专利名称：一种抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的一类。抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭细菌、真菌、螺旋体、支原体、衣原体等致病微生物的作用，故能治病。还有的抗生素可治疗恶性肿瘤。抗生素类药物广泛地应用于各种感染性疾病，其品种繁多。在临床上过量地使用传统抗生素已经产生许多医学上相关抗药性菌种。然而，在过去的四十年中，只有三种在结构上创新的抗生素被投入到临床实践中(恶唑烷酮类的利奈唑胺、链霉杀阳菌素和脂肽_达托霉素)，因此研发新类型抗生素具有重要意义。阳离子抗菌肽可以代表一类新型的抗生素，虽然阳离子抗菌肽的作用模式尚未完全确定，但所有的阳离子两亲性抗菌肽都会与细胞膜相互作用，细胞膜是抗菌肽的主要靶点，抗菌肽分子在细胞膜上的聚集会导致通透性的增加并使细胞膜丧失其屏障功能。产生这种抗药性需要对微生物细胞膜脂成分的实质性改变，因此，针对这些膜活性的抗菌肽产生抗药性是几乎不可能的。α _螺旋型和β _折叠型抗菌肽是最主要的两大类阳离子抗菌肽。β -折叠型抗菌肽包括由分子内二硫键固定的环形多肽，例如防卫素和保护素，以及具有N末端到C末端的共价键的多肽，例如短杆菌肽S和短杆菌酪肽。与折叠型抗菌肽不同，α-螺旋型抗菌肽是更加线性的分子，其在水介质中以无序结构存在，但它们通过与疏水细胞膜相互作用， 呈两亲螺旋状态，例如蛾血素，马加宁和蜂毒肽。目前人类发现的抗菌肽大多数由生物体直接提纯得来的，例如由蟾蜍表皮得到的蟾蜍肽(Magainin)、蜜蜂体内得到的蜂毒肽(Melittin)等，这些多肽均由L-型氨基酸组成。生物体直接得来的抗菌肽具有对其它生物体的排他性，因此很难直接应用在人体上，即这一类的抗菌肽对人体有很强的毒性，有很多抗菌肽正是因为毒性原因，无法实现成为药品的目标。同时，某些L-型氨基酸所构成的多肽进入体内后容易被蛋白酶降解而失活，因而起效作用受到严重限制。
本发明通过多肽固相合成的技术合成了可以用作抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的抗药性问题，解决顽固感染对广大患者造成的痛苦。本发明中的抗菌肽可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案本发明所述的可以用作抗微生物制剂的多肽，其氨基酸的序列为Ac-Phe-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Ser-Lys-Leu-Trp-Asn-Trp-Lys-NH2(SEQ ID No. 1)；包括L-型(命名为PL-13)和D-型(命名为PL-18)对映异构体。优选的是所述抗菌肽氨基酸序列中的Leu由lie，Val，正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。 优选是所述抗菌肽氨基酸序列中的Phe由Trp，Tyr, Leu, lie, Val，正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。优选是所述抗菌肽氨基酸序列中的Trp由Phe，Tyr，Leu，Ile，Val，正亮氨酸，正缬氨酸中任一氨基酸残基取代。优选的是所述的抗菌肽包括全L-型和全D-型对映异构体；或者所述的抗菌肽任意一个或几个氨基酸用L-型或D-型氨基酸取代。优选的是所述抗菌肽序列中以不同方式取代其中某些氨基酸或延长多肽序列及截短多肽序列的方式以所得的具有85-100%氨基酸相似的序列及其的相关化合物。本发明还提供了一种多肽固相合成前一发明技术方案所述抗菌肽的方法，包括步骤1)由酰胺类树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联试剂和有机碱为起始原料，在保护的有机溶剂中反应得到Fmoc保护氨基酸_酰胺类树脂偶联物；2)采用固相法偶联逐一偶联依次连接具有保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护线性肽；3)多肽N末端的最后一个氨基酸连接到树脂上之后，脱去其Fmoc保护，进行适当的化学修饰；4)加入剪切试剂，将多肽从树脂上剪切下来，真空冷冻干燥得到多肽的粗品。