抗菌噬菌体、噬菌体肽及其使用方法[0001 ] 1.序列表[0002]本申请含有经由EFS-Web以ASCII形式提交并且在此通过引用整体合并的序列表。所述ASCII拷贝于2011年9月14日创建，命名为16395US1.txt且大小为3，295，858字节。[0003]2.相关申请[0004]本申请要求于2010年9月17日提交的美国临时申请号61/384，015的优先权，所述美国临时申请的内容在此通过引用整体合并。3.发明领域[0005]本发明涉及用于治疗和控制细菌感染的噬菌体疗法领域。特别地，本发明涉及新型噬菌体 F387/08、F391/08、F394/08、F488/08、F510/08、F44/10、F125/10，其分离的多肽，包含一种或多种新型细菌噬菌体和/或分离的多肽的组合物；和单独或与其他疗法例如抗生素或其他噬菌体疗法组合用于治疗和预防通过下述引起的细菌感染的方法:例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。[0006]4.背景[0007]细菌噬菌体(噬菌体)是特异性感染且裂解细菌的病毒。噬菌体疗法，使用完整噬菌体病毒用于治疗细菌性传染病的方法，在20世纪20年代通过Felix d’ Herelle引入。最初，噬菌体疗法得到强烈调查，并且进行众多研究以评估噬菌体疗法用于治疗人和动物中的细菌感染的潜力。早期成功促使多种商业噬菌体制剂的开发。例如，在1940年，Eli Lilly Company生产了用于人使用的7种噬菌体产品，包括用于治疗由葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)、大肠杆菌及其他致病菌引起的不同疾病的曬菌体制剂。这些制剂例如用于治疗引起脓肿的感染、化脓性伤口、阴道炎、急性慢性上呼吸道感染和乳突炎感染。
[0008]然而，随着抗生素在20世纪40年代的开发，对基于噬菌体的治疗的兴趣在西方世界下降。促成这种下降的最重要因素之一是缺乏标准化测试方案和生产方法。开发用于测试噬菌体疗法的工业广泛标准的失败干扰研究结果的文件证明，导致察觉到的功效缺乏以及关于噬菌体疗法价值的可靠性问题。进一步地，与噬菌体样品/样本生产相关的问题使最初研究和调查复杂化。多种稳定剂和防腐剂最初在增加噬菌体治疗的活性的尝试中使用。然而，因为噬菌体和多种稳定剂的生物学知之甚少，所以在延长噬菌体制剂活力的尝试中加入的许多成分证明对于人是毒性或负面影响长期贮存。在噬菌体生产中的另一个问题涉及噬菌体的商业制剂的纯度级别。当时，噬菌体疗法制剂一般由宿主细菌的原始裂解产物组成，所述宿主细菌已用目的噬菌体处理。因此，许多制剂含有目前公认为不需要的细菌组分例如内毒素的那种。相应地，不利事件通常与制剂相关，特别是在静脉内接受其的患者中。然而，在对于抗生素的接近受限的东部欧洲和前苏联，噬菌体疗法的开发和使用与抗生素共同继续或代替抗生素继续。
[0009]然而，随着许多细菌的抗生素抗性菌株的出现，在基于噬菌体的治疗中的兴趣在西方世界已回复。尽管已开发了新型种类的抗生素，但细菌最终将发展对于新药物的抗性的前景已加剧对用于控制、预防和治疗细菌感染的非化学治疗方法的寻找。存在关于在临床环境中使用噬菌体疗法的三个主要的基于噬菌体的策略:1)施用毒性噬菌体；2)使用由细菌噬菌体编码的内溶素或纯化的溶素，3)使用噬菌体的结构蛋白质作为关键细菌酶例如合成肽聚糖的酶的代谢抑制剂。
[0010]因此，需要开发新型细菌噬菌体和噬菌体产物作为用于在体内针对致病菌使用的潜在治疗和/或预防试剂。特别地，需要能够裂解医院细菌的细菌噬菌体，所述医院细菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌。因为迄今为止研究的大多数噬菌体和噬菌体肽显示出特异性针对它们由其分离的细菌物种(或亚种)的活性，所以新型基于噬菌体的疗法可以在医院背景中特别有用，选择性靶向医院病原体而不影响正常周围菌丛。
[0011] 5.发明概述
[0012]本发明涉及分离的细菌噬菌体且涉及细菌噬菌体起源的分离的抗菌多肽用于治疗、预防或管理与通过革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的感染相关的病状。特别地，本发明的分离的细菌噬菌体或多肽可以用于药物组合物中用于治疗、预防或管理通过医院病原体的感染，所述医院病原体例如革兰氏阴性菌包括但不限于肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌；和革兰氏阳性菌包括但不限于金黄色葡萄球菌。在特定实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗与通过细菌的抗生素抗性菌株的感染相关的病状，所述细菌的抗生素抗性菌株例如金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株(MRSA)。在特定实施方案中，本发明的分离的细菌噬菌体或多肽用于局部治疗有此需要的受试者中通过医院病原体的感染。在其他实施方案中，本发明的分离的细菌噬菌体或多肽用于诊断衍生自患者的样品(例如组织、血液、尿、唾液样品)中的传染源。在其他实施方案中，本发明的分离的细菌噬菌体或多肽用作用于固体表面制备的预防消毒剂或抗感染药，所述固体表面包括皮肤或其他表皮表面。
[0013]在特定实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F391/08，其具有包含SEQID N0:1(图15A-15III)的核酸序列的基因组并且显示出针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在其他实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F394/08，其具有包含SEQ ID NO:2(图16A-16Q)的核酸序列的基因组并且显示出针对鲍氏不动杆菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在另外其他实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F488/08，其具有包含SEQ ID NO:3 (图17A-17KKKK)的核酸序列的基因组并且显示出针对大肠杆菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在另外其他实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F510/08，其具有包含SEQ ID N0:4(图18A-18X)的核酸序列的基因组并且显示出针对铜绿假单胞菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在另外再进一步实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F44/10，其具有包含SEQ ID NO:560(图19A-19UUU)的核酸序列的基因组并且显示出针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在另外再进一步实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F387/08，其具有包含SEQ ID NO:781(图20A-20KKKK)的核酸序列的基因组并且显示出针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株的抗菌活性。在另外再进一步实施方案中，本发明提供了分离的细菌噬菌体，F125/10，其具有包含SEQ ID NO:1074(图21A-21ZZZ)的核酸序列的基因组并且显示出针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗菌活性。
[0014]本发明还包含由本发明的一种或多种细菌噬菌体感染的分离的细菌。在特定实施方案中，本发明提供了由细菌噬菌体感染的分离的肺炎克雷伯氏菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由SEQ ID NO:1的核酸序列组成的基因组。在其他实施方案中，本发明提供了由细菌噬菌体感染的分离的鲍氏不动杆菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或由SEQ ID NO:2的核酸序列组成的基因组。在另外其他实施方案中，本发明提供了由细菌噬菌体感染的分离的大肠杆菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQID NO:3的核酸序列或由SEQ ID NO:3的核酸序列组成的基因组。在另外其他实施方案中，本发明提供了由一种或多种细菌噬菌体感染的分离的铜绿假单胞菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或由SEQ ID NO:4的核酸序列组成的基因组。在再另外其他实施方案中，本发明提供了由一种或多种细菌噬菌体感染的分离的金黄色葡萄球菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:560的核酸序列或由SEQ ID NO:560的核酸序列组成的基因组。在另外再进一步实施方案中，本发明提供了由一种或多种细菌噬菌体感染的分离的肺炎克雷伯氏菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:781的核酸序列或由SEQ ID NO:781的核酸序列组成的基因组。在另外再进一步实施方案中，本发明提供了由一种或多种细菌噬菌体感染的分离的金黄色葡萄球菌，所述细菌噬菌体具有包含SEQ ID NO:1074的核酸序列或由SEQ ID NO:1074的核酸序列组成的基因组。
