专利名称：一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用的制作方法金黄色葡萄球菌是食品中容易污染的一种革兰氏阳性病原菌，尤其是即食食品、 冷鲜食品中，它也是医院中极易污染的病原菌。目前，在食品、饲料、医疗等领域中使用的抑制金黄色葡萄球菌的抗菌试剂主要有抗生素和化学防腐剂两类，但由于抗生素的过度使用，已有越来越多的金黄色葡萄球菌对抗生素产生了耐药性，甚至出现了多重耐药性菌株以及万古霉素抗性菌株，且抗生素残留后不易被快速降解。化学防腐剂则难以被人体分解， 积累到一定量后可能具有潜在的毒副作用，因此存在安全性隐患。于是需要寻找可替代的、 安全的抑菌试剂。目前已被发现的可被降解的抑菌试剂主要有溶菌酶、抗菌肽、乳铁蛋白、中草药提取物、特异性噬菌体等。溶菌酶虽然对部分细菌有良好的杀灭效果，但对多数金黄色葡萄菌菌株的抑制效果却很低。噬菌体近年来被认定为安全的抗菌性试剂，其杀菌效果优良、特异性高，允许在食品、医药、饲料等体系中添加使用。噬菌体可以吸附在金黄色葡萄球菌细胞壁表面的特定受体上，进入细胞内部后可以大量增殖，并通过释放出裂解酶而使噬菌体的子代颗粒从宿主中释放出来。而在这个过程中作为噬菌体的宿主菌则被杀死，从而起到控制病原菌金黄色葡萄球菌的目的。噬菌体是一种安全的、特异性高、抑菌效果特别好的抑菌剂。
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种金黄色葡萄球菌的噬菌体及其应用。本发明可以有效控制食品体系中的金黄色葡萄球菌污染，相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有特异性高、无残留和安全的特点。本发明的技术方案如下一种金黄色葡萄球菌的噬菌体，保藏号为CCTCC M 2011409，该噬菌体对金黄色葡萄球菌具有有效的裂解作用。该噬菌体保存条件为噬菌体培养液过滤除菌后于4°C下可以保存2个月以上，于-70°C下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为 IO11 pfu/mL。金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用将噬菌体培养液直接喷涂于固体食品的表面， 或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。噬菌体在含菌料中的添加量为 0.000广100 pfu/cfu。本发明有益的技术效果在于申请人从食品加工厂的污水中通过大量筛选，分离到一株能特异性抑制金黄色葡萄球菌的噬菌体JS01，并对其裂解性能和对食品体系中金黄色葡萄球菌的控制作用进行了大量3的研究工作，在此基础上提供了一种利用此噬菌体快速、有效抑制金黄色葡萄球菌的方法。本抑菌剂仅包含专一性金黄色葡萄球菌噬菌体JSOl。噬菌体随食品摄入人体后， 可以被消化道内的酶类降解，并吸收、再利用，不会对人体产生任何毒副作用。当噬菌体以0.0002 2 pfu/cfu的添加量添加到金黄色葡萄球菌溶液中，可使金黄色葡萄球菌的数量降低4. 8^7. 7个数量级，对其它细菌则没有影响；当以MOI (Μ0Ι,即噬菌体与金黄色葡萄球菌的含量比pfu/cfu)为1的添加量添加到染菌食品中，在1天内可将金黄色葡萄球菌的数量降低4. 5^6. 0个数量级，抑菌效果优异。
图1为噬菌体JSOl对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制进程；
图2为不同添加量的噬菌体JSOl对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制效果； 图3为噬菌体JSOl对牛奶中病原菌的控制效果； 图4为噬菌体JSOl对热狗中病原菌的控制效果。

噬菌体JSOl是从食品加工厂的污水中分离到的。其分离、增殖过程如下 (1)首先配制所需培养基LB液体培养基IL水中加入IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg NaCl ；2XLB液体培养基IL水中加入20g蛋白胨、IOg酵母粉、20g NaCl ；底层培养基LB 液体培养基中加入1. 5%琼脂粉；上层培养基LB液体培养基中加入0. 7%琼脂粉；
(2 )将金黄色葡萄球菌ATCC25923 (来自于美国典型培养物保藏中心ATCC)接种到LB 液体培养基中，37°C震荡培养10 h，得到金黄色葡萄球菌培养液。(3)将污水用0. 22 μ m滤膜过滤除菌后，与2XLB液体培养基等体积混合，转入金黄色葡萄球菌培养液中，37°C震荡培养10 h，增殖噬菌体；
(4)将上述增殖液用0.22 μ m滤膜过滤除菌后，取ImL过滤液与100 L培养至对数期的金黄色葡萄球菌悬浮液(IO7 cfu/mL)和3mL保温于45°C的上层培养基混勻后，快速倒入含底层培养基的平板上铺勻，37°C培养M h，筛选透明圈；
(5)挑取单个透明圈到金黄色葡萄球菌培养液中，37°C震荡培养10h，增殖噬菌体；
(6)将上述增殖液用0.22 μ m滤膜过滤除菌后，梯度稀释，每个梯度分别取ImL梯度稀释的增殖液，与100 L培养至对数期的金黄色葡萄球菌悬浮液(IO7 cfu/mL)和3mL保温于 45°C的上层培养基混勻后，快速倒入含底层培养基的平板上铺勻，37°C培养M h，得到噬菌斑；
