一株松鼠葡萄球菌、疫苗及其制备方法【技术领域】[0001 ] 本发明属生物【技术领域】，具体涉及到一株松鼠葡萄球菌iStaphylococcussciuri)的分离、鉴定，以及该菌在松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗研制中的应用。[0002]近年来，葡萄球菌(ste/成Fhcocci)已经成为医院感染和社区获得性感染的重要病原菌，国家细菌耐药性监测中心2002年度的研究发现，G+菌(革兰阳性菌)导致的菌血症所占比例为51.1%，葡萄球菌菌血症就占了 37%，其中凝固酶阴性葡萄球菌(coagulasenegative staphylococci，CNS)占比例为57.21%,金黄色葡萄球菌占比例为15.28%,血液标本分离的耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌(methici 11 in-resistant coaguIasenegative staphylococci, MRCNS)占凝固酶阴性葡萄球菌的74.7%,凝固酶阴性葡萄球菌的感染愈来愈突出，并且常常为耐药菌，成为临床治疗的难点，应加强相关研究。[0003]孟华容收集成都市新都区人民医院2001~2003年484株凝固酶阴性葡萄球菌进行种的鉴定和11种抗生素的耐药性分析，发现在484株葡萄球菌中占前4位的是表皮葡萄球菌165株，木糖葡萄球菌122株，华纳氏葡萄球菌78株和松鼠葡萄球菌48株，这些菌对万古霉素、利复平、呋喃妥因敏感，对氨苄青霉素、红霉素等耐药率达80%以上。[0004]嵇若旭、朱晓东、狄华、单炯从2000年4月到2004年2月，对在上海交通大学医学院附属新华医院住院治疗的小儿进行细菌学检查，同时对发现的相关菌株进行抗生素敏感性检测，对所获得的 阳性结果作比较分析。他们在8220次细菌学检测中共发现1320株阳性细菌，其中202株CNS，占总体检出率的15.3%(202/1320)，CNS中以溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、模仿葡萄球菌为主要的前5位致病菌。这些阳性菌株中苯唑西林耐药CNS占86.63%,所有菌株对万古霉素保持敏感。结论:CNS感染已经成为儿科临床医疗工作中的重要问题之一，其中苯唑西林耐药CNS菌株呈多重耐药；针对CNS感染，需要在细菌学检查的基础上合理使用抗生素，万古霉素依然是最后的治疗手段。[0005]耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant5taphylococci,MRS)目前已经成为院内感染的主要病原菌，并逐渐扩展到社区。当前，耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)在医疗机构和社区的蔓延已产生十分严重的医疗危机，严重威胁着人类的健康。[0006]松鼠葡萄球菌在1976年第一次被Kloos和他的同事发现。松鼠葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci, CNS),广泛存在于自然界中，同时是人类一个重要的病原，主要引起人类的心内膜炎、腹膜炎、败血症、尿道感染、盆腔炎症以及手术中的伤口感染等。[0007]国内赵卿等1995年自I例脑膜炎患儿的脑脊液和血液中同时分离到松鼠葡萄球菌。李立2012年对中国医科大学北京市顺义医院收治的105例新生儿败血症的临床特点及诊疗等方面进行回顾性分析.105例新生儿败血症血培养阳性率100%，分别是表皮葡萄球菌58例(55.24% )，溶血葡萄球菌28例(26.67% )，松鼠葡萄球菌6例(5.7% )，金黄色葡萄球菌5例(4.76% )，人葡萄球菌人亚种及华纳氏葡萄球菌各2例(各1.9% )，B群无乳链球菌、耳葡萄球菌、粪肠球菌、母鸡肠球菌各I例(各0.9% )。105例中以葡萄球菌为主，共102例，占97.1%。李廷军、董彦金、邱婷婷2013年报道了松鼠葡萄球菌引起败血症I例。唐颖2008年报道了松鼠葡萄球菌型烫伤样皮肤综合征I例。
[0008]陈世西等从患有渗出性皮炎的猪心包液中分离到一株高致病性松鼠葡萄球菌。张曦、杨增歧、宋长绪将病猪分离获得的4株松鼠葡萄球菌进行动物回归试验，发现接种了该菌的猪表现为精神沉郁，食欲下降，全身出现薄的、灰棕色的片状渗出物，随后陆续死亡，说明松鼠葡萄球菌对人和动物都有较大的危害。
[0009]随着抗菌药物在动物和人群中的大量使用，葡萄球菌的耐药也越来越严重，耐药松鼠葡萄球菌菌株的出现也越来越多，耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，如青霉素类、四环素类、氨基糖甙类、磺胺类等药物在畜禽中已大量产生抗药性，临床效果越来越差。随着兽用抗菌药物应用范围和种类的日益扩大，细菌耐药性的产生已经呈现激增趋势，将来很可能出现对主要抗生素耐药的“超级细菌”。


[0010]本发明的首要目的是提供一株松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306,该菌株对BALB/c小鼠和仔猪都有致病性。
[0011]本发明的另一目的在于提供松鼠葡萄球菌灭活疫苗，可以对免疫动物提供良好的保护力，避免了抗生素的滥用，以防“超级细菌”出现。
[0012]本发明的再一目的在于提供松鼠葡萄球菌灭活疫苗的制备方法，该方法简单，成本低。
[0013]本发明的目的采用下述技术方案实现。
[0014]本发明提供松鼠葡萄球菌sciari)NJ1306,保藏号为CCTCC NO:M 2013702。