[0015]本发明包含从细菌噬菌体F387/08、F391/08、F394/08、F488/08、F510/08、F44/10和/或F125/10中分离的多肽，所述多肽显示出针对革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的一个或多个物种或菌株的抗菌活性，例如肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌。在特定实施方案中，由F387/08和F3910/08分离或衍生的本发明的多肽显示出针对至少肺炎克雷伯氏菌的抗菌或抗微生物活性，例如裂解杀死活性；由F394/08分离或衍生的那些显示出针对至少鲍氏不动杆菌的抗菌或抗微生物活性；由F488/08分离或衍生的那些显示出针对至少大肠杆菌的抗菌或抗微生物活性；由F510/08分离或衍生的那些显示出针对至少铜绿假单胞菌的抗菌或抗微生物活性；由F44/10和F125/10分离或衍生的那些显示出针对至少金黄色葡萄球菌的抗菌或抗微生物活性。
[0016]在特定实施方案中，本发明的多肽包含分离的溶素或其片段(例如CHAP结构域)或由分离的溶素或其片段(例如CHAP结构域)组成，所述分离的溶素或其片段显示出针对细菌的一个或多个物种或菌株的抗菌活性，所述细菌例如革兰氏阳性菌例如金黄色葡萄球菌和/或革兰氏阴性菌例如肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌。在特定实施方案中，本发明的多肽是包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成的分离的溶素蛋白质，例如内溶素或尾溶素:SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:192、SEQ ID NO: 282、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ IDN0:1216、或SEQ ID NO`: 1261.所述溶素蛋白质的预测功能包括例如Ig样病毒粒子蛋白质(SEQ ID NO:20)、细胞壁水解酶(SEQ ID NO:80)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(SEQID NO:192)、可溶性溶菌酶(SEQ ID NO:282)、T4 样溶菌酶(SEQ ID NO:547)、内溶素(SEQID NO:556)、λ Rzl 样蛋白质(SEQ ID NO:557)、内溶素(SEQ ID NO:598)、内溶素(SEQ IDNO:1216)、和尾溶素(SEQ ID NO:1261)。
[0017]在其他实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ ID N0:1216、或SEQ ID NO: 1261的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株的抗菌活性或抗微生物活性，例如裂解杀死活性。在依照这个实施方案的特定例子中，SEQ ID N0:20和/或SEQ ID NO:80的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株，例如针对具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由SEQ ID NO:1的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体的抗菌或抗微生物活性(例如裂解杀死活性)。在依照这个实施方案的其他例子中，SEQ ID NO:192的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对鲍氏不动杆菌的一种或多种菌株，例如针对具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或由SEQ ID NO:2的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体的抗菌或抗微生物活性(例如裂解杀死活性)。在依照这个实施方案的其他例子中，SEQ ID NO:282的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对大肠杆菌的一种或多种菌株，例如针对具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或由SEQ ID NO:3的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体的抗菌或抗微生物活性 (例如裂解杀死活性)。在依照这个实施方案的其他例子中，SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:556和/或SEQ ID NO:557的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对铜绿假单胞菌的一种或多种菌株，例如针对具有包含SEQ ID NO:4的核酸序列或由SEQID NO:4的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体的抗菌或抗微生物活性(例如裂解杀死活性)。在依照这个实施方案的其他例子中，SEQ ID NO:598,SEQ ID NO: 1216和/或SEQ IDNO:1261的氨基酸序列的变体、片段或衍生物显示出针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株，例如针对具有包含SEQ ID NO:560或SEQ ID NO: 1074的核酸序列或由SEQ ID NO:560或SEQ ID NO:1074的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体的抗菌或抗微生物活性(例如裂解杀死活性)。
[0018]在特定实施方案中，本发明的分离的多肽包含下述的CHAP结构域或由下述的CHAP 结构域组成:SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:282, SEQ IDNO:547, SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、或 SEQ ID NO:598。在再另外其他实施方案中，本发明的多肽包含 SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 192,SEQ ID NO:282、SEQ IDNO:547,SEQ ID NO:556、SEQ ID N0:557、或 SEQ ID NO:598 的 CHAP 结构域的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物具有针对肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的至少一种或多种菌株的抗菌活性或抗微生物活性，例如裂解杀死活性。
[0019]在其他实施方案中，本发明的多肽包含下述或由下述组成:分离的尾蛋白质(例如尾组分、尾丝蛋白质、尾长卷尺蛋白质、吸附相关尾蛋白质、主要尾蛋白质、主要尾鞘蛋白质、基片楔突亚单位)或其片段，具有与它由其衍生的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的至少一个或多个物种或菌株。
[0020]在特定实施方案中，本发明的多肽是包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成的分离尾蛋白质:SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ IDNOs:32-35,SEQ ID NO:180、SEQ ID NO: 183,SEQ ID NO:185、SEQ ID NO: 190,SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249,SEQ ID N0:252、SEQ ID NO:254,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496、SEQ IDNO:544, SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686,SEQ ID NO:789、SEQ ID NOs:796-800,SEQ ID N0:806、SEQ ID NO:854,SEQ ID NOs:999-1004、SEQ ID NOs: 1053-1060、SEQ ID NO:1077, SEQ ID NO:1217, SEQ ID NO:1250,或SEQ ID NO:1266 o在其他实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NOs: 