬菌体抑制，而进入体内噬菌体，对于无脊椎动物是无害的。而弧菌作为一种正常菌群，低浓度对水体发挥水体调节作用，是有一定益处的。
本发明的目的是提供一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法，具体涉及一种富集和利用噬菌体在海水养殖中生物防制宿主菌控制宿主弧菌的方法。为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是一种富集和利用噬菌体在海水养殖中生物防制宿主菌控制宿主弧菌的方法，适用于广东、广西、海南地区海水对虾、东风螺养殖区，特别是养殖多年的海区或养殖场，并有多次发生弧菌病的病史，养殖区面积不小于100亩，具体方法如下(1)按不同季节从养殖区的养殖池、进排水渠和海区的水体、养殖动物和其他底栖动物体内、浮游动物勻浆液，采用TCBS弧菌培养基分离弧菌。部分致病菌利用分离培养的弧菌菌株培养液投喂养殖经济动物(对虾东风螺等)，观察摄食，摄食减少明显者，并同时利用麦康凯培养基鉴定致病性，均为阳性者，保存于4°C，菌株备用，与该海区或养殖场致病相关的重要菌株按常规方法制备鉴别血清，分离的弧菌菌株在春夏季5-6月不少于100-250株 /100亩，秋冬季9-10月不少于80-150株/100亩；(2)在养殖区内或一角建设5-15m2，1-1.5m深的水泥质或地膜或泥质小池，池底加入海沙，约2-3cm，再加入新鲜过滤海水(养殖水源水)，并保持水位不低于0.8 lm。小池的排水渠低于小池，使排出的水不回流。排水渠中设置多层过滤，再挂袋，内装含氯消毒剂，消毒 l-2d后才排放，使排出水的病原基本上被消灭，不污染养殖区和海域。按照50-100亩，设置此种小池10-15个；(3)小池水体中保持异养菌、弧菌、浮游植物的浓度适度，通过换水，适量投放低浓度大蒜素等抑菌物质，保持异养菌冬夏季浓度在1 9 X 102_7mL范围，春秋季在1 9X 103—4/ mL范围，弧菌冬夏季浓度在1 5X102_3/mL范围，春秋季在1 5X103_4/mL范围。适度投放生物肥和少量鱼粉、豆粉，培养浮游植物和浮游动物，并保持在中等偏下水平浮游植物冬夏季1 5 X 102_7mL左右，春秋季1 5 X IO3^VmL,浮游动物冬夏季1 5 X IO1^VmL,春秋季1 5X 102_3/mL左右；采集养殖区域内的健康植食性小型鱼类、贝类和小型甲壳动物， 洁净海水暂养1周，其中消毒2次，清除携带弧菌；(4)分离保存备用的弧菌菌株投放水体，菌液终浓度为1 2X107_8cfU/mL，浸泡养殖区域内的植食性小型鱼类、贝类和小型甲壳动物，时间为lh，然后投放于权利要求3的小池，投放密度植食性小型鱼类每平米约1尾；未小型贝类每平米不超过10只；大型贝类 不超过2-3只；浮游动物100-300只/m3，常规换水、培藻、适度增氧，监测水质指标；
(5)小池通过换水，适量投放低浓度大蒜素等抑菌物质，保持水体弧菌冬夏季浓度在 1 5 X 102_3/mL范围，春秋季在1 5 X 103_4/mL范围，控制浮游生物不超过所示指标，长期养殖；每周检查小池中贝类和桡足类动物，对其中发病不摄食的贝类动物，及时清理，在水体中浮游动物桡足类急剧减少时，及时更换水体，培养浮游藻类；
(6)每半年采集海区和虾池健康贝类以及浮游动物，消毒清洗后，替换50%量的小池动物，保持小池底栖生物和浮游动物基本数量不变，并长年保持小池浮游生物、底栖贝类和植食性小型鱼类生存数量，作为病原弧菌和噬菌体富集库；
(7)每年3-6月或者7-11月采集小池浮游生物、底栖贝类和水样分离弧菌和噬菌体。 采集小池水样、浮游生物勻浆液、对虾或其他底栖贝类内脏或肠道内容物勻浆液，离心， 0. 22mm膜滤，滤液中加入适量的500目沸石吸附，备用；
弧菌菌株加入蛋白胨水中，培养4-6h，加入沸石，观察6-8h，取变清亮的培养瓶，以双平板法分离和纯化其噬菌体，再利用宿主弧菌培养液，扩大噬菌体数量，达到或超过101° IO11PfVmL ；
(8)按照步骤(1)分离弧菌菌株的数量要求，步骤(7)分离的噬菌体株不低于60 100 株/年；
(9)利用步骤(7)分离出的噬菌体，对步骤(5)的小池的弧菌菌株鉴别，凡有噬菌体菌株，在小池没有相应宿主弧菌菌株，再向池中投放该菌株；
(10)步骤(7)的噬菌体投放适量海水中，终浓度为IXlO6 IXlO7pfu/mL，投放步骤 (5)的小池底栖动物，浸泡1- ；
(11)步骤(10)的步骤反复多次，浸泡间隔时间为15-30d，直到可以在池中动物体内利用噬菌体技术分离到噬菌体株；
(12)步骤(7)的多株噬菌体，分别按照100 IOOOmL/亩，投放于养殖水体；
(13)监测各种宿主菌及其噬菌体在养殖水体中的浓度变化，在某一种宿主菌浓度高于 IO3 104cfu/mL，或其噬菌体浓度低于lOYfu/mL，可以再次按照步骤(12)投放噬菌体液体；