优选的是采用C4，或C8，或C18反相色谱柱，利用高效液相色谱方法进行AB线性洗脱制备纯品肽，洗脱速度为0. 5 5ml/min ；其中，A流动相为含有0. 01-0. 5% TFA的水溶液，B流动相为含有0. 01-0. 5% TFA的乙腈。更优的是制备得到的纯品肽采用分析型反相高效液相色谱RP-HPLC按照下述方法进行分析采用c4，或C8,或C18柱，进行AB线性洗脱制备纯品肽，洗脱速度为0. 1 5ml/ min ；其中，A流动相为含有0. 01-0. 5% TFA的水溶液，B流动相为含有0. 01-0. 5% TFA的乙腈。本发明所述的抗菌肽可以用于制备控制微生物感染的治疗药物组合物，如抗菌剂等。如制备成抗菌剂，所述抗菌剂中抗菌肽的剂量范围为注射剂0. l-50mg/kg; 口服剂 0. l-50mg/kg ；外用剂 1/10000-10% / 支；滴眼剂 1/10000-10% / 支；洗剂 1/10000-1% /支。本发明所述的抗菌肽具有抗菌活性，可以杀死细菌、真菌、病毒和原生动物。这些抗菌肽总体上对任何具有细胞膜或脂双层膜组分的生物体均有作用。可以用作人类药物和 /或牲畜药物、兽用药物或者作为农业、食品及工业上有效的化合物试剂。本发明经过对天然的及人工合成的抗菌肽的构效关系研究，我们发现抗菌肽的一些物理特性对于其抗菌活性是至关重要的。这些特性包括在温和pH值下带有适宜的电荷数，同时存在疏水残基与碱性残基，将疏水残基与碱性残基分开的两亲性，可诱导的或预先形成的二级结构(α “螺旋或β _折叠)。本发明还提供了一种抗菌肽，抗菌肽氨基酸序列中包括Ac-Phe-Lys-Lys-Leu-Lys -Lys-Leu-Phe-Ser-Lys-Leu-Trp-Asn-Trp-Lys-NH2 (SEQ ID No. 1)氨基酸序列。本发明还提供了一种治疗微生物感染的方法，即对患者给予本发明的抗菌肽化合物进行治疗。在临床实践中，微生物感染包括细菌、病毒、真菌或原生动物的一种或多种病原体所引起的感染。例如，两种不同的细菌同时引起的感染等。然而，临床检测是哪种感染的过程及确定治疗方案，相对繁琐。本发明的目的是通过一种给药方式(抗菌肽)，治疗复杂型及耐药型病原体感染。本发明中利用多肽固相从头设计的技术，合成得到了 PL-13及其类似物。这些多肽具有非常强的抗细菌和真菌活性，同时对人体细胞毒性很低。序列组成上，这些多肽与 PL-13的氨基酸同源性在85%以上(可由13-17个同源氨基酸组成，详见实施例1中序列信息表)O本发明所述的多肽分子在疏水环境中呈一定的二级结构(例如螺旋结构)。我们已经利用圆二色谱(CD)监测了抗菌肽分子在50%三氟乙醇(细胞膜疏水环境的模拟)中的α-螺旋结构。 本发明优选的抗菌肽是具有潜在的生物学活性的螺旋类似物，通过圆二色谱检测，该抗菌肽在温和环境中(非变性介质，如含有IOOmM氯化钾，ρΗ7的50mM磷酸缓冲液) 具有很少的α-螺旋结构。该结构特征可能对抗菌肽活性机理有重要意义，例如a)降低在温和环境中形成聚合体的能力，即自我相互作用能力；b)允许抗菌肽分子更容易穿过细胞壁到达微生物的细胞膜。并且，在温和环境中对α-螺旋结构的破坏，不会对抗菌肽(正电性)与微生物的细胞壁(负电性)的静电吸引作用产生影响；然而，特定结构的缺少可以降低细胞壁表面对抗菌肽的亲和作用(细胞壁中的疏水基团与多肽疏水面的疏水相互作用)，从而允许抗菌肽更易于通过细胞壁，进入到细胞膜的亲/疏水的临界面，在该区域抗菌肽与膜表面呈平行状态。在膜内，抗菌肽可以被细胞膜的疏水环境诱导成α-螺旋结构。由于此α-螺旋结构，我们猜测抗菌肽的非极性面可以和细胞膜的疏水部分相互作用， 而其极性面上的极性基团和带正电的基团可以和细胞膜表面上磷脂极性头部(负电性)相互作用。当抗菌肽呈α -螺旋结构时，抗菌肽分子呈现带净正电和两亲性。例如，α -螺旋型抗菌肽在分子的一侧有非极性或疏水表面，在分子另一侧有极性或者带正电荷的表面， 即两亲性分子。通过高效液相色谱反相柱RP-HPLC的温度监控技术，在5°C 80°C的范围内，对一些抗菌肽类似物在溶液中的自我相互作用的能力进行评估。