32-35、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185,SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ IDNOs:239-245, SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254、SEQ IDNOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496,SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:549、SEQID NO:551、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:789、SEQ ID NOs:796-800, SEQID NO:806, SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004, SEQ ID NOs: 1053-1060、SEQ ID NO:1077、SEQ ID NO:1217, SEQ ID N0:1250、或 SEQ ID NO: 1266 的片段、变体或衍生物，其中所述片段、变体或衍生物显示出与它由其衍生的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株。
[0021] 所述尾蛋白质的预测功能包括例如受体结合尾蛋白质(SEQ ID NO:15)、主要尾蛋白质(SEQ ID N0:26和SEQ ID NO:1077)、次要尾蛋白质(SEQ ID NO:27)、成孔尾尖蛋白质(SEQ ID NO:30)、尾蛋白质(SEQ ID NOs:32-33)、次要尾蛋白质(SEQ ID NO:34)、噬菌体尾蛋白质(SEQ ID N0:35)、尾鞘蛋白质(SEQ ID NO:180)、尾卷尺蛋白质(SEQ ID NO:183)、尾蛋白质(SEQ ID NO:185)、尾丝蛋白质(SEQ ID NO:190)、尾管蛋白质(SEQ ID NO:231)、尾鞘单体(SEQ ID NO:232)、尾鞘稳定剂和完全蛋白质(SEQ ID NO:235)、短尾丝(SEQ IDNO:239)、基片楔突完全尾 钉(SEQ ID NOs:240-241)、基片楔突完全尾丝插座(tail fibersocket) (SEQ ID NO:242)、基片楔突亚单位(SEQ ID NO:243)、基片楔突起始子(SEQ IDNO:244)、基片楔突(SEQ ID NO:245)、基片插孔亚单位和尾溶菌酶、细胞穿透装置(SEQ IDNO:248)、基片楔突完全(SEQ ID NO:249)、尾完全和鞘稳定蛋白质(SEQ ID NO:252)、伴侣蛋白长和短尾丝装配(SEQ ID NO:254)、尾丝蛋白质(SEQ ID NO:433)、尾丝蛋白质(SEQID NO:434)、铰链连接物长尾丝(SEQ ID NO:435)、尾丝铰链(SEQ ID NO:436)、近端尾丝亚单位(SEQ ID NO:437)、基片尾管起始子(SEQ ID NO:489)、基片(SEQ ID NO:490)、基片插孔亚单位、尾长决定子(SEQ ID NO:491)、基片远端插孔亚单位(SEQ ID NO:492)、基片插孔亚单位(SEQ ID NO:493)、基片插孔装配催化剂(SEQ ID NO:494)、基片插孔亚单位(SEQID NO:495)、基片楔突亚单位(SEQ ID NO:496)、尾管蛋白质(SEQ ID NOs =544-545)、尾丝蛋白质(SEQ ID NO:549 和 SEQ ID NO:551)、主要尾鞘蛋白质(SEQ ID NO:629 和 SEQ IDNO:1250)、主要尾蛋白质(SEQ ID NO:686)、尾管蛋白质(SEQ ID NO:789)、fibritin(SEQID NO:796)、短尾丝(SEQ ID NO:797)、基片楔突完全尾钉(SEQ ID NO:798)、基片楔突亚单位和尾钉(SEQ ID NO:799)、基片楔突尾丝连接物(SEQ ID NO:800)、基片插孔亚单位和溶菌酶(SEQ ID NO:806)、溶菌酶(SEQ ID NO:854)、噬菌体穿孔素(hoi in) (SEQ ID NO:999和SEQ ID NO: 1217)、远端长尾丝装配催化剂(SEQ ID NO:1000)、L形尾丝蛋白质(SEQID NO:1001)、长尾丝远端连接物的铰链连接物(SEQ ID NO:1002)、长尾丝近端连接物的铰链连接物(SEQ ID NO:1003)、长尾丝近端亚单位(SEQ ID NO:1004)、基片尾管起始子(SEQID NO:1053)、基片尾管帽(tail tube cap) (SEQ ID NO:1054)、基片插孔亚单位、尾长决定子(SEQ ID NO:1055)、基片远端插孔亚单位(SEQ ID NO: 1056)、基片插孔亚单位(SEQ IDNOs:1057和1059)、基片插孔装配催化剂(SEQ ID NO:1058)、基片楔突亚单位(SEQ ID NO:1060)、和基片蛋白质(SEQ ID NO:1266)。
[0022]在特定实施方案中，本发明包含SEQID NO: 15,SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID N0:30、或SEQ ID NOs:32-35的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:1或由核酸序列SEQ ID NO:1组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗 菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株。在其他实施方案中，本发明包含SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:183、SEQ IDN0:185、或SEQ ID NO:190的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:2或由核酸序列SEQ ID NO:2组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对鲍氏不动杆菌的一种或多种菌株。
[0023]在特定实施方案中，本发明包含SEQID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245, SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254、SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489_495、或 SEQ ID NO:496 的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:3或由核酸序列SEQ ID NO:3组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对大肠杆菌的一种或多种菌株。在特定实施方案中，本发明包含SEQ ID NO:544,SEQ ID NO:545, SEQ ID N0:549、或SEQ ID NO:551的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:4或由核酸序列SEQ ID NO:4组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对铜绿假单胞菌的一种或多种菌株。在另外其他实施方案中，本发明包含SEQ ID NO:629或SEQ ID NO:686的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ IDNO:560或由核酸序列SEQ ID NO:560组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株。在另外其他实施方案中，本发明包含SEQ ID NO:789, SEQ ID NOs:796-800、SEQ IDNO:806, SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999_1004、或 SEQ ID NOs:1053-1060 的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:781或由核酸序列SEQ IDNO:781组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对肺炎克雷伯氏菌的一种或多种菌株。在另外其他实施方案中，本发明包含 SEQ ID NO:1077,SEQ ID N0:1217、SEQ ID N0:1250、或 SEQ ID NO:1266 的氨基酸序列的变体、片段或衍生物，其显示出与具有包含核酸序列SEQ ID NO:1074或由核酸序列SEQ ID NO:1074组成的基因组的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述功能针对金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株。