[0015]本发明还提供松鼠葡萄球菌灭活疫苗，含有灭活的所述松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJl 306。
[0016]在本发明中，所述松鼠葡萄球菌灭活疫苗为油乳剂。
[0017]在本发明中，所述松鼠葡萄球菌灭活疫苗的佐剂为MONTANIDE ISA 760 VG。
[0018]本发明还提供松鼠葡萄球菌灭活疫苗的制备方法，包含以下步骤:
(I)将所述松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306的培养液,采用甲醒灭活，得到灭活的松鼠葡萄球菌培养液。
[0019](2)将灭活的松鼠葡萄球菌培养液和佐剂混合均匀，得到松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗。
[0020]优选的技术方案中，步骤(1)中所述甲醛的加入量为松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306 培养液体积的 0.4-0.6%。
[0021]在本发明中，步骤(1)中所述松鼠葡萄球菌sciari) NJ1306培养液的制备方法如下:将松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306接种于THB液体培养基，36-38 °C培养20-28h，得到所述培养液。
[0022]优选的技术方案中，步骤(1)中所述采用甲醛灭活的条件为在36_38°C条件下灭活45-50h。优选的技术方案中，步骤(2)中所述的佐剂为MONTANIDE ISA 760 VG。[0023]本发明经过聚合酶链式反应、生化试验、革兰氏染色、形态学观察证实所分离的葡萄球菌为松鼠葡萄球菌，命名该菌为松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJ1306。
[0024]经过BALB/c小鼠、新西兰兔、长白仔猪的动物实验:BALB/c小鼠6只，腹腔注射
2X IO9 CFU/只，24h内死亡5只，48h内死亡I只；2公斤新西兰兔3只，耳静脉注射5 X IO9CFU/只，存活；5日龄长白仔猪2头，肌肉注射IXIOki CFU/头，2头都发病(皮肤形成灰褐色形状不整的红斑和结痂)，皮肤与血液都培养出相同的细菌。证实该菌对BALB/c小鼠和仔猪都有致病性。
[0025]将该菌制备成松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗，免疫5只7周龄BALB/c小鼠，
0.2mL/只，免疫14天后，用该菌24h培养的活菌攻毒，2X IO9CFU/只，4只存活，I只死亡。未免疫对照5只用相同剂量攻毒全部死亡。BALB/c小鼠免疫对比的重复试验:取12只7周龄BALB/c小鼠，随机选取6只作为油乳剂疫苗组，剩余的小鼠作为对照组。油乳剂疫苗组小鼠免疫松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗，0.2mL/只；对照组不免疫。免疫14天后，用该菌24h培养的活菌对两组小鼠进行攻毒，2 X IO9CFU/只。油乳剂疫苗组的6只BALB/c小鼠存活，对照组中的6只小鼠全部死亡。上述结果说明松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗对BALB/c小鼠能够提供良好的免疫力，通过免疫对比试验，证明该菌具有良好的免疫原性。
[0026]有益效果
I)本发明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri ) NJ1306对BALB/c小鼠和仔猪都有致病性。
[0027]2)本发明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306米用PCR鉴定为耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococci，MRS),含 mecA 基因，此基因编码青霉素结合蛋白2a(PBP2a)与β _内酰胺类抗生素亲和力较低，因此对这类抗生素不敏感，，使其表现出耐药性。
[0028]3)米用本发明松鼠葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs sciari)NJ1306 和 MONTANIDE ISA760 VG制成的灭活油乳剂疫苗，免疫后攻毒，可以对BALB/c小鼠提供很好的保护力，说明本发明松鼠葡萄球菌iStaphylococcus sciuri ) NJ1306具有良好的免疫原性,可以作为疫苗用菌株。采用本发明疫苗可以预防感染松鼠葡萄球菌，避免了抗生素的滥用，以防出现“超级细菌”。
[0029]4)本发明首次提供了一种免疫效果较好的松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗。该松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗的制备方法简单，成本低。试验证明该疫苗有免疫保护作用，可以用于动物预防。目前针对松鼠葡萄球菌病，尚无理想的适合动物和人群的疫苗，所以预防松鼠葡萄球菌病，不仅仅是对动物的保护，更是对人的保障。因此，本发明所述的松鼠葡萄球菌灭活油乳剂疫苗的市场前景广阔。