(7)挑取形态相同的、独立的噬菌斑到金黄色葡萄球菌培养液中，37°C震荡培养10h，培养分离到的噬菌体；
(8)将以上培养液移入无菌离心管中，6000r/min离心30min，取上清液。将0.5mL上清液与ImL培养至对数期的金黄色葡萄球菌培养液和5mL LB液体培养基混合，37°C培养12h，增殖噬菌体；
(9)按上一个步骤继续增殖噬菌体1次以后，培养液中的噬菌体就可以达到IO9 pfu/ mL以上，将此增殖液经0. 22 μ m滤膜过滤除菌后，就得到噬菌体溶液，可以直接保存于4°C， 也可以将0. 8mL噬菌体液与0. 4mL SM液和0. 4mL甘油混合后保存于_72°C。SM液的配制 NaCl 5. 8g, MgSO4 · 7H20 2g, lmol/L, ρΗ7· 5 Tris-HCl 50 mL，2% 明胶 5mL，加水至 1000 mL0 0. IMPa 高温灭菌 20 min。实施例2 噬菌体JSOl对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑制进程
接种金黄色葡萄球菌ATCC25923至5mL的LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养过夜，以2%的比例接种至50mL的LB液体培养基中，37°C、200rpm下培养至OD600nm为1. 2，即培养液中的菌浓为5 X IO8 cfu/mL时，加入含有IO8 pfu/mL的噬菌体溶液lmL，作用6小时， 培养液的OD600nm降低到了 0. 152，同时活菌数降至4. 3X IO4 cfu/mL,结果见图1所示；
对比试验不加噬菌体JS01，培养液一直在37°C、200rpm下培养，OD6tltlnm上升至4. 414， 同时活菌数达到3. 8X IO9 cfu/mL。实施例2与对比试验相比，在噬菌体作用6小时时，活菌数降低5. 0 log units，而在噬菌体作用3小时时，活菌数则降低了 6. 1 log units。实施例3 噬菌体JSOl在不同浓度下对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌效果接种金黄色葡萄球菌ATCC25923至5mL的LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养过
夜，以1%的比例接种至50mL的LB液体培养基中，37°C、200rpm下培养至培养液中的菌液为 IXlO8 cfu/mL 时，各加入 OUO1UO2, IO3, IO4, IO5, IO6, IO7, IO8, IO9, IO10 pfu 的噬菌体 JS01， 裂解Ih后，测定液体中的活菌数。结果当噬菌体JSOl的添加量在IO6-IOiq pfu时，即MOI 在0.0002 2时，金黄色葡萄球菌得到有效抑制，活菌数降低4.纩7. 7 log units。结果见图 2所示。实施例4 噬菌体JSOl对牛奶中病原菌的控制效果
对于液态食品牛奶，取3mL加入到IOmL的灭过菌的试管中，加入IO9 cfu/mL的金黄色葡萄球菌溶液0. ImL,然后加入IO9 pfu/mL噬菌体JSOl溶液0. ImL,放置到4°C下，每2天测一次液体里面的活菌数，对比实验中以0. ImL无菌水代替0. ImL噬菌体溶液；
实验结果表明噬菌体JSOl作用于牛奶1天后，活菌数降至2X IO2 cfu/mL，随后的几天活菌数会不断增加上升至1. 5X IO7 cfu/mL ；而对比实验中活菌数则维持在0. 5^3. 2X IO8 cfu/mL，噬菌体JSOl对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制率最高可以达到6.0 log units，结果见图3所示。实施例5 噬菌体JSOl对热狗中病原菌的控制效果
对于固态食品热狗，用小刀切碎成小块，称取Ig到IOmL的灭过菌的试管中，然后加入3mL灭过菌的蒸馏水，以及IO9 cfu/mL的金黄色葡萄球菌溶液0. lmL，最后加入IO9 pfu/ mL噬菌体JSOl溶液0. lmL，放置到4°C下，每2天测一次液体里面的活菌数，对比实验中以 0. ImL无菌水代替0. ImL噬菌体溶液。实验结果表明噬菌体JSOl作用于热狗1天后，活菌数降至9. IXlO3 cfu/mL ；而对比实验中活菌数则维持在0. 7 5. 4X IO8 cfu/mL,噬菌体JSOl对热狗中金黄色葡萄球菌的抑制率最高可以达到4. 5 log units,结果见图4所示。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。


一种金黄色葡萄球菌的噬菌体，保藏号为CCTCC M2011409，该噬菌体对金黄色葡萄球菌具有有效的裂解作用；该噬菌体保存条件为噬菌体培养液过滤除菌后于4℃下可以保存2个月以上，于-70℃下保存于甘油管中可以保存2年以上；所述噬菌体培养液储液浓度为1011pfu/mL；金黄色葡萄球菌的噬菌体的应用将噬菌体培养液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的金黄色葡萄球菌。噬菌体在含菌料中的添加量为0.0001~100pfu/cfu。本发明可以有效控制食品体系中的金黄色葡萄球菌污染，相对于抗生素和化学防腐剂而言，具有特异性高、无残留和安全的特点。