[0024]在特定实施方案中，本发明提供了分离的多肽，其显示出针对细菌的一种或多种菌株的抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，所述细菌例如革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(例如肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌)或未分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌，其中所述分离的多肽具有与相同长度(即由相同数目的残基组成)的第二种氨基酸序列具有至少60%、65 %、70%、75 %、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大序列同一性的氨基酸序列，所述第二种氨基酸序列是SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NOs:32-35, SEQ ID NO:80, SEQ IDNO:180, SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232,SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249,SEQ ID N0:252、SEQ ID NO:254,SEQ ID NO:282,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496,SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:556,SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686、SEQ IDNO:789, SEQ IDNOs:796-800, SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004,SEQ ID NOs:1053-1060, SEQ ID NO:1077、SEQ ID NO:1216、SEQ ID NO: 1217、SEQ IDNO: 1250、SEQ ID NO: 1261、SEQ ID NO: 1266 和 / 或其片段。
[0025]本发明进一步提供了包含下述中的任何氨基酸序列或由下述中的任何氨基酸序列组成的分离的多肽:SEQ ID NOs:5-176,SEQ ID NOs:177-223,SEQ ID NOs:224-506、SEQID NOs:507-559,SEQ ID NOs:561-780,SEQ ID NOs:782_1073、和SEQ ID NOs: 1075-1300。在其他实施方案中，提供了与治疗剂(例如异源多肽或小分子)重组融合或化学缀合(例如共价或非共价缀合)的本发明的分离的多肽。
[0026] 本发明还包含编码本发明的多肽的多核苷酸。在特定实施方案中，本发明提供了包含编码 SEQ ID NOs:5-176, SEQ ID NOs:177-223, SEQ ID NOs:224-506, SEQ ID NOs:507-559、SEQ ID NOs:561-780, SEQ ID NOs:782_1073、和 SEQ ID NOs:1075-1300 中的任何多肽的核酸序列的分离核酸。在其他实施方案中，本发明提供了包含编码下述中的任何多肽，或其活性片段、变体或衍生物的核酸序列的分离核酸:SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NOs:32-35, SEQ ID NO:80, SEQ IDNO:180, SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232,SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249,SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254,SEQ ID NO:282,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:55KSEQ ID NO:556,SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686、SEQID NO:789,SEQ ID NOs:796-800,SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004,SEQ ID NOs:1053-1060,SEQ ID NO:1077,SEQ ID NO:1216,SEQ ID NO:1217,SEQ ID NO:1250、SEQ ID N0:1261、或SEQ ID NO:1266，所述多肽或活性片段、变体或衍生物显示出与它由其分离和/或衍生的细菌噬菌体相关的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)。本发明还涉及包含所述核酸中的一种或多种的载体。在一个特定实施方案中，所述载体是表达载体。本发明进一步提供了含有载体的宿主细胞，所述载体包含一种或多种编码本发明的多肽的一种或多种多核苷酸。
[0027]本发明包含用于生产特别用于在药物组合物即抗微生物组合物中使用的本发明的多肽或其活性片段的方法。例如，本发明的多肽可以直接从细胞培养(例如细菌细胞培养)中分离，所述细胞培养由细菌噬菌体F387/08、F391/08、F394/08、F488/08、F510/08、F44/10和/或F125/10感染。备选地，本发明的多肽可以使用表达载体通过重组方法衍生，所述表达载体包含编码本发明的多肽的核酸序列，例如SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 20, SEQID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:30,SEQ ID NOs:32-35,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:180,SEQ ID NO: 183,SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO:231、SEQID NO:232, SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245, SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQID NO:252,SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:282,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496,SEQ ID NO:544,SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:551、SEQ IDNO:556, SEQ ID NO:557、、SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:789,SEQ ID NOs:796-800、SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004,SEQ IDNOs:1053-1060, SEQ ID NO:1077, SEQ ID NO:1216, SEQ ID NO:1217, SEQ ID NO:1250,SEQ ID N0:1261、或SEQ ID NO: 1266，或其活性片段、衍生物或变体。本发明的多肽或其片段可以通过本领域已知用于生产多肽的任何方法进行生产，特别是通过化学合成或通过重组表达技术。 [0028]在特定实施方案中，本发明涉及用于重组生产噬菌体蛋白质例如溶素蛋白质、尾蛋白质或其活性片段、变体或衍生物的方法，所述方法包括:(i)在适合于所述蛋白质在培养基中表达的条件下培养含有载体的宿主细胞，所述载体包含编码下述氨基酸序列的核酸序列:SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQID NOs:32-35, SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:185、SEQ IDNO:190, SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245、SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:282,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496,SEQ ID NO:544,SEQ ID NO:545,SEQ IDNO:547,SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629, SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:789、SEQ ID NOs:796-800, SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854, SEQ ID NOs:999_1004、或 SEQ ID NOs: 1053-1060、SEQ ID NO:1077, SEQID NO:1216, SEQ ID N0:1217、SEQ ID NO:1250, SEQ ID N0:1261、或 SEQ ID N0:1266，或其片段；和(ii)从所述培养基中回收所述蛋白质。在特定实施方案中，编码本发明的多肽的核酸序列与异源启动子可操作地连接。