[0030]图1是PCR检测葡萄球菌属特异性16S rRNA (Staph 16S rRNA)、杀白细胞素基因(PVL)及耐药基因Qneck)的电泳图，其中泳道M为Marker ;泳道I为葡萄球菌属特异16SrRNA、PVL和基因的多重PCR扩增产物，泳道2为葡萄球菌属特异性16S rRNA的PCR扩增产物，泳道3为杀白细胞素基因(PVL)的PCR扩增产物，泳道4为耐药基因ipwck)的PCR扩增产物。[0031]图 2 PCR 检测 23S rDNA、Exh-A, Exh-B, Exh-C, Exh-D 基因的电泳图，其中泳道M: Marker ;泳道I为23S rDNA扩增产物；泳道2-5分别为脱皮毒A、B、C、D的扩增产物，23S rDNA的产物为此PCR的阳性对照，此基因的成功扩增证实所提取的基因组质量和含量均没有问题。
[0032]图3是菌株的革兰氏染色后的显微镜照片。
[0033]图4是本发明菌株对长白仔猪致病力试验的图片。
[0034]图5显示了感染不同剂量松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )NJ1306的小鼠存活情况。
[0035]图6显示了 BALB/c小鼠免疫对比实验中各组小鼠攻毒后存活率随时间的变化。
[0036]图7显示了 BALB/c小鼠免疫对比的重复试验中各组小鼠攻毒后存活率随时间的变化。

[0037]材料:
PCR Mix:广州东盛生物科技有限公司；
DNA胶回收试剂盒:Axygen公司；
葡萄球菌 属TH-16S细菌生化编码鉴定管:杭州天和微生物试剂有限公司；
Bacto? Todd Hewitt Broth (THB)培养基:BD 公司；
THB液体培养基:称取30g THB培养基，用去离子水溶解后定容至1000mL，121°C高压灭菌20分钟；
THB固体培养基:每1000mL THB液体培养基中加入15g琼脂粉，121°C高压灭菌20分钟，适量倾入平皿中凝固；
商品油乳佐剂MONTANIDE ISA 760 VG:法国SEPPIC公司。
[0038]实施例1松鼠葡萄球菌(5?<3/成r/ococciAs sciuri ) NJ1306的分离和鉴定 从江苏省南京市某猪场采集发病仔猪皮肤结痂样品和心包积液，分离到了松鼠葡萄球
菌{Staphylococcus sciuri ) NJl 306。
[0039](I)增菌培养:
将发病仔猪皮肤结痂样品和心包积液，放入5mL THB液体培养基，37°C静置培养16~18h，收获培养物，备用。
[0040](2)细菌的纯培养:
将步骤(1)中所述培养物采用划线法接种至THB固体培养基，37°C静置培养24h，挑取单菌落接种THB液体培养基，37°C静置培养24h，得到单菌的增殖菌液。
[0041](3)细菌的基因鉴定:
将步骤(2)所述增殖菌液进行离心，采用常规方法提取菌体的总DNA作为模板，以StaphF和StaphR为引物扩增16S rRNA基因片段，然后测序，序列如SEQ ID N0:1所示。
[0042]StaphF 的序列为:AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA ; StaphR 的序列为:CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC。
[0043]将测序结果与GenBank上的已知序列进行同源性比较，发现该菌与松鼠葡萄球菌DSM20345的核酸序列同源性达到99.6%，确定分离到的菌株为松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )，命名为松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJ1306。
[0044]以松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306的总DNA为模板，米用PCR鉴定其是否含杀白细胞基因(Panton-Valentine leukocidin, PVL)、耐药性mecA基因，结果如图1所示。以Luk-PVF和Luk-PVR为引物，没有扩增到PVL基因，说明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri) NJl306不含杀白细胞基因。以MecAF和MecAR为引物，扩增到了 310 bp 的 MecA 基因，说明松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sci uri ) NJ1306 含 mecA 基因，此基因编码的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)与β _内酰胺类抗生素亲和力较低，因此对这类抗生素不敏感，因此，松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri)NJ1306为耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistantMRS)。
[0045]从图2中，可以看出以松鼠葡萄球菌{Staphylococcus sciuri )NJ1306的总DNA为模板，可以扩增到662 bp的23S ri)NA (阳性对照)，但是不能扩增到脱皮毒素基因(Exh-A，Exh-Bj Exh-Cj Exh-D),说明松鼠葡萄球菌 iStaphylococcus sciuri) NJ1306 不含脱皮毒素基因(Exh-A，Exh-Bj Exh-Cj Exh-D)0
[0046]上述PCR中扩增各基因的引物及目的产物如表1和2所示。
[0047]表1 PCR检测葡萄球菌属特异性16S rRNA、杀白细胞素基因及耐药基因的引物序列