抗菌肽的自我相互作用能力是衡量其抗菌活性与溶血活性的另一个重要指标。一般来说，在溶液中的高自我相互作用能力与抗菌肽较低的抗菌活性和较强的溶血活性直接相关。生物学研究表明抗菌肽强的溶血活性一般与高疏水性、高两亲性及高螺旋性呈正相关。多数情况下，带有D-型氨基酸取代的抗菌肽具有比L-型异构体更强的抗菌活性。通过利用一系列选定的D-或者L-型氨基酸替换在这些两亲分子的非极性和极性面上的疏水或者亲水的氨基酸残基，我们进一步证实了本方法可以用来合理设计具有增强的活性的抗菌肽。本发明优选多肽PL-13以及其D型对映体多肽PL-18，其含有下面氨基酸序列。表1多肽及其氨基酸序列^肽名称ι产品序列I单字母序列
^ wi τ>χ, τ τ τ τ τ τAc-Fl-Kl-Kl-Ll-Kl-Kl-Ll-
PL-13 乙酰-Phe-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu- ^ Fl.Sl_Kl.Ll.Wl.Nl.Wl_Kl
Phe-Ser-Lys-Leu-Trp-Asn-Trp-Lys-酰胺
-NH2
D-乙酰-Phe-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu- AC F°
PL·18 Phe-Ser-Lys-Leu-Trp-Asn-Trp-Lys-酰胺 d^d ^-Kd-Ld-Wd-Nd-Wd
-JVD-NH2这里，单字母表中氨基酸后面的下标字母D代表该氨基酸是D-型氨基酸；与此相同的，下标L代表该氨基酸是L-型氨基酸。在抗菌肽名称中，大写字母D-(非下标)表示除特指位点外，该抗菌肽全部由D-型氨基酸所组成。Ac表示多肽的N端被乙酰化，NH2表示C端酰胺化。上述抗菌肽及其组合物可以制备为任何一种医学上可用的生物载体或制剂形式给予感染疾病患者。本发明原料药优选制剂剂量范围是0. 01-50mg重量份。制备本发明注射制剂常用辅料包括乙二胺四乙酸二钠、吐温80、甘露醇、甘油、
丙二醇。制备本发明口服固体制剂常用的辅料包括微晶纤维素、低取代_羟丙基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶、淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉等。制备本发明外用制剂所述常用辅料包括甘露醇、聚山梨酯-80、聚乙二醇、硬脂酸聚烃氧酯、甘油、卡波姆、三乙醇胺、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、酒石酸、碳酸氢钠、聚乙烯醇、 苯甲酸钠、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素等。制备本发明口服液体制剂辅料包括乙醇、羟苯乙酯、羟苯甲酯、聚山梨酯-80、苯甲酸钠、山梨酸、蜂蜜、蔗糖、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸、硫脲、乙二胺四乙酸二钠、 磷酸、枸橼酸、甘油、乳糖等。上述原料组分可与一定比例的常用药用辅料相配，按照本领域常规方法可制成包含注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、滴眼剂、喷雾剂、气雾剂、 贴剂、涂膜剂、洗剂中的一种。常用剂型制备处方和工艺参见下述实施例。所述抗菌剂中抗菌肽的剂量范围为注射剂0. l-50mg/kg ； 口服剂0. l_50mg/kg ； 外用剂 1/10000-10% / 支；滴眼剂 1/10000-10% / 支；洗剂 1/100000-1% / 支。


图1为PL-13的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网示意图。图2为抗菌肽及其类似物的圆二色谱图。图3为抗菌肽及其类似物反相高效液相色谱温度曲线。