[0029]本发明还包含用于诊断细菌感染的临床表现中的成因剂的方法。通过确定样品中的细菌对本发明的细菌噬菌体和/或多肽的敏感性，本发明的分离的细菌噬菌体或多肽可以用于帮助测定患者样品中的细菌物种。此类方法进一步包括估计本发明的分离的细菌噬菌体和/或多肽的抗菌活性的方法。本发明的细菌噬菌体或多肽的抗菌活性，或未知样品对于此类活性的敏感性，可以通过本领域已知和/或本文描述的任何方法进行评估。在特定实施方案中，抗菌活性和/或敏感性通过下述进行评估:根据标准技术(例如在液体培养中或在琼脂平板上)培养已知细菌和/或患者组织、血液、流体或拭子样品，使培养物与本发明的细菌噬菌体和/或多肽接触且监控在所述接触后的细胞生长。例如，在液体培养中，细菌(例如肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌)可以生长至代表在培养物的指数生长中点的光密度(“0D”)；使培养物暴露于本发明的一种或多种细菌噬菌体和/或多肽的一个或多个浓度，并且OD相对于对照培养物进行监控。相对于对照培养物减少的OD代表显示出针对测试样品或培养物中的细菌物种和/或菌株的抗菌活性(例如显示出裂解杀死活性)的细菌噬菌体和/或多肽。类似地，可以允许细菌菌落在琼脂平板上形成，所述平板暴露于本发明的细菌噬菌体或多肽，并且相对于对照平板估计菌落的后续生长。菌落的大小减少或菌落的总数目减少指示细菌噬菌体和/或多肽具有针对测试样品和/或培养的物种或菌株的抗菌活性。
[0030]本发明还涉及包含细菌噬菌体或由细菌噬菌体组成的药物组合物，所述细菌噬菌体具有包含核酸序列 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:781、或 SEQ ID NO:1074 或由核酸序列 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:781、或 SEQ ID NO:1074 组成的基因组。在特定实施方案中，除了一种或多种其他细菌噬菌体外，本发明的药物组合物包含具有基因组的细菌噬菌体，所述基因组包含核酸序列SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:781、或 SEQ ID NO:1074 或由核酸序列 SEQ IDNO:U SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID N0:781、或SEQID NO:1074组成。一种或多种其他细菌噬菌体可以是本发明的一种或多种细菌噬菌体(例如具有包含 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560,SEQID NO:781、或 SEQ ID NO:1074 的核酸序列或由 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:781、或 SEQ ID NO:1074 的核酸序列组成的基因组)，其一种或多种菌株，或可以是除了具有根据SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2、SEQ IDN0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:560、SEQ ID N0:781、或 SEQ ID NO:1074 的基因组的细菌噬菌体外的本领域已知的一种或多种细菌噬菌体。进一步地,本发明的药物组合物中的一种或多种细菌噬菌体可以靶向细菌的相同或不同物种或菌株。在特定实施方案中，包含本发明的一种或多种细 菌噬菌体的药物组合物进一步包含本发明的一种或多种多肽和/或如本文描述或本领域已知的其他噬菌体产物。
[0031]在特定实施方案中，本发明提供了包含从细菌噬菌体中分离的多肽或其活性片段，特别是具有抗微生物和/或抗菌活性的那些的药物组合物，所述细菌噬菌体具有包含核酸序列 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQ IDNO:781 和 / 或 SEQ ID NO: 1074 或由核酸序列 SEQ ID NO:USEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:560、SEQ ID NO:781 和/或SEQ ID NO:1074组成的基因组。在特定实施方案中，本发明的药物组合物包含具有下述氨基酸序列的一种或多种多肽:SEQ IDNO: 15、SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO: 30,SEQ ID NOs:32-35,SEQ ID NO:80, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 190, SEQ IDNO:192, SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:235、SEQ ID NOs:239-245、SEQ IDNO:248, SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:252、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:282、SEQ ID NOs:433-437、SEQ ID NOs:489-496、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545、SEQ ID NO:547、SEQ IDNO:549,SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:556、SEQ ID NO:557、SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686, SEQ ID NO:789、SEQ ID NOs:796-800, SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004,SEQ ID NOs: 1053-1060,SEQ ID NO:1077、SEQ ID NO:1216,SEQ IDNO:1217,SEQ ID NO:1250,SEQ ID N0:1261、或 SEQ ID NO: 1266。在其他实施方案中，本发明的药物组合物包含这样的多肽，其为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27,SEQ ID NO:30、SEQ ID NOs:32-35、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO: 180,SEQ ID NO:183,SEQ ID NO: 185,SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQID NO:235, SEQ ID NOs:239-245, SEQ ID NO:248、SEQ ID NO:249、SEQ ID NO:252、SEQID NO:254,SEQ ID NO:282,SEQ ID NOs:433-437,SEQ ID NOs:489-496、SEQ ID NO:544、SEQ ID NO:545,SEQ ID NO:547、SEQ ID NO:549、SEQ ID NO:551、SEQ ID NO:556、SEQ IDNO:557, SEQ ID NO:598、SEQ ID NO:629、SEQ ID NO:686、SEQ ID NO:789、SEQ ID NOs:796-800,SEQ ID NO:806、SEQ ID NO:854、SEQ ID NOs:999-1004,SEQ ID NOs:1053-1060,SEQ ID NO:1077, SEQ ID NO:1216, SEQ ID NO:1217, SEQ ID NO:1250, SEQ ID NO:1261,或SEQ ID NO:1266的变体、衍生物或片段，其中所述变体、衍生物或片段保留它由其衍生的多肽的生物功能，例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解杀死活性)，优选针对肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的一种或多种菌株。
[0032]本发明的药物组合物可以另外包含药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂。在特定实施方案中，本发明的药物组合物是用于治疗、预防和/或改善有此需要的受试者中与通过细菌的感染相关的疾病或病症症状的抗菌组合物(因为它们显示出抗菌活性)或治疗组合物。在特定实施方案中，本发明的药物组合物是用于治疗、预防和/或改善与通过肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的感染相关的疾病或病症症状的抗菌组合物或治疗组合物。在特定实施方案中，接受本发明的药物组合物的受试者是哺乳动物(例如牛、绵羊、羊、马科、灵长类(例如人)、啮齿类、兔类动物或禽类(例如鸡、鸭、鹅))。