(14)养殖池的养殖茬交替，季节交替时，养殖池放干，重新进水时，采集已经有噬菌体存在的养殖池的浮游动物，在检测无病菌和病毒病原的前提下，投放到转季(茬)的池塘水体，能够有效防止弧菌病产生。本发明的有益效果是本方法依据养殖区和海区的弧菌菌株和噬菌体之间在生态和进化上与环境共存的事实，在特定区域设立宿主菌以及噬菌体的长期培养池，可以不断富集、分离该区域特定病原菌宿主的裂解性噬菌体，经过扩增后，再投放于该区域，可以在短时间内控制养殖水体致病菌的增殖，也可以长期抑制该水体病原菌的浓度，起到生态防御的效果。在养殖海水水体利用噬菌体防治病原菌引起的疾病，有高效、生态安全、简易持久的特点。

在湛江腾飞实业有限公司的东海岛庵里430亩搭建冬棚的地膜式高密度对虾养殖场。 在2009年，2010年完成冬棚对虾养殖。在2009年建设30m2，1. 5m深的水泥质小池四个，位于四角，加入新鲜过滤海水(养殖水源水)，并保持水位不低于lm。排水渠中设置多层过滤， 再挂袋，内装含氯消毒剂，消毒l-2d后才排放；
每池投放在同一海区长成的近江牡蛎四吊，每吊约10个近江牡蛎，投放前经过新鲜海水浸泡48h。通过换水、氨基酸肥、少量鱼粉和大豆粉控制浮游藻类不高于1 5X 103/mL， 浮游动物不高于2 X IO2/ mL，弧菌浓度不高于5 X 103/mL。每月检查近江牡蛎和桡足类的生长状况，保证其正常；
从2009年3月开始，收集发病虾塘的浮游动物，按照约10-50个/mL投入小池，同时分离发病虾塘的弧菌菌株，并在排污口、海区的水体与动物样品中分离噬菌体，共分离 153株弧菌，5株噬菌体，分离的弧菌菌株按照终浓度2-5X IO2AiL投入池中，噬菌体按照 2-5X IO3AiL投入池中。每日抽取海区海水按照1/5-1/2交换量进入池中；
2009年9-10月，在发病虾池分离78株弧菌菌株，利用小池水体，牡蛎体腔液的0. 45mm 膜滤液体，分离弧菌噬菌体，找到23株噬菌体。23株噬菌体扩增后，以每株噬菌体终浓度 1 X IOVmL投入发病虾池和其他正常虾池，分析表明，随着养殖时间延长(25d后)，发病虾池和其他正常虾池噬菌体有效控制弧菌增长，养殖水体弧菌浓度低于2 X 103cfu/mL，有效控制对虾弧菌病。整个养殖场发病率减少47% ；
在2010年6月养殖的第65d，投放新分离噬菌体12株，每株噬菌体终浓度1 X 109/mL， 随着部分噬菌体浓度在水体增加，弧菌数量大幅度下降，对对虾疾病有效控制。整个养殖场发病率减少43% ；
在整个养殖过程，不使用抗生素药物，通过使用芽孢杆菌、噬菌体、腐植酸钠、硫酸氢钾、应激Vc，板蓝根、大蒜素控制水质变化。特别在水温出现较大变幅时，拌料投喂维生素 C、金银花和板蓝根制剂，以提高对虾的抗应激能力。
实施例2
地膜虾池养殖东风螺
改建东海岛庵里一级提水25 口养虾池150亩，作为地膜虾池养殖东风螺池场地。对池塘大小改造，池壁和池底铺设地膜；供水和排水系统改造，并增加增氧设施，使其成为养殖东风螺系统。地膜虾池铺设5cm IOcm的砂。不要太细的沙，也不要太粗的砂，可用10 目、30目的筛绢网筛选后，取中间大小的砂均勻铺设在池底。水深为60cm 100cm。备有 1台 2台功率为1. 5kff的水车式增氧机；
在2010年建设30m2，1. 5m深的水泥质小池2个，位于排水口附近，加入新鲜过滤海水 (养殖水源水)，并保持水位不低于lm。排水渠中设置多层过滤，再挂袋，内装含氯消毒剂，消毒l-2d后才排放；
2010年9-10月，在发病虾池分离65株弧菌菌株，利用小池水体，牡蛎体腔液的0. 45mm 膜滤液体，分离弧菌噬菌体，找到12株噬菌体。12株噬菌体扩增后，以每株噬菌体终浓度 1 X IOVmL投入发病螺池和其他正常螺池，分析表明，随着养殖时间延长(25d后)，发病螺池和其他正常螺池噬菌体有效控制弧菌增长，养殖水体弧菌浓度低于2 X 103cfu/mL，有效控制东风螺弧菌病。整个养殖场发病率减少50% ；
在2011年6月，投放新分离噬菌体16株，每株噬菌体终浓度1 X IOVmL,随着部分噬菌体浓度在水体增加，弧菌数量大幅度下降，对东风螺疾病有效控制。整个养殖场发病率减少 56%。


本发明涉及一种富集弧菌噬菌体与生物防制宿主菌的方法，由于噬菌体的裂解特异性，特定环境和一定状态下的特定宿主菌株的噬菌体不易获得；本方法依据养殖区和海区的弧菌菌株和噬菌体之间在生态和进化上与环境共存的事实，在特定区域设立宿主菌以及噬菌体的长期培养池，可以不断富集、分离该区域特定病原菌宿主的裂解性噬菌体，经过扩增后，再投放于该区域，可以在短时间内控制养殖水体致病菌的增殖，也可以长期抑制该水体病原菌的浓度，起到生态防御的效果。在养殖海水水体利用噬菌体防治病原菌引起的疾病，有高效、生态安全、简易持久的特点。