图4为抗菌肽及其类似物的反相高效液相色谱温度曲线的校正曲线。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1衍生自PL-12的相关抗菌肽序列信息 多肽PL-12是由15个氨基酸残基所组成，序列为Ac-FKRLEKLFSKIWNWK_NH2，具有一个极性表面和一个非极性表面的两亲性α -螺旋型抗菌肽，在本研究中作为模板多肽。 它的极性表面由7个亲水氨基酸(3个赖氨酸、1个精氨酸、1个谷氨酸、1个丝氨酸、1个天冬酰胺)和1个疏水氨基酸(1个色氨酸)组成。相比之下，其非极性表面含有6个疏水氨基酸(2个亮氨酸、1个异亮氨酸、2个苯丙氨酸、1个色氨酸)和1个亲水氨基酸(1个赖氨酸)组成。通过氨基酸取代，我们得到了系列PL-13多肽类似物(附图1)，图1表明在本发明中优选多肽PL-13的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网的图形。带四方框的氨基酸残基表示位于螺旋的非极性/疏水表面氨基酸，带圆圈的氨基酸表示位于非极性/疏水表面上的亲水氨基酸残基，六方形框中的氨基酸表示位于亲水面上的疏水氨基酸。在螺旋轮中，亲水表面用空心的弓形表示，疏水表面用实心的弓形表示。Ac指N端乙酰化，NH2指C端酰胺化。 氨基酸残基用单字母编码表示并以此为基础进行进一步改造，得到了一组活性基本一致的相关抗菌多肽。多肽PL-12，PL-13全部是由L-型氨基酸组成，我们设计了对映异构体多肽 PL-17，PL-18(PL-17，PL-18全部由D-型氨基酸组成)。因此，PL-17，PL-18在立体化学上与相应的PL-12，PL-13完全相反。PL-23及PL-24为不同带电氨基酸取代形成的多肽类似物之一，通过选择取代 PL-13序列中氨基酸改变带电氨基酸的性能而得到的。选择用于取代的氨基酸优选是带电荷的氨基酸，特别是净电荷为带正电荷的氨基酸。带电荷的氨基酸包括LyS、Arg、0rn、HiS、 二氨基丁酸和二氨基丙酸。Orn具有δ-氨基来替代Lys的ε -氨基，即其侧链减少一个碳原子；二氨基丁酸具有Y氨基，即其比Orn的侧链少一个碳原子；二氨基丙酸比Orn支链少两个碳原子，即具有β氨基。PL-34及PL-35为上述两条多肽的D型对映异构体。PL-25 27为多点取代PL-13形成的多肽类似物。在发明多肽的不同位点进行多点取代形成的多肽(如双取代)能够依然保持活性。对于多点取代形成的特定多肽，这样的在非极性面中心的多点取代至少会与单点取代具有同样的效果。考虑到多肽序列的氨基酸组成，特别是疏水氨基酸在生物活性中的重要性，认为具有与PL-13序列的氨基酸组成 85%以上的相似度的多肽，具有很好的生物学活性。PL-36 38为上述两条多肽的对映异构体。PL-28 30为对多肽的N端和C端的氨基酸进行截取，获得比发明多肽更短的多肽之一，这种去除PL-13 —端或两端1-2个氨基酸而产生的多肽，其氨基酸相似性仍在85 % 以上，从而保持了与PL-13抗菌相当的活性。PL-39 41为上述两条多肽的对映异构体。多肽表面的疏水氨基酸通过疏水相互作用，构成多肽整体疏水面。PL-13的非极性表面上由 Fl, L4，L7，F8，Lll, W14, Κ15 组成。同样，极性表面由 Κ2，Κ3，Κ5，Κ6，S9，Κ10, W12，N13组成。对组成PL-13的氨基酸残基特别是疏水氨基酸进行重组(可以是将非极性表面上疏水氨基酸残基进行重组，将极性表面上的极性氨基酸残基进行重组，或在极性表面及非极性表面进行氨基酸残基的重组而不会实质改变多肽分子的两亲性的组合)组成的多肽仍然具有很好的生物学活性，PL-31 33为部分序列信息(选取了任意2个氨基酸进行位点互换)，这种重组在氨基酸组成同源性中与PL-13保持了 100%的同源性，因而其活性与PL-13抗菌活性相当。PL-42 44为上述两条多肽的对映异构体。表2部分多肽序列信息汇总表


本发明公开了一种抗菌肽及其制备方法和应用，其氨基酸的序列为Ac-Phe-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Ser-Lys-Leu-Trp-Asn-Trp-Lys-NH2(SEQ ID No.1)。本发明通过多肽固相合成的技术合成了可以用作抗微生物制剂的多肽及其相关化合物，解决日益严重的抗药性问题，解决顽固感染对广大患者造成的痛苦。本发明中的抗菌肽可以应用于各种顽固感染性疾病及普通感染，作为现有抗生素的优良替代药物或辅助药物。