[0033]本发明提供了用于治疗或预防细菌感染的方法，其包括给有此需要的受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种细菌噬菌体或噬菌体产物(例如分离的细菌噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)，任选加上如本文描述的一种或多种其他细菌噬菌体或其他噬菌体产物。在本发明的背景中，“治疗”指治疗性处理和预防性或预防措施，其中目的是消除、减轻、减少病理状态或病症的严重性，减慢病理状态或病症的进展，或延迟或预防与病理状态或病症相关的症状或潜在原因(例如细菌感染)。本发明的药物组合物可以用于治疗或管理与任何细菌感染相关的感染，包括但不限于肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆`菌、铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌，以及在特定实施方案中，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、耳葡萄球菌(S.auricularis)、头葡萄球菌(S.capitis)、溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)、木糖葡萄球菌(S.xylosis)、藤黄微球菌(M.1uteus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、粪肠球菌(E.faecalis)、希拉肠球菌(E.hirae)、屎肠球菌(E.faecium)、鸟肠球菌(E.avium)及其组合。在特定实施方案中，药物组合物可以用于治疗与细菌感染相关的病状或病症，包括但不限于术后眼内炎(end ophtalmitis)、心内膜炎、中枢神经系统的感染、肺炎、骨髓炎(osteomylelitis)、伤口感染(例如糖尿病足溃疡)、乳腺炎、败血病、食物中毒、脑膜炎、皮肤感染、脓肿、中毒性休克综合征、菌血症和/或与医院细菌感染相关的其他病状。
[0034]在特定实施方案中，本发明提供了细菌噬菌体或分离的噬菌体产物(例如分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)作为单一试剂疗法的用途。在其他实施方案中，本发明提供了与用于细菌感染的标准或实验处理组合的细菌噬菌体或噬菌体产物(例如分离的噬菌体多肽或其活性片段、变体或衍生物)的用途。此类组合疗法可以增强标准或实验处理的功效。与本发明的细菌噬菌体和/或多肽组合特别有用的治疗剂的例子是抗炎剂、标准化学治疗抗生素试剂(例如青霉素、合成青霉素、杆菌肽素、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林(oxacilin)、氯唑西林、万古霉素、替考拉宁、克林霉素、复方新诺明、头孢菌素、多粘菌素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多酯钠、头孢唑林、头孢克肟、头孢美唑、头孢尼西(cefonioid)、头孢哌酮、头孢雷特、cefotanme、头孢噻厢、头孢替坦、头孢西丁、头孢泊月亏酯、头孢他唳、头孢唑厢、头孢曲松、头孢曲松(cefriaxone)拉氧头孢、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢菌素C、头孢菌素C钠盐、头孢菌素、头孢噻吩钠盐、头孢匹林、头孢拉定、头孢呋辛酯、头孢菌素二水化物、拉氧头孢、氯碳头孢mafate和螯合剂)、局部麻醉剂和/或皮质类固醇。在另外其他实施方案中，本发明的组合物可以与本领域已知的一种或多种细菌噬菌体或噬菌体产物组合。由本发明包含的组合疗法可以配制成单一药物组合物，或可以在分开组合物中但作为总体治疗方案的部分施用。
[0035]本发明的药物组合物可以通过本领域已知适合于施用抗菌化合物的任何方法进行施用，例如经由经口或肠胃外(例如吸入、肌内、静脉内或表皮)递送。在优选实施方案中，本发明的药物组合物例如在局部制剂中局部施用。本发明的组合物可以局部用于治疗和/或预防常见医院内感染，例如在手术切口部位处或与导管或引流相关的感染。在其他实施方案中，本发明的组合物用于治疗皮肤或上真皮层的细菌感染(例如足的糖尿病性溃疡或痈的感染)。
[0036]本发明的药物组合物还可以用于传统上的非治疗用途，例如在化妆品中的抗菌剂，或在用于在固体表面上使用的喷雾剂或溶液中以预防细菌的定殖(即，作为消毒剂)。
[0037]本发明还涉及用于就抗菌活性筛选肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括就抗菌活性筛选长度至少6、10、15、20或25个残基的邻接氨基酸序列，其由核酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:560、SEQID NO:781、或 SEQID NO: 1074的开放读码框编码，所述抗菌活性通过肽抑制例如琼脂或液体培养中的细菌生长的能力测量。`
[0038]5.1 定义
[0039]如本文使用的，术语“片段”指包含蛋白质氨基酸序列的至少5个邻接氨基酸残基、至少10个邻接氨基酸残基、至少15个邻接氨基酸残基、至少20个邻接氨基酸残基、至少25个邻接氨基酸残基、至少40个邻接氨基酸残基、至少50个邻接氨基酸残基、至少60个邻接氨基酸残基、至少70个邻接氨基酸残基、至少80个邻接氨基酸残基、至少90个邻接氨基酸残基、至少100个邻接氨基酸残基、至少125个邻接氨基酸残基、至少150个邻接氨基酸残基、至少175个邻接氨基酸残基、至少200个邻接氨基酸残基、或至少250个邻接氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。在特定实施方案中，该片段是功能片段，因为它保留它所分离自的蛋白质的至少一种功能(例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解细胞杀死))。
[0040]如本文使用的，术语“活性细菌噬菌体产物”和“细菌噬菌体产物”指从本发明的细菌噬菌体中分离的多肽或其片段、变体或衍生物，所述多肽或其片段、变体或衍生物显示出与它所分离或衍生自的细菌噬菌体相关的生物功能或活性(例如抗微生物或抗菌活性(例如裂解细胞杀死))。
[0041]如本文使用的，在肽、多肽或融合蛋白的背景中的术语“分离的”或指这样的肽、多肽或融合蛋白，其基本上不含来自它由其衍生的细胞或组织来源的细胞材料或污染蛋白质，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制品。语言“基本上不含细胞材料”包括肽、多肽或融合蛋白的制剂，其中肽、多肽或融合蛋白与它由其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞材料的肽、多肽或融合蛋白包括具有小于约30%、20%、10%或5% (按干重计)异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)的肽、多肽或融合蛋白制剂。当肽、多肽或融合蛋白重组产生时，它还优选基本上不含培养基，即培养基代表小于约20%、10%或5%体积的蛋白质制剂。当肽、多肽或融合蛋白通过化学合成产生时，它优选基本上不含化学前体或其他化学制品，即它与涉及肽、多肽或融合蛋白合成的化学前体或其他化学制品分离。相应地，肽、多肽、融合蛋白或抗体的此类制剂具有除了目的肽、多肽或融合蛋白外的小于约(按干重计)化学前体或化合物。
[0042]如本文使用的，在核酸分子的背景中的术语“分离的”指与第一种核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分尚的第一种核酸分子。此外，“分尚的”核酸分子例如cDNA分子当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制品，并且例如当它已与核酸文库中的其他克隆分离时，可以不含其他cDNA或其他 基因组DNA分子。
[0043]术语“纯化的”意指已通过任何纯化过程在浓度中可测量地增加的肽、多肽、融合蛋白或核酸分子，所述纯化过程包括但不限于柱色谱法、HPLC、沉淀、电泳等，从而部分、基本上、几乎完全或完全去除杂质，例如涉及制备肽、多肽或融合蛋白或核酸分子的前体或其他化学制品。本领域技术人员应当理解对于给定用途必需的纯化量。例如，意欲用于在预期施用于人的治疗组合物中使用的分离的蛋白质通常必须具有依照管理标准和良好制造过程的高纯度。
[0044]如本文使用的，在多肽背景中的术语“衍生物”指包含已通过氨基酸残基置换、缺失或添加的引入而改变的氨基酸序列的多肽。如本文使用的术语“衍生物”还指即通过任何类型的分子与多肽的共价附着已进行修饰的多肽。例如，但不限于，多肽可以例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化，蛋白酶解切害I]、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进行修饰。衍生多肽可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行产生，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。进一步地，衍生多肽可以含有一个或多个非典型氨基酸。多肽衍生物具有与它由其衍生的多肽相似或等同的功能。如提及“衍生”自生物体的多肽使用的术语“衍生的”还可以指多肽直接从所述生物体(例如细菌细胞或噬菌体)中的分离。
[0045]如本文使用的，术语“宿主细胞”指由核酸分子转染的具体主题细胞和含有核酸分子或其染色体整合形式的此类细胞的后代或潜在后代。由于在后续代中或在核酸分子整合到宿主细胞基因组内可能发生的突变或环境影响，此类细胞的后代可以不等同于由核酸分子转染的亲本细胞。对于细菌噬菌体蛋白质和多肽的表达，宿主细胞优选不是细菌噬菌体由其分离或培养的相同物种或菌株。
[0046]如本文使用的，术语“与……组合”指超过一种预防和/或治疗剂的使用。术语“与……组合”的使用不限制其中预防和/或治疗剂施用于具有疾病或病症的受试者的次序。第一种预防或治疗剂可以在第二种预防或治疗剂(不同于第一种预防或治疗剂)施用于有此需要的受试者例如具有疾病或病症的受试者之前(例如前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、I小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、I周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、I小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、I周、2周、3
周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。
[0047]如本文使用的，术语“核酸”和“核苷酸序列”包括单链和双链DNA和/或RNA分子，或其组合。如本文使用的，术语“由核酸编码”指使用如本领域众所周知的标准遗传密码(即标准密码子三联体)，起因于参考核酸序列的正向、反向、互补或反向互补序列翻译的氨基酸序列。
[0048]如本文使用的，术语“预防剂”指本发明的细菌噬菌体和/或多肽，其可以用于预防、治疗、管理或改善疾病或病症特别是与细菌感染相关的疾病或病症的一种或多种症状。
[0049]如本文使用的，术语“治疗剂”指本发明的细菌噬菌体和/或多肽，其可以用于预防、治疗、管理或改善疾病或病症特别是与细菌感染相关的疾病或病症的一种或多种症状。 [0050]如本文使用的，术语“治疗有效量”指足以导致疾病或病症特别是与细菌感染相关的疾病或病症的一种或多种症状改善的治疗剂的量。
[0051]如本文使用的，术语“治疗”和“处理”指疾病或病症特别是与细菌感染相关的疾病或病症的一种或多种症状的改善，其起因于本发明的一种或多种细菌噬菌体和/或多肽的施用。如上所述，“治疗”和相关术语指治疗性处理和预防性或预防措施，其中目的是消除、减轻、减少病理状态或病症的严重性，减慢病理状态或病症的进展，或延迟或预防与病理状态或病症相关的症状或潜在原因(例如细菌感染)。
[0052]如本文使用的，关于细菌噬菌体、分离的细菌噬菌体蛋白质(或其变体、衍生物或片段)或细菌噬菌体产物的术语“抗菌活性”和“抗微生物活性”可互换使用，以指杀死和/或抑制微生物特别是细菌噬菌体感染的细菌物种或菌株的生长或繁殖的能力。在特定实施方案中，抗菌或抗微生物活性通过下述进行评估:根据标准技术(例如在液体培养中或在琼脂平板上)培养细菌例如革兰氏阳性菌(例如金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(例如肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌)或未分类为革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌，使培养物与本发明的细菌噬菌体或多肽接触且监控在所述接触后的细胞生长。例如，在液体培养中，细菌可以生长至代表在培养物的指数生长中点的光密度(“0D”)；使培养物暴露于本发明的一种或多种细菌噬菌体或多肽的一个或多个浓度，并且OD相对于对照培养物进行监控。相对于对照培养物减少的OD代表显示出抗菌活性(例如显示出裂解杀死活性)的细菌噬菌体或多肽。类似地，可以允许细菌菌落在琼脂平板上形成，所述平板暴露于本发明的细菌噬菌体或多肽，并且关于对照平板估计菌落的后续生长。菌落的大小减少或菌落的总数目减少指示细菌噬菌体或多肽具有抗菌活性。
[0053]如本文使用的，“CHAP结构域”指在几个噬菌体编码的肽聚糖水解酶中发现的保守酰胺酶结构域，并且代表“半胱氨酸、组氨酸依赖性酰胺基水解酶/肽酶”。参见例如，RigdenD，等人，Trends Biochem Sc1.2003 May 28(5):230_4。它在包括GSP酰胺酶和肽聚糖水解酶的酰胺酶超家族中发现。该家族包括至少两个不同类型的肽聚糖切割活性:L-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶和D-丙氨酰-甘氨酰内肽酶活性。CHAP结构域一般含有保守的半胱氨酸和组氨酸残基，并且水解含Y-谷氨酰底物。这些半胱氨酸残基被认为是这些酰胺酶中的几种的活性所必需的，并且它们的巯基看起来充当含有这个结构域的所有酶的催化机制中的亲核试剂。CHAP结构域通常与其他结构域结合发现，所述其他结构域切割肽聚糖，例如以协同方式起作用以切割专门底物。还参见，Bateman A,等人,Trends Biochem Sc1.2003May 28(5): 234-7。
[0054]6.附图简述
[0055]图1A-1B:包含SEQ ID NO:1的核酸序列的F391/08基因组的组构的图示。在约113kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图2中。
[0056]图2A-2I1:细菌噬菌体F391/08基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了⑴其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图2中列出的ORF 1-172分别编码SEQ ID NO:5-176的氨基酸序列。
[0057]图3:包含SEQ ID NO:2的核酸序列的F394/08基因组的组构的图示。在约31kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同 源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图4中。
[0058]图4A-4K:细菌噬菌体F394/08基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了⑴其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图4中列出的ORF 1-47分别编码SEQ ID NO: 177-223的氨基酸序列。
[0059]图5A-5B:包含SEQ ID NO:3的核酸序列的F488/08基因组的组构的图示。在约167kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图6中。
[0060]图6A-6DDD:细菌噬菌体F488/08基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了(i)其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图6中列出的ORF 1-283分别编码SEQ ID NO:224-506的氨基酸序列。
[0061]图7:包含SEQ ID NO:4的核酸序列的F510/08基因组的组构的图示。在约43kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图8中。
[0062]图8A-8S:细菌噬菌体F510/08基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了⑴其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图8中列出的ORF 1-53分别编码SEQ ID NO:507-559的氨基酸序列。
[0063]图9:包含SEQ ID NO:560的核酸序列的F44/10基因组的组构的图示。在约137kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图10中。
[0064]图10A-10QQ:细菌噬菌体F44/10基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了(i)其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图10中列出的ORF 1-216包括ORF la、lb、82a、82b、82c、114a和114b分别编码SEQ ID NO =561-780的氨基酸序列。
[0065]图11:包含SEQ ID NO:781的核酸序列的F387/08基因组的组构的图示。在约167kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性 的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图12中。
[0066]图12A-12AZ:细菌噬菌体F387/08基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了(i)其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在图12中列出的ORF 1-292分别编码SEQ ID NOs =782-1073的氨基酸序列。
[0067]图13A-13B:包含SEQ ID NO:1074的核酸序列的F125/10基因组的组构的图示。在约145kb基因组中预测的开放读码框(“0RF”)由箭头代表且以黑色编号。箭头的方向指示转录方向。颜色编码:黑色-基于同源蛋白质的已知功能可以对于其产物作出功能指定的ORF ;灰色-编码类似于功能未知的蛋白质的产物的ORF ;空白-编码与可获得的数据库中的蛋白质不共享显著同源性的蛋白质的0RF。功能指定的ORF也在该图中列出。该图中的信息也以表格形式包括在图14A-14ZZZ中。
[0068]图14A-14ZZZ:细菌噬菌体F125/10基因组的特征，包括基因产物和假定功能的指定。该图包括基因组的ORF列表且为每个ORF提供了(i)其在基因组内的位置，(ii)编码的氨基酸序列，(iii)同源蛋白质和在其编码多肽内的保守结构域的列表和(iv)假定功能的指定。在该图中列出的ORF lb-221, la，包括36a和36b、68a和68b、以及153a和153b,分别编码SEQ ID NO =1075-1300的氨基酸序列。
[0069]图15A-15II1:细菌噬菌体F391/08的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0070]图16A-16Q:细菌噬菌体F394/08的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。[0071]图17A-17KKKK:细菌噬菌体F488/08的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
[0072]图18A-18X:细菌噬菌体F510/08的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0073]图19A-19UUU:细菌噬菌体F44/10的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:560)。
[0074]图20A-20KKKK:细菌噬菌体F387/08的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:781)。
[0075]图21A-21ZZZ:细菌噬菌体F125/10的基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:1074)。
[0076]6.1 详述
[0077]本发明涉及分离的细菌噬菌体及其分离的多肽产物，其具有针对医院病原体肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的一个或多个物种或菌株的抗菌活性。在一个实施方案中，提供了分离的细菌噬菌体或多肽，其显示出针对金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株(MRSA)的抗微生物和/或抗菌活性。此外，本发明的细菌噬菌体和多肽可以显示出针对致病菌的一个或多个物种或菌株的抗菌或抗微生物活性，所述致病菌包括但不限于表皮葡萄球菌、耳葡萄球菌、头葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、木糖葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、希拉肠球菌和鸟肠球菌。
[0078] 在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由SEQ IDN0:1的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体。依照这个实施方案的特定例子是分离的细菌噬菌体F391/08，其靶向克雷伯氏菌属物种的许多菌株，包括肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌(K.0xytoca)。包含SEQ ID NO:1的核酸序列的F391/08基因组的图示组构在图1中提供。F391/08基因组中的开放读码框(ORF)在图2中提供。还提供的是ORF在基因组内的位置，由ORF编码的氨基酸序列，同源或相似蛋白质和在编码多肽内的保守结构域，和假定功能的指定。在图2中列出的ORF 1-172分别编码SEQ ID NO:5-176的氨基酸序列。
[0079]在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO:781的核酸序列或由SEQID NO:781的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体。依照这个实施方案的特定例子是分离的细菌噬菌体F387/08，其靶向克雷伯氏菌属物种的许多菌株，包括肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌。包含SEQ ID NO:781的核酸序列的F387/08基因组的图示组构在图11中提供。F387/08基因组中的开放读码框(ORF)在图12中提供。还提供的是ORF在基因组内的位置，由ORF编码的氨基酸序列，同源或相似蛋白质和在编码多肽内的保守结构域，和假定功能的指定。在图12中列出的ORF 1-292分别编码SEQ ID NOs:782-1073的氨基酸序列。
[0080]肺炎克雷伯氏菌是在口、皮肤和小肠的正常菌丛中发现的革兰氏阴性、无运动、杆状细菌。作为有荚膜的、兼性厌氧菌，该细菌还天然存在于土壤中，并且约30%的菌株可以在厌氧条件下固定氮。临床上,它是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的克雷伯氏菌属的最重要成员，并且还与产酸克雷伯氏菌紧密相关。克雷伯氏菌属感染趋于在由于不适当饮食具有减弱的免疫系统的人中例如在酗酒者和糖尿病患者中发生。克雷伯氏菌属还是关于具有慢性肺病、肠致病性、鼻腔粘膜萎缩和鼻硬结病的患者中的机会病原体。肺炎克雷伯氏菌的新抗生素抗性菌株出现，并且它越来越多地发现作为医院内感染，例如由于与污染器械接触。
[0081]在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO:2的核酸序列或由SEQ IDN0:2的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体。依照这个实施方案的特定例子是分离的细菌噬菌体F394/08，其靶向不动杆菌属物种的许多菌株，包括鲍氏不动杆菌、乙酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)和鲁氏不动杆菌(A.1woffi)。包含SEQ ID NO:2的核酸序列的F394/08基因组的图示组构在图3中提供。F394/08基因组中的开放读码框(ORF)在图4中提供。还提供的是ORF在基因组内的位置，由ORF编码的氨基酸序列，同源或相似蛋白质和在编码多肽内的保守结构域，和假定功能的指定。在图4中列出的ORF 1-47分别编码SEQID NOs =177-223的氨基酸序列。
[0082]鲍氏不动杆菌是特别在具有妥协的免疫系统的个体中引起许多严重临床感染的细菌物种。鲍氏不动杆菌是通常从医院环境和住院患者中分离的多形好氧革兰氏阴性杆状细菌。该细菌通常进入身体开放性伤口、导管或呼吸管。鲍氏不动杆菌通常定殖水生环境，并且通常由住院患者的唾液或呼吸分泌物、伤口和尿培养。在医院背景中，鲍氏不动杆菌通常定殖灌洗液和静脉内溶液。还已知它对多种抗生素有抗性，并且由鲍氏不动杆菌引起的医院内感染数目近年来已增加。
[0083]在某些实施方案中，本发明提供了具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或由SEQ IDN0:3的核酸序列组成的基因组的细菌噬菌体。依照这个实施方案的特定例子是分离的细菌噬菌体F488/08，其靶向埃希杆菌属物种的许多菌株，包括大肠杆菌。包含SEQ ID NO:3的核酸序列的F488/08基因组的图示组构在图5中提供。F488/08基因组中的开放读码框(ORF)在图6中提供。还提供的是ORF在基因组内的位置，由ORF编码的氨基酸序列，同源或相似蛋白质和在编码多肽内的保守结构域，和假定功能的指定。在图6中列出的ORF1-283分别编码SEQ ID NOs =224-506的氨基酸序列。
[0084]大肠杆菌是通常在哺乳动物的下部肠中发现的革兰氏阴性杆状细菌，其包含人胃肠道的primaru兼性厌氧菌。大多数大肠杆菌菌株是无害的并且可以形成肠的正常菌丛的部分，在其中它们可以例如通过产生维生素K2和/或通过防止致病菌在肠内定居对其宿主有利。然而，大肠杆菌的特定有毒菌株可以引起食物中毒，一般表现为腹泻发作。更有毒的菌株例如0157:H7可以在老人、非常年幼或免疫妥协的人中引起严重疾病和甚至死亡。菌株例如0157:H7以及0121和0104:H21潜在产生致死毒素。大肠杆菌的有毒菌株还可以引起胃肠炎、泌尿道感染和新生儿脑膜炎，以及在稀有病例中，溶血性-尿毒症综合征(HUS)、腹膜炎、乳腺炎、败血病和革兰氏阴性肺炎。进一步地，如果大肠杆菌细菌通过穿孔(例如由于破裂的盲肠和溃疡或手术错误)逃出肠道且进入腹